陳文霞， 張 培， 高 霞， 白瑞斌， 胡芳弟

（蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅蘭州730000）

硒化紋黨參多糖和其抗A549細(xì)胞的活性

陳文霞， 張 培， 高 霞， 白瑞斌， 胡芳弟*

（蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅蘭州730000）

目的 合成硒化紋黨參多糖并探討其抗人肺腺癌細(xì)胞A549的活性。方法 以HNO3-Na2SeO3方法硒化紋黨參多糖，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、紋黨參多糖與亞硒酸鈉投料比為三因素進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇硒化紋黨參多糖含硒量、產(chǎn)率以及對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率作為考察指標(biāo)，優(yōu)選最佳硒化工藝。結(jié)果紋黨參多糖的最佳硒化條件為反應(yīng)時(shí)間5 h，反應(yīng)溫度60℃，投料比1：1。在此條件下，硒化紋黨參多糖中含硒量可達(dá)1.07mg/g（RSD為3.7%），產(chǎn)率可達(dá)50.3%（RSD為2.5%），對(duì)A549細(xì)胞的抑制率可達(dá)到49.36%（RSD為2.8%）。結(jié)論 硒化紋黨參多糖可以作為抗腫瘤候選藥物。

紋黨參多糖；硒化；正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)；人肺腺癌細(xì)胞A549

硒作為人體必需的微量元素之一，有多種免疫與生物學(xué)功能，尤其是它具有預(yù)防心血管病、抗腫瘤、抗病毒性疾病以及抗衰老等作用［1］。因此，含硒藥物和添加劑等材料成為當(dāng)今許多科研人員的研究熱點(diǎn)。有機(jī)硒化合物具有吸收率高、生物活性強(qiáng)、毒性低、環(huán)境污染小等特點(diǎn)，已成為硒研究的一個(gè)方向［2］。目前，國(guó)內(nèi)外在人工合成有機(jī)硒化合物方面進(jìn)行了探索，合成得到了硒化亞油酸、硒化亞麻酸、硒化卡拉膠、硒化蛋氨酸、肌醇硒酸酯、硒化葡聚糖、硒化茶多酚等有機(jī)硒化合物，并對(duì)其抑制腫瘤的作用進(jìn)行了初步的研究［3］。因此，利用有潛力的生物活性成分和無(wú)機(jī)硒制備具有抑制

腫瘤等作用的有機(jī)硒化合物具有很大的研究意義。

黨參為桔?？浦参稂h參Godonopsis pilosula（Franch.）Nannf.，素花黨參G.pilosula Nannf. var.modesta（Nannf.）L.T.Shen或川黨參G.tangshen Oliv.的干燥根，為我國(guó)傳統(tǒng)的補(bǔ)益藥［4］。紋黨參主產(chǎn)于甘肅文縣，是黨參中的上品，其主要品種為素花黨參［5-6］。紋黨參中糖類的含有量普遍較高［7-8］，且可使正常小鼠脾質(zhì)量增加，胸腺質(zhì)量減輕，并能逆轉(zhuǎn)地塞米松所致免疫受抑小鼠的脾質(zhì)量減輕［9-10］。

以硒多糖作為補(bǔ)硒劑不僅具有合適的穩(wěn)定性和溶出性能，而且釋放出硒后配體多糖不會(huì)對(duì)身體產(chǎn)生毒副作用，還能促進(jìn)金屬離子的吸收和利用［11］。研究證實(shí)，硒多糖的藥理活性普遍高于多糖或硒［12］且更容易被機(jī)體利用［13-15］。但是除了富硒地區(qū)植物中提取的硒多糖量較高外，天然多糖中含硒量極少，遠(yuǎn)不能達(dá)到補(bǔ)硒要求。因此，采用人工合成的方法對(duì)多糖進(jìn)行硒化修飾為解決以上問(wèn)題的途徑之一。

