楊期勇，邱秀文，程鵬飛，李也，韓金鳳，蔣晟，單瑤瑤，孫超

1. 九江學院鄱陽湖生態(tài)經濟研究中心，江西 九江 332005；2. 九江學院化學與環(huán)境工程學院，江西 九江 332005

嗜酸性氧化硫硫桿菌的分離鑒定及其產酸特性

楊期勇1*，邱秀文1，程鵬飛1，李也1，韓金鳳2，蔣晟2，單瑤瑤2，孫超2

1. 九江學院鄱陽湖生態(tài)經濟研究中心，江西 九江 332005；2. 九江學院化學與環(huán)境工程學院，江西 九江 332005

嗜酸性氧化硫硫桿菌是生物淋濾技術去除污泥中重金屬的主要菌種，其生物氧化產酸反應是生物淋濾的關鍵步驟。為篩選、培育出高效的嗜酸性氧化硫硫桿菌。通過研究氧化硫硫桿菌的產酸特性，找出提高其產酸效果的方法，篩選、培育出高效的嗜酸性氧化硫硫桿菌。本研究從某污水處理廠活性污泥中分離、純化得到一株高效氧化單質硫的菌株JJU-1，通過菌株和菌落形態(tài)觀察、生理生化試驗、16S rDNA序列分析和同源性比較等分析方法，鑒定該菌株為嗜酸性氧化硫硫桿菌（Acidithiobacillus thiooxidan），并從初始pH值、硫粉投加量、單質硫粒度、吐溫60濃度等4個方面對JJU-1菌株的產酸特性進行了研究。實驗結果表明：培養(yǎng)液初始pH值對后期產酸性能影響較小，當培養(yǎng)到第7天時，各培養(yǎng)液的pH值基本處于同一水平，但初始pH值小于1時，菌株的生長受到抑制；硫粉投加量越大，菌株產酸效率越高，當培養(yǎng)到第8天時，不同硫粉投加量的培養(yǎng)液pH值最大差值達到0.54；菌株產酸速率隨單質硫粒度的減小而增大，粒徑小于180 μm的硫粉比大于180 μm的硫粉產酸速率快；吐溫60的投加對氧化硫硫桿菌產酸有一定的影響，當吐溫60的濃度為0.4～1.6 g·L-1時，對氧化硫硫桿菌產酸有一定的促進作用，但當吐溫60的濃度大于2.0 g·L-1時，培養(yǎng)8 d后氧化硫硫桿菌的生長受到一定的抑制；微濾膜實驗表明JJU-1菌株與單質硫表面的直接接觸是發(fā)生產酸反應的先決條件。在最佳生長條件（初始pH=2.5～3.5、θ=28～32 ℃）下，JJU-1菌株培養(yǎng)5 d后，培養(yǎng)液pH值從3.5降到1.5左右，由此可見，該菌株具有良好的氧化單質硫產酸性能，在污泥生物淋濾技術中具有一定的應用前景。

氧化硫硫桿菌；分離鑒定；16S rDNA；產酸特性

城鎮(zhèn)污水處理廠污泥的處置已成為一個重要的環(huán)境問題，因此，尋找一條有效處理和利用污泥的技術具有重要的現(xiàn)實意義。污泥中含有大量的重金屬污染物，這是阻礙污泥資源化利用的重要因素之一。生物淋濾技術可以顯著的改善污泥脫水性能、去除重金屬、消除病原菌，并為其后續(xù)資源化利用創(chuàng)造良好條件，是一種極具工程應用價值的污泥處理新技術（周立祥，2012）。生物淋濾主要是利用嗜酸性硫桿菌的生物氧化產酸作用，形成強酸環(huán)境將污泥中難溶性重金屬從固相中溶出進入液相，再通過固液分離加以去除（Gorkem等，2011）。目前，以氧化硫硫桿菌（Acidithiobacillus thiooxidan）為主要菌株、單質硫為能源底物的生物淋濾技術被認為是實現(xiàn)污泥重金屬去除最為快捷的途徑之一（L?ser et al.，2006；Chen et al.，2011）。

