劉燃，宋蕊，袁麗，凌露，楊萍，郭家智，張戈，陸地，孫林

人參皂苷Rg1對心肌細胞的影響及其信號傳導機制

劉燃，宋蕊，袁麗，凌露，楊萍，郭家智，張戈，陸地，孫林

目的：從細胞和分子層面探討人參皂苷Rg1（G-Rg1）對心肌細胞的影響及其信號傳導機制。

方法：體外培養(yǎng)大鼠H9c2心肌細胞，按實驗要求隨機分13組，每組5個平行孔，分別為空白對照組，單純?nèi)毖毖? h、6 h、12 h、24 h、48 h組，G-Rg1 5 μmol/L、10 μmol/L、50 μmol/L組，缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）的特異性抑制劑（YC-1）組，YC-1+G-Rg1組，蛋白激酶B（Akt）蛋白的磷酸化特異性抑制劑（Wortmannin）組，Wortmannin+G-Rg1組。檢測G-Rg1、缺血缺氧以及YC-1對心肌細胞活力及心肌細胞損傷的影響。同時用逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測心肌細胞內(nèi)HIF-1α、葡萄糖載體蛋白-1（GLUT-1）和血紅素氧合酶-1（HO-1）的信使核糖核酸mRNA表達水平變化。用蛋白質免疫印跡法檢測HIF-1α、GLUT-1和HO-1、活化轉錄因子-6（ATF-6）、抑制CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白（CHOP）和Akt等細胞信號通路蛋白表達水平變化。

結果：缺血缺氧時間與心肌細胞活力呈負相關（r=-0.8580，P＜0.05），與乳酸脫氫酶溢出率呈正相關（r=0.9201，P＜0.05）。G-Rg1 10 μmol/L組較單純?nèi)毖毖?4 h組細胞活力明顯回升（87.8%、62.6%，P＜0.05），細胞培養(yǎng)上清乳酸脫氫酶（LDH）含量明顯減少（25.0%、74.8%，P＜0.05），且上調(diào)了HIF-1α、GLUT-1、HO-1的mRNA表達水平（P＜0.05）。蛋白質免疫印跡法分析顯示：YC-1+G-Rg1組較G-Rg1組，心肌細胞活力下降（68.0%，87.8%，P＜0.05），細胞培養(yǎng)上清LDH含量增加（56.4%，25.0%，P＜0.05），同時YC-1拮抗了G-Rg1對HIF-1α、GLUT-1、HO-1、ATF-6和CHOP的蛋白表達水平的調(diào)控（P＜0.05）；Wortmannin可拮抗G-Rg1對HIF-1α和CHOP的蛋白表達水平的調(diào)控（P＜0.05），及對Akt兩個磷酸化位點的激活作用（P＜0.05）。

結論：心肌細胞損傷程度與缺血缺氧時間有關；G-Rg1對心肌細胞具有保護作用，其機制激活HIF-1α及其下游因子的表達并抑制了內(nèi)質網(wǎng)應激效應，可能與G-Rg1激活Akt有關。

人參皂苷Rg1；磷脂酰肌醇3激酶；缺氧誘導因子-1α；內(nèi)質網(wǎng)應激；凋亡

Methods: H9c2 cells were cultured and treated in different conditions by following groups:①Blank control group, ②Hypoxia alone group, the cells were treated for (2, 6, 12, 24, 48) hr respectively, ③G-Rg1 group, the cells were treated by G-Rg1 at (5, 10, 50) μmol/L respectively,④YC-1 group, which is the specifc inhibitor of hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α), ⑤YC-1 + G-Rg1 group, ⑥Wortmannin group, which is the specifc inhibitor for protein kinase B (Akt) phosphorylation and ⑦Wortmannin + G-Rg1 group. Each experiment was conducted with 5 replicates. The effects of G-Rg1, hypoxia and YC-1 on cell activity and injury were studied; intracellular mRNA expressions of HIF-1α, glucose

transporter-1 (GLUT-1) and heme oxygenase-1 (HO-1) were examined by RT-PCR; protein expressions of HIF-1α, GLUT-1, HO-1, activating transcription factor-6 (ATF-6), CCAAT/enhancer binding protein homologous protein (CHOP) and Akt with its signal pathway factors were measured by Western blot analysis.

