宋繼洋，王楠，方硯， 曹云山

絕經(jīng)后女性催乳素裂解與高血壓及心功能不全關系的研究

宋繼洋*，王楠，方硯， 曹云山

目的：探討絕經(jīng)后女性催乳素裂解與高血壓及心功能不全的關系，為其發(fā)病機制和防治策略提供新的理論依據(jù)。

方法：本研究共入選受試者216例，其中甘肅省人民醫(yī)院心內(nèi)科絕經(jīng)后女性高血壓患者156例，包括高血壓患者（高血壓組）80例，高血壓合并心功能不全患者（觀察組）76例；選取同期體檢健康的絕經(jīng)后女性（對照組）60例。檢測指標包括全長催乳素（23 kD PRL）、催乳素片段（16 kD PRL）、脂質過氧化物（LPO）、總抗氧化能力（TAS）及左心室射血分數(shù)（LVEF）、N末端B型利鈉肽原（NT-proBNP）、肌酐、尿酸、空腹血糖及體重指數(shù)（BMI），并進行統(tǒng)計分析。

結果：（1）各組間在年齡、肌酐、尿酸、空腹血糖及BMI等方面無顯著性差異（P＞0.05）。（2）高血壓組LPO顯著高于對照組，TAS顯著低于對照組；觀察組LPO顯著高于對照組和高血壓組，TAS顯著低于對照組和高血壓組（P＜0.05）。（3）觀察組23kD PRL顯著低于對照組，16 kD PRL、16 kD PRL/23 kD PRL顯著高于對照組。差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05～0.01）。（4）經(jīng)Pearson相關分析，LPO與23kD PRL呈負相關（r=-0.784 P＜0.01），與16 kD PRL呈正相關（r=0.807 P＜0.01）；TAS與23 kD PRL呈正相關（r=0.768 P＜0.01），與16 kD PRL呈負相關（r=-0.777 P＜0.01）; 23 kD PRL與LVEF呈正相關（r=0.852 P＜0.01），與NT-proBNP呈負相關（r=-0.832 P＜0.01）；16 kD PRL與LVEF呈負相關（r=-0.850 P＜0.01），與NT-proBNP呈正相關（r=0.814 P＜0.01）。

結論：催乳素裂解與絕經(jīng)后女性高血壓及心功能不全高度相關。

催乳素；脂質過氧化物；總抗氧化能力；氧化應激；高血壓；心功能不全

Methods: A total of 216 post-menopausal female subjects were enrolled in our study and they were divided into 3 groups: Hypertension group, n=80 patients with essential hypertension, Hypertension + HF group, n=76 and Control group, n=60 postmenopausal women form regular physical examination. The full length (23 kD PRL), 16 kD PRL fragment, lipid peroxide (LPO), total antioxidant status (TAS), left ventricular ejection fraction (LVEF), NT-proBNP, creatinine, uric acid, fasting blood glucose (FBG) and BMI were examined and compared among different groups.

Results:①There were no real differences in age, creatinine, uric acid, FBG and BMI among groups, P＞0.05.②Compared with Control group, Hypertension group had increased LPO and decreased TAS; compared with Control group and Hypertension group, Hypertension + HF group had increased LPO and decreased TAS.③Compared with Control group, Hypertension + HF group showed lower level of 23KD PRL, higher level of 16KD PRL and the higher ratio of 16KD PRL/23KD PRL, P＜0.05-0.01. ④Pearson correlation analysis indicated that LPO was negatively related to

23KD PRL (r=-0.784, P＜0.01), positively related to 16KD PRL (r=0.807, P＜0.01); TAS was positively related to 23KD PRL (r=0.768, P＜0.01), negatively related to 16KD PRL (r=-0.777 P＜0.01); 23KD PRL was positively related to LVEF (r=0.852, P＜0.01), negatively related to NT-proBNP (r=-0.832 P＜0.01); 16KD PRL was negatively related to LVEF (r=-0.850, P＜0.01), positively related to NT-proBNP (r=0.814, P＜0.01).