氧化硫硫桿菌是存在富硫環(huán)境中的一種嗜酸性菌，以其快速氧化單質硫和還原態(tài)的硫化物逐漸為人們所熟知。1921年Waksman et al.（1921）首次分離出能夠產酸的氧化硫硫桿菌，后來Suzuki et al.（1965；1992）研究了氧化硫硫桿菌氧化元素硫的生物酶和氧化機理。氧化硫硫桿菌最早用于微生物浸礦，主要是由于其氧化產酸特性及可以消除礦石表面阻止其溶解的硫磺層。Travisany et al.（2014）從銅礦中篩選到一株氧化硫硫桿菌，并對其進行了基因組序列測定，目前已成功應用于工業(yè)化生物浸礦。龔文琪等（2007）從煤礦的酸性礦坑水中分離出能有效浸出低品位磷礦的氧化硫硫桿菌菌株，初步試驗浸磷率可達到48.41%。張建民等（2010）研究了氧化硫硫桿菌的脫硫作用，對S2-氧化成單質硫的控制條件進行優(yōu)化、評價了脫硫性能。Yin et al.（2014）從煤礦堆坑廢水中分離出一株A01氧化硫硫桿菌，經測序后發(fā)現(xiàn)該菌株含有氧化元素硫和無機硫化物的特殊基因。隨著含重金屬污泥的處理處置越來越嚴格，氧化硫硫桿菌在重金屬污泥生物淋濾領域的應用研究逐漸增多。目前有研究者直接從污泥中分離出可用于污泥重金屬生物淋濾的氧化硫硫桿菌，并探討了其用于重金屬污泥的生物淋濾效果（周順桂等，2003；方迪等，2009；溫燁明等，2009）。由于嗜酸性氧化硫硫桿菌具有硫氧化酶和亞硫酸鹽氧化酶系統(tǒng)，硫桿菌的生物氧化產酸反應是重金屬污泥生物淋濾的主要限速步驟之一。曹亞彬等（2011）研究了金屬離子對氧化硫硫桿菌TT03的生長及產酸的影響。龔文琪等（2008）研究了吐溫類表面活性劑對嗜酸性氧化硫硫桿菌浸磷的影響，吐溫類表面活性劑促進細菌與礦物的作用，提高了浸磷率。由于天然菌株的產酸能力有限，彭會清等（2009）采用微波和紫外線誘導育種的方法使嗜酸氧化硫硫桿菌的產酸能力得到進一步提高。

本研究從某學校生活污水處理廠濃縮污泥中篩選、分離出一株氧化硫硫桿菌，對其進行了理化特性、分子學鑒定，并通過對該菌株產酸特性的研究，找出提高其產酸效果的方法，為進一步應用于重金屬污泥的生物淋濾提供基礎數(shù)據(jù)和工藝參考。

1 材料與方法

1.1 菌種篩選供試污泥

本實驗供試污泥為某學校第二污水處理廠濃縮污泥，該污水處理廠采用SBR工藝，污水來源主要為學校生活污水，每日處理水量為2000 t。濃縮污泥取回后保存在4 ℃的冰箱中備用。

1.2 實驗儀器

SKY-2102型恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海蘇坤實業(yè)有限公司）、ORP-431型氧化還原電位測定儀（上?？祪x儀器有限公司）、YXQ-LS-70A型立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）、V-1100D型分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）、2720 thermal cycler型 PCR儀（Applied Biosystems）、 3730XL 型 測 序 儀 （ Applied Biosystems）、DYY-5型電泳儀（北京六一儀器廠）、FR980凝膠成像儀（上海復日科技儀器有限公司）、CX-31型顯微鏡（Olympus）、Quanta 200環(huán)境電子掃描電鏡（FEI公司，荷蘭）。

1.3 培養(yǎng)基類別與配制

1.3.1 Waksman液體培養(yǎng)基的配制

稱取(NH4)2SO4：0.20 g，K2HPO4·3H2O：3.93 g，MgSO4·7H2O：0.50 g ，CaCl2：0.19 g，溶于1000 mL蒸餾水，用5 mol·L-1H2SO4調節(jié)pH為3.5～4.0，將各瓶培養(yǎng)基分裝到5個250 mL錐形瓶中，每個錐形瓶加入單質硫 1 g，用無菌透氣封口膜密封包扎好后在105 ℃下蒸汽滅菌30 min。