Results: The time of hypoxia was negatively related to cell activity (r=-0.8580, P＜0.05) and positively related to LDH overfow rate (r=0.9201, P＜0.05). G-Rg1 (10μmol/L) group showed increased cell activity than Hypoxia alone (24 hr) group (87.8% vs 62.6 %, P＜0.05), while decreased LDH overfow (25.0% vs 74.8%, P＜0.05), and up-regulated mRNA expressions of HIF-1α, GLUT-1 and HO-1, P＜0.05. YC-1+ G-Rg1 group had decreased cell activity than G-Rg1 group (68.0% vs 87.8%, P＜0.05), while increased LDH overfow (56.4% vs 25.0%, P＜0.05). Meanwhile, YC-1 clashed the effect of G-Rg1 on protein expressions of HIF-1α, GLUT-1, HO-1, ATF-6 and CHOP, P＜0.05; wortmannin clashed the effect of G-Rg1 on protein expressions of HIF-1α, CHOP, P＜0.05 and suppressed the two phosphorylation sites for Akt activation, P＜0.05.

Conclusion: G-Rg1 may protect rat’s H9c2 cells in vitro by activating expressions of HIF-1α with its downstream factors and inhibiting endoplasmic reticulum stress, which might be related to the effect of G-Rg1 on Akt activation.

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:1096.)

人參皂苷Rg1（G-Rg1）是人參、三七等人參屬藥材的主要活性成分之一，有促進海馬神經(jīng)生長[1]以及對心血管系統(tǒng)的保護作用[2，3]。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）和蛋白激酶B（Akt），參與了多種細胞功能的調(diào)節(jié)，在細胞存活和抗凋亡中起重要作用。心肌細胞缺血缺氧時，其功能、代謝和結構均可能發(fā)生變化，同時可表達缺氧誘導因子-1（HIF-1），受缺氧信號調(diào)控的HIF-1α是活性亞基，HIF-1的下游基因涉及能量代謝、血管新生、鐵與血紅素的代謝以及一氧化氮的合成等。內(nèi)質網(wǎng)應激（ERS）與許多心血管疾病有關，其中抑制CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白（CHOP）是內(nèi)質網(wǎng)應激介導細胞凋亡的主要通路[4]。研究證明作為依賴缺血缺氧表達的HIF-1和ERS相關因子有潛在的聯(lián)系[5]。那兩者之間是否會存在交叉通路的調(diào)控現(xiàn)象，互相影響各自的下游基因表達；G-Rg1對心肌細胞的保護作用是否與抑制ERS介導的細胞凋亡有關，本研究做進一步探討。

1 材料與方法

主要儀器及試劑：蛋白電泳系統(tǒng)、逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）儀、水平電泳系統(tǒng)和凝膠成像儀（BIO-RAD,美國）；普通培養(yǎng)箱及三氣培養(yǎng)箱（Theromo electron Corporation, 美國）；G-Rg1（純度≥98%，由昆明制藥廠提供）；Wortmannin及YC-1（Sigma-Aldrich Co. LLC, 美國）；HIF-1α（Novus Biologicals, 美國）；GLUT-1（Millipore,Germany）；血紅素氧合酶-1（HO-1）、活化轉錄因子-6（ATF-6）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（內(nèi)參，GAPDH）（Santa Cruz Biotechnology, 美國）；Akt、phosphor-Akt （Ser473）、phosphor-Akt （Thr308）和CHOP（Cell Signaling technology, 美國）；所有PCR引物（Invitrogen Corporation，中國）。

分組：使用10%小牛血清 DMEM/F12 高糖培養(yǎng)液（于2014年購自Santa Cruz Biotechnology, 美國）培養(yǎng)大鼠H9c2心肌細胞（于2014年由廣東醫(yī)學科學研究中心林秋雄教授饋贈），以 1×106個/ml濃度接種于底面積25 cm2培養(yǎng)瓶中，將細胞置于細胞培養(yǎng)箱（37℃，5% CO2飽和濕度）中培養(yǎng)，每隔兩天傳代。因前期預實驗發(fā)現(xiàn)進行細胞饑餓同步化處理后，使心肌細胞提前出現(xiàn)應激狀態(tài)導致后續(xù)實驗結果不穩(wěn)定，故當細胞密度均勻生長至 80%～90%時，隨機分13組，每組5個平行孔?？瞻讓φ战M：將高糖培養(yǎng)液置換為無血清 DMEM低糖培養(yǎng)基繼續(xù)進行培養(yǎng)，不作任何處理；單純?nèi)毖毖? h、6 h、12 h、24 h、48 h組：將高糖培養(yǎng)液置換為無血清 DMEM低糖培養(yǎng)基后進行缺氧，使用1%O2的三氣培養(yǎng)箱，處理H9c2心肌細胞 2 h、6 h、12 h、24 h和48 h；G-Rg1 5 μmol/L、10 μmol/L、50 μmol/L組：將高糖培養(yǎng)液置換為無血清 DMEM低糖培養(yǎng)基后再分別加入5、10和50 μmol/L G-Rg1處理細胞0.5 h，而后再置入三氣培養(yǎng)箱處理12 h、24 h和48 h；HIF-1α的特異性抑制劑（YC-1）組：將高糖培養(yǎng)液置換為無血清 DMEM低糖培養(yǎng)基后使用10 μmol/L YC-1處理細胞 15 min，置入三氣培養(yǎng)箱處理24 h；YC-1+G-Rg1組：將高糖培養(yǎng)液置換為無血清 DMEM低糖培養(yǎng)基后使用10 μmol/L