Conclusion: PRL cleavage was highly related to the occurrence of hypertension and HF in post-menopausal female patients.

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:1058.)

全長催乳素（23 kD PRL）是一種由腦垂體分泌的全長為23kD的多肽激素，其主要功能是促進女性乳腺發(fā)育及泌乳。近年來，隨著科學界對催乳素的研究越來越多，發(fā)現(xiàn)23 kD PRL可以進一步被蛋白酶水解成各種大小的片段。其中16 kD的催乳素片段（16 kD PRL）是一個主要的氨基末端催乳素片段，廣泛存在于人類下丘腦、垂體、乳腺和腎臟中[1-3]，在體內(nèi)外均具有抗血管活性[4-6]，目前國外研究多數(shù)認為16 kD PRL與圍產(chǎn)期心功能不全有關[7-9]。關于16 kD PRL與絕經(jīng)后女性高血壓及心功能不全的關系尚少見文獻報道。本研究主要通過檢測絕經(jīng)后女性外周血23 kD PRL、16 kD PRL、脂質過氧化物（LPO）、總抗氧化能力（TAS）、左心室射血分數(shù)（LVEF）及N末端B型利鈉肽原（NT-proBNP）水平，并進行相關性分析，初步探討絕經(jīng)后女性催乳素裂解與高血壓及心功能不全的關系，旨在為臨床治療絕經(jīng)后女性高血壓、心功能不全患者提供新的理論依據(jù)。

1 資料與方法

臨床資料：選取2013-03 至2014-03 甘肅省人民醫(yī)院心內(nèi)科住院絕經(jīng)后女性高血壓患者作為研究對象，共156例，依據(jù)《中國高血壓防治指南2010》[10]及《中國心功能不全診斷和治療指南2014》[11]診斷標準將其分為兩組，其中高血壓組 80 例，平均年齡（65.30±6.33）歲；高血壓合并心功能不全組（觀察組） 76例，平均年齡（67.67±5.71）歲。對照組選取同期體檢健康的絕經(jīng)女性 60例，平均年齡（66.86±6.46）歲。最終入選的216例受試者均排除：（1）繼發(fā)性高血壓；（2）急性心肌梗死、不穩(wěn)定性心絞痛、重度心血管瓣膜病變、嚴重心律失常；（3）自身免疫性疾??；（4）內(nèi)分泌腫瘤；（5）嚴重肝病、腎功能衰竭；（6）2個月內(nèi)發(fā)生的腦血管疾病（腦出血、腦梗死、短暫性腦缺血發(fā)作、蛛網(wǎng)膜下腔出血等）；（7）長期服用激素類藥物。

主要試劑與儀器：兔抗人催乳素抗體（Anti-Prolactin antibody）（英國abcam公司，克隆號：ab130316 英國），辣根酶標記山羊抗兔抗體IgG（北京中杉金橋生物技術有限 ），Pierce BCA蛋白定量分析試劑盒（Thermo Scientific），TAS測定試劑盒（南京建成科技有限公司），LPO檢測試劑盒（碧云天生物技術研究所） ，ECL Plus超敏發(fā)光液（北京索來寶科技有限公司），ChemiDoc XRS+凝膠成像儀（美國伯樂BIO-RAD公司），Olympus AU5400全自動生化分析儀，日本Alokaa10彩超診斷儀。

標本收集與處理：216例受試者入院第2天，于清晨空腹留取靜脈血10 ml，4℃，2 000 r/min離心10 min，取血清分為四份分裝于1.5 ml離心管中，-80℃冰箱保存待測。

蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測23 kD PRL和16 kD PRL：（1）樣品稀釋：取血清6 μl，加入24 μl PBS緩沖液混勻，將混勻后稀釋5倍的血清稀釋液用Pierce BCA蛋白定量分析試劑盒，測定蛋白濃度并計算上樣體積保證上樣量一致。由于血清中沒有穩(wěn)定表達的管家蛋白，因此參照文獻[12]的方法以麗春紅染色作為內(nèi)參。（2）電泳蛋白樣品制備：取30 μl稀釋液，加入10 μl 4×上樣緩沖液，混勻后100℃煮沸5 min，室溫冷卻后-20℃保存?zhèn)溆?。?）電泳分離：12 %SDS-聚丙烯酰胺凝膠，每孔加入蛋白30 μg，電壓80 V，電泳約40 min當條帶跑至分離膠后調電壓至120 V，繼續(xù)電泳90 min左右，待溴酚藍完全跑出分離膠時，停止電泳。（4）轉膜：用0.22 μm NC膜，組裝“三明治”結構，在電流200 mA條件下轉膜90 min（冰水浴）。（5）5%脫脂奶粉封閉（27℃，1 h），孵育一抗（兔抗人Anti-Prolactin antibody 1:200 4℃過夜），15 ml TBST（4℃預冷）洗膜3次（10 min/次，恒溫搖床搖動60 次/ min），孵育二抗（辣根酶標記山羊抗兔抗體 IgG 1:1000 27℃，1 h），恒溫搖

床搖動40 次/min，洗膜3次（同上）。（6）Western blot檢測：于暗室內(nèi)膜上加入ECL Plus超敏發(fā)光液（0.125 ml/cm2膜），立即在ChemiDoc XRS+凝膠成像儀上測定，得到圖像用Image J軟件進行光密度值分析。

指標檢測：硫代巴比妥酸（TBA）比色法測定LPO[13]、化學發(fā)光法定量檢測血清TAS。其他指標如肌酐、尿酸、空腹血糖等均由我院檢驗科負責在Olympus AU5400全自動生化分析儀上完成測定，LVEF由我院彩超室負責在日本Alokaa10彩超診斷儀上完成測定。

2 結果

各組間一般臨床資料及檢測指標的的比較（表1）：各分組在年齡、血肌酐 、血尿酸 、空腹血糖及BMI等方面差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。高血壓組和觀察組LVEF均低于對照組，觀察組NT-proBNP水平高于對照組和高血壓組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表1 各組間一般臨床資料及各項檢測指標的比較

表1 各組間一般臨床資料及各項檢測指標的比較

注： NT-proBNP：N末端B型利鈉肽原；LPO ：脂質過氧化物；TAS ：脂質過氧化物；23 kD PRL：全長催乳素；16 kD PRL：16 kD的催乳素片段。與對照組比較*P＜0.05；與高血壓組比較△P＜0.05

?

氧化應激與高血壓及心功能不全的關系：高血壓組LPO顯著高于對照組 ，TAS顯著低于對照組;觀察組LPO顯著高于對照組和高血壓組，TAS顯著低于對照組和高血壓組（表1）。差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05～0.01）。經(jīng)Pearson相關分析：LPO與LVEF之間呈負相關（r=-0.662，P＜0.01），與NT-proBNP呈正相關（r=0.615，P＜0.01）；TAS與LVEF呈正相關（r=0.684，P＜0.01），與NT-proBNP呈負相關（r=-0.712，P＜0.01）。

氧化應激與催乳素裂解的關系：經(jīng)Pearson相關分析：LPO與23 kD PRL呈負相關（r=-0.784，P＜0.01），與16 kD PRL呈正相關（r=0.807，P＜0.01）；TAS與23 kD PRL呈正相關（r=0.768，P＜0.01），與16 kD PRL呈負相關（r=-0.777，P＜0.01）。