1.3.2 Waksman固體培養(yǎng)基的配制

A液：稱取(NH4)2SO4：2.0 g，KCl：0.1 g，K2HPO4·3H2O：0.33 g，MgSO4·7H2O：0.25 g，Ca(NO3)2·4H2O：0.01 g，溶于500 mL蒸餾水，用5 mol·L-1H2SO4調PH為3.0～3.5，并分裝于2個500 mL錐形瓶。

B液：稱取22.1 g Na2S2O3·5H2O溶于200 mL無菌水，并分裝于2個500 mL錐形瓶。

C液：分別稱取10 g瓊脂條溶于2個裝有150 mL蒸餾水的250 mL錐形瓶中，加熱溶解，然后用無菌透氣封口膜密封包扎好。

滅菌：A、C液分別在 121 ℃下蒸汽滅菌 20 min，B液用022 μm的針筒式過濾器過濾滅菌。

滅菌后冷卻至65 ℃，將A、B、C液中混合，迅速倒平板，每個平板約15～20 mL混合后的培養(yǎng)基液，制成單層平板。

1.4 菌株分離與純化

用移液管吸取10 mL生物酸化污泥于裝有90 mL Waksman液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，在28 ℃、180 r·min-1的恒溫培養(yǎng)振蕩器中培養(yǎng)，每天測定pH的變化，至pH下降至2.0以下。再用已經滅菌的移液管吸取已酸化的培養(yǎng)基液5 mL于95 mL新配無菌Waksman液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，按上述條件富集培養(yǎng)直至pH降至2.0以下，重復以上操作2～3次。經3～4次分選富集后采用Waksman固體培養(yǎng)基稀釋涂布平板法分離、純化菌種，獲得純培養(yǎng)菌株。當固體培養(yǎng)基上陸續(xù)出現(xiàn)直徑為 1 mm左右的圓形、邊緣整齊、中間微凸的淡黃色菌落時，挑取單菌落于 Waksman液體培養(yǎng)基中于 28 ℃搖床中培養(yǎng)，待其pH降到1.0～2.0時，再同以上10倍稀釋法步驟在固體培養(yǎng)基上再次進行分離培養(yǎng)，經過多次反復純化，分離出菌株，命名為JJU-1（GenBank登錄號：KM101109）。

1.5 菌株菌落形態(tài)觀察

將菌株菌落置于生物顯微鏡下，觀察其菌落形態(tài)；將處于對數(shù)生長期的細菌進行革蘭氏染色，并用顯微鏡觀察；挑取單菌落于Waksman液體培養(yǎng)基中，細菌經過預處理、噴金后，用掃描電鏡觀察。

1.6 菌株理化特性實驗

1.6.1 最適生長條件

接種相同量的菌液到Waksman培養(yǎng)基，保持其他條件不變，調節(jié)初始溫度（pH值設定為3.0）和初始pH值（培養(yǎng)溫度設定為28 ℃）進行培養(yǎng)。7d后觀察細菌量，以光密度OD600值（600 nm處的吸光度值）表征，OD600越大，細菌量越大。根據(jù)實驗數(shù)據(jù)作曲線圖，確定最適生長條件。每次實驗做3個平行樣（n=3）。

1.6.2 生長曲線

將菌液（10 mL）接種到Waksman液體培養(yǎng)基中，每天測定其OD600值、pH值和ORP值（氧化還原電位值），繪制氧化硫硫桿菌的生長曲線。每次實驗做3個平行樣（n=3）。

1.6.3 能源利用

試驗以Waksman液體培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基（不含單質硫、初始pH值3.0），添加以下一種物質作為能源：Na2S2O3（10 g·L-1）、單質硫S0（10 g·L-1）、FeSO4（44.7 g·L-1）、蛋白胨（1 g·L-1）和葡萄糖（1 g·L-1），通過接種等量（10 mL）的菌液培養(yǎng)8～12 d，測定OD600值和ORP值。每次實驗做3個平行樣（n=3）