YC-1處理細胞 15 min，而后用10 μmol/L G-Rg1處理細胞0.5 h，最后置入三氣培養(yǎng)箱處理24 h；蛋白激酶B（Akt）蛋白的磷酸化特異性抑制劑（Wortmannin）組：將高糖培養(yǎng)液置換為無血清 DMEM低糖培養(yǎng)基后使用1 μmol/L Wortmannin 處理細胞 15 min，置入三氣培養(yǎng)箱處理24 h。Wortmannin+G-Rg1組：將高糖培養(yǎng)液置換為無血清 DMEM低糖培養(yǎng)基后使用1 μmol/L Wortmannin 處理細胞 15 min，而后用10 μmol/L G-Rg1處理細胞0.5 h，最后置入三氣培養(yǎng)箱處理6 h、24 h。

細胞活性測定[3]：培養(yǎng)細胞單層鋪滿 96孔平底板，選取細胞密度均一、狀態(tài)良好的細胞進行實驗，每組設十個孔。按說明書依次加入相應試劑后，酶標儀 OD 550 nm 處測量各孔的吸光值并記錄數(shù)據(jù)。同樣實驗條件，重復五次。復孔數(shù)據(jù)求相應均值后依據(jù)公式：（缺血缺氧板OD值—空白對照組OD值）/（對照板OD值—空白對照組OD值）求出相應的細胞相對活性。

細胞乳酸脫氫酶（LDH）溢出率測定[6]：按上述的細胞分組處理細胞，不同培養(yǎng)時間后用移液器吸盡培養(yǎng)瓶內(nèi)的細胞培養(yǎng)上清至高壓滅菌的離心管中。向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入1 ml 0.5% TritonX-100，置于普通培養(yǎng)箱，20 min 后用移液器吸盡培養(yǎng)瓶內(nèi)細胞裂解液至另一批高壓滅菌的離心管中。按說明書依次加入相應試劑后，酶標儀 OD 340 nm 處測量各孔的吸光值并記錄數(shù)據(jù)。同樣實驗條件，重復五次。復孔數(shù)據(jù)求相應均值后依據(jù)公式：LDH（U/L）=（測定OD值 — 對照OD值）/（標準OD值 — 空白OD值）×標準品濃度（0.2 mmol/L）×1000求出細胞培養(yǎng)上清和細胞裂解液各自的LDH含量，再依據(jù)公式：LDH%=細胞培養(yǎng)上清LDH/（細胞培養(yǎng)上清LDH+細胞裂解液LDH）× 100%求出相應各組的細胞LDH溢出率百分比。

RT-PCR檢測：細胞總RNA提取后進行純度和濃度測定，按說明書行cDNA逆轉錄。所有引物已用PubMed BLAST進行引物來源、引物反應條件、引物長度和引物鏈配對等檢測。各基因引物系列見表1。并按照相應反應條件進行PCR擴增，完成后將PCR產(chǎn)物鑒定并定量分析，電泳完成后將瓊脂糖膠置于 Bio-Rad ChemiDoc XRS凝膠圖像分析系統(tǒng)中拍照采集圖像，Quantity one 4.4.0 計算各條帶的熒光強度值及其與GAPDH的比值進行定量分析。同樣實驗條件，重復五次。

蛋白質免疫印跡法檢測：蛋白質提取后定量，進行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳，而后使用半干轉移系統(tǒng)轉膜，完成后按照抗體說明書按一定比例依次加入一抗、二抗進行孵育，孵育最佳時間后進行化學發(fā)光、顯影、定影、拍照并晾干。用掃描儀掃描圖片后進行灰度分析。同樣實驗條件，重復五次。