本實(shí)驗(yàn)以紋黨參為原料，提取紋黨參多糖（polysaccharides from G.pilosula，PCP），并通過(guò)正交設(shè)計(jì)方法，對(duì)黨參多糖硒化合成工藝進(jìn)行優(yōu)化。將具有抗癌作用的微量元素硒與活性黨參多糖有機(jī)地結(jié)合起來(lái)，形成硒化紋黨參多糖（polysaccharides from G.pilosula selenide，PCPs），以期獲得既具有強(qiáng)抗腫瘤作用且具有補(bǔ)硒作用的藥物。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑 紋黨參采自甘肅文縣，經(jīng)過(guò)蘭州大學(xué)藥學(xué)院周印所教授鑒定，為素花黨參G.pilosula Nannf.var.modesta（Nannf.）L.T.Shen的干燥根。按文獻(xiàn)方法提取［16］，黨參藥材粉碎至約60目，加95%乙醇脫脂2 h，殘?jiān)?倍量體積的水煎煮3次，每次2 h，合并濾液，加入乙醇使得醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到75%，放置過(guò)夜，離心取沉淀，將沉淀部分冷凍干燥得紋黨參粗多糖（CPP）。

硒粉、亞硒酸鈉 （天津市化學(xué)儀器研究所）、硝酸 （優(yōu)級(jí)純）、鹽酸 （優(yōu)級(jí)純）、過(guò)氧化氫（30%、優(yōu)級(jí)純）。MTT（Amresco Co，美國(guó)）、胰酶（Trypsin 0.25%Solution）、DMEM、新生胎牛血清 （上海創(chuàng)賽）。

人肺腺癌細(xì)胞A549、人胃腺癌細(xì)胞BGC-823，人宮頸癌細(xì)胞HeLa以及人肝癌細(xì)胞HepG2由蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院提供。細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清，1%雙抗的完全培養(yǎng)基中，環(huán)境溫度37℃，濕度95%，含5%CO2。

1.2 儀器與設(shè)備 DF-101集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鄭州長(zhǎng)城科工有限公司）、Bio-Rad酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）、GI54TR高壓滅菌鍋（廈門致微儀器有限公司）、SW-CJ-1D型超凈工作臺(tái)（蘇州蘇泰凈化設(shè)備工程有限公司）、Memmert型二氧化碳培養(yǎng)箱 （北京五洲東方科技發(fā)展有限公司）、AFS-9800原子熒光光度計(jì) （北京科創(chuàng)海光儀器有限公司）、WX-8000型微波消解系統(tǒng) （上海屹堯儀器科技發(fā)展有限公司）、UV-1700紫外分光光度計(jì) （日本島津公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 （Eyela，日本東京理化）、恒溫水浴箱 （上海一恒儀器有限公司）、冷凍干燥機(jī) （美國(guó)Labconco公司）、電子自動(dòng)分析天平（德國(guó)Sartorius公司）、恒溫電熱板（北京科偉永興儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 單因素試驗(yàn) 影響硒化多糖的含硒量及產(chǎn)率的因素很多，包括反應(yīng)溫度、加Na2SeO3的量、反應(yīng)時(shí)間、BaCl2添加量和HNO3的百分含有量等。硒化反應(yīng)過(guò)程如下：稱取100 mg紋黨參多糖于三口燒瓶中，緩慢滴加稀HNO320 mL，邊加邊攪拌，使之完全溶解，加入一定量BaCl2，加Na2SeO30.08 g于70℃下攪拌反應(yīng)7 h，反應(yīng)液冷卻后過(guò)濾，無(wú)水Na2CO3調(diào)pH為5～6，加入適量Na2SO3除Ba2+，離心，上清液濃縮后，流水透析2 d，蒸餾水透析1 d，透析液冷凍干燥，得硒化紋黨參多糖（PCPs）。

1.3.1.1 BaCl2添加量對(duì)多糖硒化過(guò)程影響 硝酸百分含量固定為0.8%，考察加入不同量BaCl2（0、0.1、0.125、0.15、0.175 g）對(duì)反應(yīng)所得的硒化多糖的得率及含硒量的影響。

1.3.1.2 HNO3的百分含量對(duì)多糖硒化過(guò)程的影響 BaCl2的加入量固定為0.1 g，考察加入20 mL不同百分含量的HNO3（0%、0.5%、0.8%、1.0%、1.5%，0%的硝酸以雙蒸水代替）對(duì)反應(yīng)所得硒化多糖的得率及含硒量的影響。

1.3.2 正交試驗(yàn) 因在硒化反應(yīng)中溫度，反應(yīng)時(shí)間以及Na2SeO3的加入量對(duì)硒化多糖的產(chǎn)率和含硒量影響較大［17］，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上將反應(yīng)時(shí)間 （A），反應(yīng)溫度 （B），投料質(zhì)量比例 （C）為三因素進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化條件，因素水平見(jiàn)表1。按“1.3.1”項(xiàng)方法反應(yīng)得到9個(gè)硒化紋黨參多糖，命名為“PCPs1～PCPs9”，試驗(yàn)結(jié)果以含硒量、硒化多糖產(chǎn)率以及硒化多糖對(duì)A549細(xì)胞的抑制率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