1.6.4 氮源利用

以Waksman液體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基（含單質硫、初始pH值3.0），將其中的氮源(NH4)2SO4替換為其它的無機氮（w=0.1%）和有機氮（w=0.5%）。接種等量（10 mL）的菌液培養(yǎng)7 d，測定OD600值和pH值。每次實驗做3個平行樣（n=3）

1.7 菌株16S rDNA測序

采用Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒SK8255（生工生物工程股份有限公司，上海）提取菌株JJU-1的DNA。然后，進行）PCR擴增，其操作條件如下：正向引物（F27）為：5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’，反向引物（R1492）為：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’；反應體系：反應總體積25 μL，其中，Template（基因組DNA 20～50 ng·μL-1）0.5 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTP（各2.5 mM）1 μL，酶0.2 μL，F(xiàn)27（10 uM）0.5 μL，R1492（10 uM）0.5 μL，加雙蒸H2O至25 μL；循環(huán)條件：預變性94 ℃ 4 min，循環(huán)（共30次）94 ℃ 45 sec、55 ℃ 45 sec、72 ℃ 1 min，修復延伸72 ℃ 10 min，終止反應4 ℃。對PCR 擴增產物使用膠回收試劑盒進行純化，測序由生工生物工程（上海）有限公司完成。

1.8 菌株產酸特性實驗

1.8.1 初始pH值對菌株產酸特性的影響

在 15個 500 mL錐形瓶中各加入 350 mL Waksman液體培養(yǎng)基和3 g升華硫（粒徑<75 μm），將pH值分別調整到1、2、3、4、5，每個pH值做3個平行樣。滅菌、冷卻后加入10 mL菌懸液，恒溫搖床培養(yǎng)（180 r·min-1、28 ℃）。每天測定pH值，對照實驗不加菌懸液。

1.8.2 單質硫投加量對菌株產酸特性的影響

在 15個 500 mL錐形瓶中各加入 350 mL Waksman液體培養(yǎng)基，將pH值分別調整到3.0左右，加入升華硫（粒徑<75 μm）使其濃度分別為0、1.5、3、9、15 g·L-1，每個投加量做3個平行實驗。滅菌、冷卻后加入10 mL菌懸液，恒溫搖床培養(yǎng)（180 r·min-1、28 ℃）。每天測定pH值，對照實驗不加菌懸液。

1.8.3 單質硫粒度對菌株產酸特性的影響

在 12個 500 mL錐形瓶中各加入 350 mL Waksman液體培養(yǎng)基，將 pH值分別調整到 3.0左右，分別加入3 g不同粒度范圍的單質硫（20～50目：粒徑270～830 μm、50～80目：粒徑180～270 μm、80～140目：粒徑109～180 μm、大于200目：粒徑<75 μm），每個粒度做3個平行實驗。滅菌、冷卻后加入 10 mL菌懸液，恒溫搖床培養(yǎng)（180 r·min-1、28 ℃）。每天測定pH值，對照實驗不加菌懸液。

1.8.4 表面活性劑對菌株產酸特性的影響

在 18個 500 mL錐形瓶中各加入 350 mL Waksman液體培養(yǎng)基，將pH值分別調整到3.0左右，加入吐溫60使其濃度分別為0、0.4、0.8、1.2、1.6、2 g·L-1，每個濃度做3個平行實驗。滅菌、冷卻后加入10 mL菌懸液，恒溫搖床培養(yǎng)（180 r·min-1、28 ℃），每天測定pH值。

2 結果與分析

2.1 菌落形態(tài)特征

將分離純化的菌株在 Waksman液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。隨著菌株培養(yǎng)的進行，培養(yǎng)基液體表面漂浮的硫粉逐漸分散成細小顆粒，最后沉入瓶底；培養(yǎng)基逐漸變渾濁，培養(yǎng)基的pH快速降低（約5 d后pH值由初始的4.0降到1.4左右）。菌株在Waksman固體培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)9 d后，出現(xiàn)白色的較小菌落，邊緣整齊，中間微凸，隨著培養(yǎng)時間的延長，菌落變大，在白色中呈現(xiàn)出淡淡的黃色（如圖1）。細菌革蘭氏染色，顯微鏡下觀察為紅色，表明為革蘭氏陰性菌。掃描電鏡觀察菌體為短桿狀，長1～3 μm、寬0.5 μm左右（如圖2）。菌株JJU-1的菌落形態(tài)特征與呂早生等（2011）報道的氧化硫硫桿菌菌落特征相似。