表1 各基因引物序列

2 結果

缺血缺氧時間與細胞損傷的關系（表2）：缺血缺氧時間與心肌細胞活力呈負相關（r=-0.8580，P＜0.05），與細胞培養(yǎng)上清LDH含量呈正相關（r=0.9201，P＜0.05），驗證了體外缺血缺氧模型的建立。RT-PCR分析顯示HIF-1α、葡萄糖載體蛋白-1（GLUT-1）和HO-1在心肌細胞缺血缺氧2 h出現(xiàn)mRNA表達高峰。

表2 缺血缺氧時間與細胞損傷的關系

表2 缺血缺氧時間與細胞損傷的關系

注：LDH：細胞乳酸脫氫酶；RT-PCR：逆轉錄聚合酶鏈反應。與空白對照組比*P＜ 0.05。余注見表1

?

不同劑量G-Rg1對心肌細胞的作用（圖1）：分別用5 μmol/L、10 μmol/L和50 μmol/L的濃度梯度G-Rg1預處理心肌細胞，發(fā)現(xiàn)的G-Rg110 μmol/L組較

單純?nèi)毖毖?4 h組細胞活力明顯回升（87.8%、62.6%，P＜0.05），細胞培養(yǎng)上清LDH含量明顯減少（25.0%、74.8%，P＜0.05），且上調(diào)了HIF-1α、GLUT-1、HO-1的信使核糖核酸mRNA表達水平（P＜0.05）。

圖1 濃度梯度的G-Rg1 對心肌細胞內(nèi)三個因子信使核糖核酸表達的RT-PCR 圖

G-Rg1可抑制內(nèi)質網(wǎng)應激介導的細胞凋亡（圖2）：蛋白質免疫印跡法分析顯示：YC-1+G-Rg1組較G-Rg1組，心肌細胞活力下降（68.0%，87.8%，P＜0.05），細胞培養(yǎng)上清LDH含量增加（56.4%，25.0%，P＜0.05）。同時YC-1拮抗了G-Rg1對HIF-1α、GLUT-1、HO-1、ATF-6和CHOP的蛋白表達水平的調(diào)控（P＜0.05）。

圖2 YC-1拮抗G-Rg1對心肌細胞內(nèi)HIF-1α、GLUT-1、HO-1、ATF-6和CHOP的蛋白水平的調(diào)控作用的蛋白質免疫印跡法圖

G-Rg1通過激活Akt信號通路抑制了CHOP介導的心肌細胞凋亡（圖3、4）：蛋白質免疫印跡法分析顯示用Wortmannin預處理后，可拮抗G-Rg1對HIF-1α和CHOP的蛋白表達水平的調(diào)控（P＜0.05）。同時可拮抗G-Rg1在對Akt兩個磷酸化位點的激活作用（P＜0.05）。

圖3 Wortmannin拮抗G-Rg1對HIF-1α和CHOP的蛋白表達水平調(diào)控的蛋白質免疫印跡法圖

圖4 Wortmannin拮抗G-Rg1對Akt的蛋白磷酸化調(diào)控的蛋白質免疫印跡法圖

3 討論

HIF-1α是缺血前預處理和遠端缺血預處理起到心肌保護作用的關鍵調(diào)控基因[7，8]，經(jīng)脯氨酸羥

化酶（PHD）羥化修飾后降解，缺氧、藥物等刺激抑制PHD活性，使HIF-1α蛋白迅速增加，HIF-1α與HIF-1β聚合形成異二聚體，發(fā)揮轉錄因子的作用，調(diào)節(jié)靶基因的表達。缺氧時，HIF-1α可激活心肌營養(yǎng)蛋白-1以抑制心肌凋亡[9]，同時抑制心肌過度收縮，以保持降低能量代謝[10]。當氧化磷酸化過程受抑制時，HIF-1通過誘導GLUT-1和糖酵解酶類以增加糖酵解，滿足心肌對能量代謝的需要。HO-1可催化降解血紅素產(chǎn)生鐵離子、膽紅素和一氧化碳，能抑制動脈斑塊和粥樣硬化的形成及發(fā)展并保護心肌。本研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α、GLUT-1和HO-1 三個內(nèi)源性保護因子的mRNA表達高峰出現(xiàn)在缺血缺氧2 h時，通過G-Rg1預處理后，可使三個因子mRNA表達水平和蛋白水平的高峰明顯延長，起到更長時間的保護作用。