表1 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平Tab.1 Factor IeveIs of orthogonaIdesign test

1.3.3 硒化紋黨參多糖中含硒量的測(cè)定 稱取2 mg硒化紋黨參多糖于聚四氟乙烯管中，加入5 mL濃HNO3和1 mL 30%的H2O2，微波消解，消解程序如下：120℃下1 min，150℃下3 min，200℃下5 min，消化結(jié)束后，冷卻至室溫。轉(zhuǎn)移溶液至錐形瓶中，并用電熱板加熱至干，及時(shí)加入5 mL濃HCl，當(dāng)溶液變清澈并伴有白煙時(shí)，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶，并用含5%HCl的蒸餾水定容到25 mL進(jìn)原子熒光光度計(jì)測(cè)定。

1.4 硒化紋黨參多糖的抗腫瘤試驗(yàn) 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺腺癌細(xì)胞A549，用胰酶消化，吹打均勻，調(diào)細(xì)胞密度為5×104個(gè)/mL，接種于96孔培養(yǎng)板。每孔100μL，培養(yǎng)至貼壁后加入100μL用無(wú)血清培養(yǎng)基配制的CPP和CPPs，使其終質(zhì)量濃度為25、50、100、200μg/m L，設(shè)4個(gè)平行孔。調(diào)零孔不加細(xì)胞懸液，不加藥，只加培養(yǎng)液200μL，對(duì)照孔不加藥，只加100μL細(xì)胞懸液和100μL培養(yǎng)液，置37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后每孔加入5 mg/mL的MTT 20μL，同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)。每孔加入150μL DMSO，震蕩10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光值。選擇測(cè)定波長(zhǎng)570 nm，按下面公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。

1.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 按照上述實(shí)驗(yàn)中得到的最佳條件平行制備硒化紋黨參3份，計(jì)算硒化紋黨參的產(chǎn)量和含硒量。硒化紋黨參的抗腫瘤活性通過(guò)其對(duì)肺癌A549細(xì)胞，胃癌BGC-823，宮頸癌HeLa細(xì)胞和肝癌HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率來(lái)驗(yàn)證。細(xì)胞培養(yǎng)和抑制率測(cè)定方法同 “1.4”項(xiàng)，以相應(yīng)質(zhì)量濃度的紋黨參多糖作為對(duì)照。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn) 如圖1所示，當(dāng)硝酸體積分?jǐn)?shù)為0.8%固定不變，氯化鋇為0.1 g時(shí)，硒化紋黨參多糖的產(chǎn)率和含硒量都達(dá)到了峰值，氯化鋇超過(guò)0.1 g后產(chǎn)率和含硒量開(kāi)始下降。當(dāng)BaCl2用量為0.1 g固定不變時(shí)，硒化紋黨參多糖產(chǎn)率和含硒量在HNO3體積分?jǐn)?shù)為1.0%時(shí)達(dá)到最大值。因此，當(dāng)黨參多糖量為100 mg時(shí)，選擇BaCl2加入量和HNO3的體積分?jǐn)?shù)分別為0.1 g、1.0%。

圖1 硒化紋黨參多糖的單因素試驗(yàn)Fig.1 SingIe factor test for PCPs

2.2 正交試驗(yàn) 表2為正交試驗(yàn)所得到的9個(gè)硒化紋黨參多糖產(chǎn)率和含硒量，以及硒化紋黨參多糖在200μg/m L時(shí)對(duì)A549細(xì)胞的抑制率。由結(jié)果可知，各因素對(duì)硒化多糖含硒量影響的主次順序?yàn)锽＞A＞C，即反應(yīng)溫度＞反應(yīng)時(shí)間＞投料比，各因素的最佳水平為A3B1C3，最佳硒化條件為反應(yīng)時(shí)間9.0 h，反應(yīng)溫度為60℃，投料比為2：2，此時(shí)最大含硒量為1.23 mg/g。各因素對(duì)硒化紋黨參多糖產(chǎn)率影響的主次順序?yàn)镃＞B＞A，即投料比＞反應(yīng)溫度＞反應(yīng)時(shí)間，各因素的最佳水平A2B1C3，即最佳硒化條件為反應(yīng)時(shí)間7.0 h，反應(yīng)溫度為60℃，投料比為2：2。各因素引起的硒化多糖對(duì)A549腫瘤細(xì)胞的影響主次順序?yàn)镃＞B＞A，即投料比＞反應(yīng)溫度＞反應(yīng)時(shí)間，各因素的最佳水平A1B1C3，即最佳硒化條件反應(yīng)時(shí)間5.0 h，反應(yīng)溫度為60℃，投料比為2：2。正交試驗(yàn)結(jié)果