2.2 菌株生理生化特征

2.2.1 最適生長條件

分離純化的菌株JJU-1在不同溫度和不同初始pH值條件下的生長情況如圖3和4所示。從圖4中可看出，該菌株培養(yǎng)7 d后，溫度在28～32 ℃之間時，培養(yǎng)液的光密度OD600值最大，為菌株最適生長溫度，與黃峰源等（2006）報道的一致；當溫度低于20 ℃、超過35 ℃時菌株生長逐步變緩慢。該菌株在pH值1.0～7.0范圍內都能生長，最適pH值為2.5～3.5，與呂早生等（2011）報道的最適生長pH值為1.5～3.5相近。

圖1 菌株JJU-1的菌落形態(tài)Fig. 1 Colony of strain JJU-1

圖2 菌株JJU-1的掃描電鏡圖Fig. 2 SEM image of strain JJU-1

圖3 溫度對菌株JJU-1生長的影響Fig. 3 Effect of temperature on growth of strain JJU-1 (primary pH=3.0, t=7 d)

圖4 初始pH值對菌株JJU-1生長的影響Fig. 4 Effect of primary pH on growth of strain JJU-1 (θ=28 ℃, t=7 d)

2.2.2 生長曲線

按5%的接種量接種菌株JJU-1于Waksman液體培養(yǎng)基中。從圖5中看出，在培養(yǎng)過程中培養(yǎng)液的ORP值先升高，在第5天達到一個峰值456 mv，隨后又逐漸下降；同時由于細菌的繁殖，細菌的數(shù)量劇烈增長，吸光值由開始的接近零升高到第8天的1.25；相應地，培養(yǎng)液的pH值下降迅速，第6天pH值下降到1.0左右，經8 d的培養(yǎng)從開始的3.45降到0.7左右，而王永東等（2007）報道氧化硫硫桿菌培養(yǎng)了17 d pH值從3.3下降到1.0左右，表明菌株JJU-1產酸能力強于王永東分離的氧化硫硫桿菌。

圖5 菌株JJU-1的生長曲線Fig. 5 Growth curves of strain JJU-1 (primary pH=3.0, θ=28 ℃)

2.2.3 能源利用特征

圖6為菌株 JJU-1在不同能源培養(yǎng)基上的生長情況。從圖中可以看出，以單質硫為能源時，培養(yǎng)基的OD600值迅速增大，從起始的0.007增加到第10天的0.993，表明菌株生長良好；以硫代硫酸鈉為能源時，前8 d OD600值變化很小，到第10天OD600值變化較大，增加到0.28，表明菌株在以硫代硫酸鈉為能源的培養(yǎng)基上生長有一個較長的滯后期，然后才進入快速生長的對數(shù)生長期，王永東等（2007）認為在使用硫代硫酸鈉做能源時，氧化硫硫桿菌生長的初期，會發(fā)生緩慢的歧化反應，有一個遲緩期。而以葡萄糖、蛋白胨、硫酸亞鐵為能源時，OD600值幾乎不變化，表明該菌株不能利用這3種物質作為能源。由于氧化硫硫桿菌和氧化亞鐵硫桿菌在許多生理特性上非常相似，在分離純化時比較難鑒別。本實驗條件下，該菌株不能利用亞鐵作為能源，而氧化亞鐵硫桿菌能夠在亞鐵培養(yǎng)基上生長，因此，可以判定該菌株不是氧化亞鐵硫桿菌。

圖6 菌株JJU-1在不同能源培養(yǎng)基中的OD600值變化Fig. 6 Variation of OD600when strain JJU-1 growing in different medium as energy sources