催乳素裂解與高血壓及心功能不全的關系：Westen blot檢測23 kD PRL和16 kD PRL顯示，觀察組23 kD PRL顯著低于對照組（圖1B）、16 kD PRL和16 kD PRL/23 kD PRL顯著高于對照組（圖1C、圖1D）。差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。經(jīng)Pearson相關分析：23 kD PRL與LVEF呈正相關（r=0.852 P＜0.01），與NT-proBNP呈負相關（r=-0.832，P＜0.01）；16 kD PRL與LVEF呈負相關（r=-0.850，P＜0.01），與NT-proBNP呈正相關（r=0.814 ，P＜0.01）。

圖1 蛋白免疫印跡檢測23 kD PRL、16 kD PRL水平（n=216）

3 討論

催乳素的主要功能是確保哺乳。一項來自于Georgiopoulos 等[14]的研究表明，當機體處于氧化

應激狀態(tài)時，催乳素的一種裂解片段可能導致心血管疾病的發(fā)生。氧化應激是指機體內(nèi)活性氧和抗氧化劑調控失衡，組織或細胞內(nèi)氧自由基增多或清除能力降低導致活性氧（ROS）在體內(nèi)或細胞內(nèi)蓄積而引起的氧化損傷過程[15]。大量研究發(fā)現(xiàn)當體內(nèi)氧化與抗氧化作用調控失衡既氧化應激狀態(tài)時，會導致細胞內(nèi)信號轉導和轉錄活化蛋白3（STAT3）缺乏，STAT3的缺乏會抑制超氧化物歧化酶活性的上調，隨后活性氧的產(chǎn)生急速增加，活性氧的產(chǎn)生進一步激活了組織蛋白酶D的活性，從而將23 kD PRL裂解為16 kD PRL[7,16]。本研究主要通過測定絕經(jīng)后女性外周血23 kD PRL、16 kD PRL、LPO、TAS、LVEF及 NT-proBNP，以發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后女性催乳素裂解對高血壓及心功能不全的影響，為其發(fā)病機制和防治策略提供新的理論依據(jù)。

Tabruyn 、Sabatel等研究發(fā)現(xiàn)催乳素裂解可通過調節(jié)細胞核因子-κB的表達，進而誘導血管內(nèi)皮細胞SPRY蛋白1上調發(fā)揮抗血管活性[4,17]。Bajou等[18]證明裂解了的催乳素可通過結合一種已知的促進血管生成和生長的因子—纖溶酶原激活物抑制劑-1（PAI-1），并形成PAI-1三元復合物，即：PAI-1-尿激酶型纖溶酶原激活劑（uPA）-uPA受體（uPAR）從而發(fā)揮抗血管生成作用,抑制血管生成和生長。活化狀態(tài)的內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）和隨后產(chǎn)生的一氧化氮是和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、緩激肽及乙酰膽堿等一樣在介導血管生成、舒張和增加血管通透性的過程中起著非常重要地位的因子[19]，Gonzalez等[20]的研究發(fā)現(xiàn)PRL裂解產(chǎn)生的16 kD PRL可以通過抑制血管內(nèi)皮細胞VEGF誘導的eNOS的活化、干擾血管內(nèi)皮細胞內(nèi)Ca2+的動員，從而抑制了eNOS的Ca2+依賴性激活途徑，最終導致了血管收縮和生成障礙。上述研究證明隨著PRL裂解，過多的16 kD PRL產(chǎn)生抑制了血管內(nèi)皮的生成和修復、促進了血管收縮，總的結局不利于心力衰竭（心衰）的恢復。本研究發(fā)現(xiàn)高血壓合并心功能不全患者中過高的16 kD PRL/23 kD PRL比值，也說明催乳素裂解與絕經(jīng)后女性高血壓及心功能不全高度相關，很可能參與了絕經(jīng)后女性高血壓及心功能不全的發(fā)生和發(fā)展。