表明，反應(yīng)溫度60℃，投料比2：2為影響硒化紋 黨參多糖含硒量、產(chǎn)率以及抑制率的最佳條件。

表2 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Resu It of or thogonaIdesign test

2.3 方差分析 表3～表5為硒化紋黨參多糖含硒量、產(chǎn)率以及硒化紋黨參多糖在200μg/mL時(shí)對(duì)A549細(xì)胞抑制率的方差分析。由表3可知，反應(yīng)溫度對(duì)硒化紋黨參多糖含硒量有顯著影響，反應(yīng)時(shí)間和投料比影響不顯著。由表4可知，投料比對(duì)硒多糖產(chǎn)率有顯著影響，反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度影響不顯著。由表5可知，反應(yīng)溫度和投料比對(duì)硒化多糖的抗腫瘤活性影響極顯著，反應(yīng)時(shí)間影響顯著。由于反應(yīng)時(shí)間對(duì)含硒量和產(chǎn)率均無(wú)顯著影響，而對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制率具有顯著性影響，選擇反應(yīng)時(shí)間適中的5 h。綜合考慮含硒量和硒多糖產(chǎn)率以及硒化多糖的抗腫瘤活性三個(gè)指標(biāo)的正交試驗(yàn)和方差分析結(jié)果，選擇反應(yīng)溫度和投料比三者一致的60℃、2：2，確定最佳組合為反應(yīng)時(shí)間5 h，反應(yīng)溫度60℃，投料比2：2。

表3 含硒量的方差分析Tab.3 ANOVA of seIenium content

表4 產(chǎn)率的方差分析Tab.4 ANOVA of yieId

表5 對(duì)A549細(xì)胞抑制率的方差分析Tab.5 ANOVA of A549 ceIIs inhibition

2.4 紋黨參多糖及硒化紋黨參多糖的抗腫瘤活性比較 如圖2所示，紋黨參多糖經(jīng)硒化反應(yīng)后，對(duì)A549細(xì)胞的抑制率較未硒化多糖均有不同程度的增加。正交試驗(yàn)所得到的 9個(gè)硒化多糖在200 μg/mL劑量時(shí)，對(duì)A549細(xì)胞的抑制率與未硒化多糖相比，除了PCPs2和PCPs9之外均有顯著性差異，硒化后可提高紋黨參多糖對(duì)A549細(xì)胞的抑制活性。

圖2 正交設(shè)計(jì)硒化多糖對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effects of PCPs on A549 ceIIs grow th

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 取100 mg紋黨參多糖，在正交試驗(yàn)所得優(yōu)化條件下進(jìn)行硒化反應(yīng)，3次平行實(shí)驗(yàn)，求得在此條件下硒化紋黨參多糖的含硒量為1.07 mg/g（RSD為3.7%），產(chǎn)率為50.3% （RSD為2.5%）。

為了驗(yàn)證硒化紋黨參多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，將200μg/mL的硒化紋黨參多糖作用于不同的癌細(xì)胞 （人肺腺癌細(xì)胞A549、人宮頸癌細(xì)胞HeLa、人胃腺癌細(xì)胞BGC-823和人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞）24 h后發(fā)現(xiàn)，相同劑量下硒化紋黨參多糖比紋黨參多糖抗腫瘤作用更強(qiáng)，結(jié)果見(jiàn)圖3。硒化紋黨參多糖和紋黨參多糖對(duì)A549細(xì)胞的抑制率分別為49.36%和15.36%，對(duì)BGC-823細(xì)胞的抑制率分別為33.2%和24.34%，對(duì)HeLa細(xì)胞的抑制率分別為40.32%和20.21%，對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制率分別為35.09%和19.3%，硒化紋黨參多糖和紋黨參多糖的抗腫瘤活性的差異可能是由于它們的含硒量差異造成的。此發(fā)現(xiàn)表明，紋黨參多糖經(jīng)硒化修飾后可提高多糖的抗腫瘤活性。