2.2.4 氮源利用特征

分別用碳酸銨、硝酸鉀、蛋白胨代替Waksman培養(yǎng)基中的硫酸銨，并投加單質硫作能源，將菌株接種到培養(yǎng)基中培養(yǎng)8 d，其生長情況見圖7。由圖可知，無機氮培養(yǎng)基pH值快速降低，培養(yǎng)液OD600值快速增長，菌株生長良好，表明該菌株能利用無機氮作為氮源生長。而該菌株在有機氮培養(yǎng)基中的生長緩慢，OD600值從開始的0.009增加到第8天的 0.071，pH值先略微升高，然后緩慢降低。因此，該菌株可以很好地利用無機氮作為生長氮源，但利用有機氮作為氮源生長時出現(xiàn)滯后期，生長緩慢。

圖7 菌株JJU-1在不同氮源培養(yǎng)基中的生長及pH變化Fig. 7 Variation of OD600and pH when strain JJU-1 growing in different nitrogen sources

因此，該菌株特征、菌落形態(tài)、生物學特性與布坎南等（1984）描述的硫桿菌屬氧化硫硫桿菌基本一致，初步判斷該菌株為氧化硫硫桿菌。下面將進一步對其進行分子學鑒定。

2.3 菌株JJU-1的16S rDNA測序分析和同源性比較

菌株JJU-1的PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增產物是一條特異性條帶，其大小約1500 bp。將菌株JJU-1 16S rDNA的PCR反應產物連接T載體進行測序，測得序列長度為1422 bp，把測得的16S rDNA序列提交到GenBank，獲得該菌株的基因序列登錄號為KM101109。在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，JJU-1菌株與Gene Bank中硫桿菌的16S rDNA序列相似性均達到99%。采用MEGA 4軟件對JJU-1菌株的測序結果進行系統(tǒng)發(fā)育分析，結果如圖8所示，從系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，菌株JJU-1與Acidithiobacillus thiooxidans BAD2的親緣關系最近，與屬內其它菌如Acidithiobacillus thiooxidans WJSo和 Acidithiobacillus thiooxidans ATCC的親緣關系相對較遠。

2.4 菌株JJU-1的產酸特性

菌株JJU-1在擴大培養(yǎng)階段，顯現(xiàn)出良好的產酸性能，為了更好地了解菌株JJU-1的產酸特性，本研究進行了產酸實驗。由于氧化硫硫桿菌能夠將單質硫和還原態(tài)硫氧化成SO42-，并產生H+，從而引起培養(yǎng)液 pH的變化，可以通過比較培養(yǎng)液 pH的大小來衡量各因素對其產酸效果的影響。

2.4.1 初始pH值對菌株產酸特性的影響

氧化硫硫桿菌是嗜酸性菌，在酸性條件下才能夠更好的生長。那么初始pH值的大小會不會影響JJU-1菌株的產酸效果呢？其實驗結果見圖9。隨著硫桿菌的繁殖，初始pH值為3、4、5的培養(yǎng)液pH值迅速下降，到第6天后pH的變化逐步變緩，而初始pH=2的培養(yǎng)液pH值下降速度較緩，初始pH=1的培養(yǎng)液 pH值變化非常小，這主要是由于在 pH值低于1的條件下，菌株的生長受到抑制，實驗中我們對pH=1的培養(yǎng)液的菌量進行檢測發(fā)現(xiàn)其增長速率非常緩慢。不接菌的對照實驗 pH值（初始pH=4）基本保持恒定。實驗結果表明，初始pH值的大小對JJU-1菌株的產酸性能在前6 d時段內有一定影響，但到第7天各培養(yǎng)液的pH值基本處于同一水平。

圖8 菌株JJU-1的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 8 Phylogenetic dendrogram of strain JJU-1

圖9 初始pH值對菌株JJU-1產酸特性的影響Fig. 9 Influence of initial pH on acid production of strain JJU-1