大量研究發(fā)現(xiàn)氧化應激的發(fā)生與高血壓病及其靶器官損害密切相關，其對心肌損害病理特征主要表現(xiàn)為心肌細胞排列紊亂，心肌間質充血，炎性細胞浸潤，細胞核膜破壞、核仁裂解，線粒體變性，肌原纖維斷裂等[21]。有報道發(fā)現(xiàn)高血壓患者體內(nèi)內(nèi)源性抗氧化物質如谷胱甘肽S轉移酶、谷胱甘肽過氧化酶、抗壞血酸及非蛋白硫醇等的水平明顯低于血壓正常者，并且與舒張壓呈負相關[22]。Russo等[23]發(fā)現(xiàn)高血壓患者脂質過氧化物升高，存在過氧化狀態(tài)，提出氧化和抗氧化狀態(tài)的不平衡是原發(fā)性高血壓的發(fā)病機制。Lantos等[24]研究證實高血壓患者的TAS濃度低于正常值范圍，而在接受抗高血壓藥物治療后有上升趨勢。以上這些研究都表明除脂質過氧化物生成過量外，內(nèi)源性抗氧化物質含量及活性的降低、總抗氧化能力下降都參與高血壓及心功能不全的氧化應激過程，導致了心衰。本研究顯示：高血壓和觀察組血清TAS水平明顯低于對照組（P＜0.01），LPO水平明顯高于對照組（P＜0.01），TAS與23 kD PRL之間呈正相關與16 kD PRL之間呈負相關，而LPO與23 kD PRL之間呈負相關，與16 kD PRL之間呈正相關，這些結果均提示氧化應激很可能是催乳素裂解的原因。

本研究發(fā)現(xiàn)當氧化與抗氧化能力失衡時，既機體處于氧化應激狀態(tài)下，隨著LVEF的降低，心功能不全患者外周血催乳素裂解明顯增加。 23 kD PRL 明顯減少 ， 16 kD PRL 明顯增加 ，16 kD PRL/23 kD PRL比值明顯升高。這一結果表明：氧化與抗氧化能力失衡很可能是觸發(fā)催乳素裂解的一個關鍵點。催乳素裂解成具有抑制血管生成和啟動凋亡的16 kD PRL形式這一過程使全身系統(tǒng)內(nèi)皮細胞、心臟血管及心肌功能受損，損傷微血管系統(tǒng)，促進血管收縮，增強炎癥細胞粘附到內(nèi)皮細胞，降低心臟功能并促進心室腔擴大，導致心功能不全的發(fā)生和發(fā)展。

本研究為催乳素裂解的具體機制提供了新的線索，為絕經(jīng)后女性高血壓和心功能不全的發(fā)生機制和防治提供了新的視點，同時也為絕經(jīng)后女性心功能不全患者激素替代治療增添了新的證據(jù)。

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Relationship Between Prolactin Cleavage and the Occurrence of Hypertension, Heart Failure in Post-menopausal Female Patients

SONG Ji-yang**, WANG Nan, FANG Yan, CAO Yun-shan.
Department of Cardiology, Gansu Provincial Hospital, Lanzhou (730000), Gansu, China

Objective: To investigate the relationship between prolactin (PRL) cleavage and the occurrence of hypertension, heart failure (HF) in post-menopausal female patients.

Prolactin; Lipid peroxide; Total antioxidant status; Oxidative stress; Hypertension; Heart failure

2015-05-20）

(編輯：曹洪紅)

甘肅省自然科學研究基金計劃（1208RJZA110）

750000 甘肅省蘭州市，甘肅省人民醫(yī)院 心內(nèi)科

宋繼洋 碩士研究生 主要從事心功能不全相關研究 Email:songjiyang620xyz@163.com 通 訊作者：王楠 Email: wangnan2015@163.com*現(xiàn)寧夏醫(yī)科大學臨床醫(yī)學院碩士研究生**Now is a Master Studeut at Clinical Medical Collese of Ningxia Medical University

R541

A

1000-3614（2015）11-1058-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2015. 11.007