3 結(jié)論

硒多糖比單獨(dú)的無(wú)機(jī)硒及多糖具有更顯著的生物活性，在醫(yī)藥研制和疾病治療等方面都有廣泛的應(yīng)用前景［17］。多糖硒化方法較多，如氧化吡啶法、硝酸-亞硒酸鈉（HNO3-Na2SeO3）和乙酸-亞硒酸鈉方法，HNO3-Na2SeO3因反應(yīng)條件簡(jiǎn)單、硒化效率高而成為多糖硒化常用方法［18］。

圖3 硒化紋黨參多糖和紋黨參多糖對(duì)不同癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率Fig.3 Inhibition rates of PCPs and PCP on different cancer ceIIs

紋黨參作為黨參中的佼佼者［5］，多糖是其主要的活性成分，表現(xiàn)出一定的提高免疫及抗腫瘤活性［19］。本研究以合成具有較高抗腫瘤活性的黨參硒多糖為主要目標(biāo)，以甘肅產(chǎn)紋黨參中提取出的多糖為原料，采用HNO3-Na2SeO3方法合成硒化紋黨參多糖，以產(chǎn)率、硒多糖中含硒量及硒多糖抗腫瘤活性為指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)探討紋黨參多糖硒化的最佳條件，研究發(fā)現(xiàn)，影響硒化反應(yīng)的關(guān)鍵因素是反應(yīng)溫度、多糖與Na2SeO3比率，反應(yīng)時(shí)間影響較小。硒化紋黨參多糖較未硒化紋黨參多糖具有較高的腫瘤生長(zhǎng)抑制率，提示硒化紋黨參多糖可以作為抗腫瘤候選藥物。該研究為紋黨參的開(kāi)發(fā)利用提供了思路。

硒多糖的抗腫瘤作用可能與促進(jìn)癌細(xì)胞分化和抑制其分裂有關(guān)，一方面硒多糖能調(diào)控癌細(xì)胞增殖和分裂癌基因的表達(dá)，使癌細(xì)胞行為向正常轉(zhuǎn)化，另一方面硒多糖可抑制與細(xì)胞癌變密切相關(guān)的蛋白激酶C的活性，從而有效抑制癌細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成，DNA復(fù)制及癌細(xì)胞的生長(zhǎng)等多種途徑抑制腫瘤細(xì)胞活性［20］。有關(guān)硒化紋黨參多糖抗腫瘤活性機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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SeIenyIation of poIysaccharides from Codonopsis pilosula and its inhibition against A549 ceIIs

CHENWen-xia， ZHANG Pei， GAO Xia， BAIRui-bin， HU Fang-di*
（School of Pharmacy，Lanzhou University，Lanzhou 730000，Ghina）

AIM To synthesize polysaccharides from Godonopsis pilosula selenide（PCPs）and to explore its anti-tumor activity againsthuman lung adenocarcinoma A549 cells.METHODS PCPswere synthesized by nitric acid-sodium selenide.Based on the single factor experiment，reactive parameters（reaction time，reaction temperature and the ratio of polysaccharide to Na2SeO3）were investigated and optimized by L9（34）orthogonal experimental design in terms of the selenite content，yield and the agent’s inhibitory rate on A549 cells.RESULTS 5 h of reaction time，60℃of reaction temperature and 1：1 ratio of polysaccharide to Na2SeO3were the optimal selenylation conditions.Under the optimal conditions，themean selenium content，yield and inhibitory rate on tumor cell of prepared PCPs reached 1.07 mg/g（RSD=3.7%），50.3%（RSD=2.5%）and 49.36%（RSD=2.8%），respectively.CONCLUSION PCPsmay be a promising antitumor agent.

polysaccharides from Godonopsis pilosula；selenylation；orthogonal experimental design；human lung adenocarcinoma A549 cells

R284.2

A

1001-1528（2015）11-2408-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.11.015

2015-01-05

蘭州市科技計(jì)劃項(xiàng)目 （2013-4-75，2012-2-67）

陳文霞 （1987—），女，碩士生，主要從事植物多糖硒化工藝研究。E-mail：cwx198712@163.com

*通信作者：胡芳弟 （1971—），女，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥成分分離分析及中藥新藥研究。Tel：（0931）8915686，E-mail：hufd@lzu.edu.cn