適度的ERS是種細胞保護機制，可使內(nèi)質網(wǎng)固有分子伴侶增加、蛋白質翻譯受抑制、未折疊蛋白的降解增加或自噬作用增強。研究發(fā)現(xiàn)G-Rg1可抑制神經(jīng)毒性致內(nèi)質網(wǎng)應激介導的細胞凋亡[11]。CHOP基因缺陷小鼠可避免缺血再灌注引起的心肌細胞炎癥及凋亡[12]。適當?shù)腅RS可增加ATF-6表達，以增強心肌在缺血再灌注中的生存能力[13,14]，同時還可以抑制由CHOP介導的細胞凋亡[15]。一些ERS分子伴侶如HO-1等可同時由ATF-6和HIF-1誘導表達。心肌梗死后，使用HIF-1的下游因子促紅細胞生成素的注射治療，可抑制CHOP介導的凋亡，保護缺血心肌以改善心功能[16]。本研究發(fā)現(xiàn)G-Rg1激活HIF-1α后上調(diào)了ATF-6表達，同時下調(diào)了CHOP的表達，抑制HIF-1α表達后明顯削弱了G-Rg1對CHOP表達的抑制效應，提示HIF-1可能位于ATF-6、CHOP的調(diào)控上游。但CHOP的下調(diào)與ATF-6的上調(diào)是否有關，本研究尚未探討。

PI3-K/Akt信號通路在缺血缺氧誘導的損傷反應中發(fā)揮了保護作用，而PI3K/Akt信號通路可調(diào)控HIF-1α其下游因子， G-Rg1可抑制脂多糖誘導炎性蛋白酶及促炎性細胞因子的表達[17]，也可以通過PI3K/Akt信號通路上調(diào)HIF-1α及其下游基因，提示PI3K/Akt位于HIF-1α和CHOP的調(diào)控上游。本研究證實G-Rg1先激活PI3-K/Akt信號通路Akt的兩個磷酸化位點后，再上調(diào)了HIF-1α及其下游保護因子的表達，起到保護心肌細胞的作用，并通過上調(diào)HIF-1α的表達以抑制內(nèi)質網(wǎng)應激介導的凋亡因子CHOP的表達，減少了心肌細胞的傷亡。初步證實了作為依賴缺血缺氧表達的HIF-1和ERS相關因子之間存在交叉通路的調(diào)控現(xiàn)象，G-Rg1對心肌細胞的保護作用與抑制ERS介導的細胞凋亡有關。這些發(fā)現(xiàn)解釋了G-Rg1發(fā)揮其保護效應涉及到的部分信號通路之間的調(diào)控關系。隨著越來越多G-Rg1機制學研究的完善，可使其成為臨床上用于保護心肌細胞的關鍵藥物。

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Effect of Ginsenoside-rg1 on Rat's Cardiomyocytes With its Mechanism of Signal Pathway in vitro

LIU Ran, SONG Rui, YUAN Li, LING Lu, YANG Ping, GUO Jia-zhi, ZHANG Ge, LU Di, SUN Lin.
Department of Cardiology Third Ward, The second Affliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming (650101), Yunnan, China
Co-corresponding Authors: SUN Lin, Email: sunlinkm@sina.com and LU Di, Email: ludi20040609@126.com

Objective: To investigate the effect of ginsenoside-rg1 (G-Rg1) on rat’s cardiomyocytes H9c2 with its mechanism of signal pathway in vitro.

Ginsenoside-rg1; Phosphoinositide-3 kinase; Hypoxia inducible factor-1α; Endoplasmic reticulum stress; Apoptosis

2015-03-31）

（編輯：王寶茹）

國家自然科學基金（81260061）；云南省科技廳-昆明醫(yī)科大學聯(lián)合專項基金（2012FB046、2014FB047）；云南省科技廳-昆明醫(yī)科大學應用基礎研究聯(lián)合專項重點項目（2013FB101）

650101 云南省昆明市，昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院 心內(nèi)科三病區(qū)（劉燃、宋蕊、袁麗、凌露、張戈、孫林）；昆明醫(yī)科大學生物醫(yī)學工程中心（楊萍、郭家智、陸地）

劉燃 住院醫(yī)師 碩士 主要從事冠心病及缺血再灌注損傷研究 Email：179143498@qq.com 通訊作者：孫林 Email：sunlinkm@sina.com陸地 Email：ludi20040609@126.com

R54

A

1000-3614（2015）11-1096-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.11.015