2.4.2 單質硫投加量對菌株產酸特性的影響

由上述的能源實驗可知，單質硫是菌株 JJU-1最主要的能源物質之一。為了了解硫投加量對菌株JJU-1產酸特性的影響，選擇了5個硫投加量作了對比實驗，其結果見圖10。如圖所示，不加單質硫的培養(yǎng)液pH值從3降到2.7左右后基本保持不變，而其他不同硫投加量的培養(yǎng)液隨著培養(yǎng)時間的延長pH值逐步降低，并且硫投加量越大，其pH值下降越快，產酸效果越好。當培養(yǎng)到第8天時，不同硫投加量的培養(yǎng)液pH值差距越來越大。這可能是由于硫投加量較少時，提供給硫桿菌的空間位置有限，當所有的空間位置完全被硫桿菌占據(jù)時，其他的硫桿菌就沒有機會與硫接觸而不能發(fā)生產酸反應。

圖10 單質硫投加量對菌株JJU-1產酸特性的影響Fig. 10 Influence of quantity of sulfur on acid production of strain JJU-1

2.4.3 單質硫粒度對菌株產酸特性的影響

氧化硫硫桿菌在氧化單質硫生產硫酸的過程，首先是硫桿菌細胞吸附在單質硫的表面，其在單質硫的表面作用受單質硫的結構、比表面積的大小影響較大（Vogler et al.，1941）。本實驗研究了20～50目（粒徑270～830 μm）、50～80目（粒徑180～270 μm）、80～140目（粒徑109～180 μm）、大于200目（粒徑<75 μm）4個不同粒度單質硫的產酸特性。從圖11中可知，20～80目的單質硫（粒徑180～830 μm）隨培養(yǎng)時間的延長 pH值下降的速度明顯小于80～140目和200目的單質硫，即粒徑小于180 μm的硫粉比大于180 μm的硫粉產酸速率快。氧化硫硫桿菌JJU-1的產酸速率隨單質硫粒徑的減小而增大，但是隨著粒度的進一步降低，增大效應有減弱趨勢。有學者研究得出類似的結論：50～150 μm粒徑的硫粉要比150～250 μm粒徑的硫粉生物氧化速度快。

圖11 單質硫粒度對菌株JJU-1產酸特性的影響Fig. 11 Influence of size of sulfur particle on acid production of strain JJU-1

2.4.4 表面活性劑對菌株產酸特性的影響

氧化硫硫桿菌與反應底物單質硫的直接接觸，是氧化硫硫桿菌發(fā)生生物氧化產酸反應的前提（Vogler et al.，1941）。然而由于單質硫的疏水性，單質硫在反應器中分散困難，硫桿菌很難與其充分接觸，并附著其表面，導致單質硫的生物氧化產酸反應成為生物淋濾的限速步驟。為此，本實驗采用潤濕劑吐溫60改善單質硫的表面性質，提高JJU-1菌株的產酸速率。如圖12所示，當吐溫60濃度小于1.6 g·L-1時，培養(yǎng)液的pH值小于沒有投加吐溫60的培養(yǎng)液的pH值，也即JJU-1菌株的產酸速率提高，吐溫60對其產酸有促進作用，其中吐溫60濃度為0.8 g·L-1的效果最好。而當吐溫60濃度為2.0 g·L-1時，培養(yǎng)液的pH值大于對照組培養(yǎng)液的pH值，說明吐溫60對JJU-1菌株的生長有抑制作用，降低其產酸速率，這可能是吐溫 60對細胞膜中的脂類具有溶解作用導致細菌死亡。Pith Otero et al.（1995）研究了吐溫 80對氧化硫硫桿菌生長及產酸的影響：當吐溫80的濃度大于2.5 g·L-1時，培養(yǎng)10 d后氧化硫硫桿菌的生長受到較大抑制，當吐溫80的濃度1.0 g·L-1時，對氧化硫硫桿菌產酸有較大的促進作用。本實驗結果與其研究結論基本一致：低濃度的表面活性劑對氧化硫硫桿菌產酸有較大的促進作用，高濃度的表面活性劑會抑制氧化硫硫桿菌的產酸效果。

圖12 吐溫60對菌株JJU-1產酸特性的影響Fig. 12 Influence of surfactant agent Tween 60 on acid production of strain JJU-1

2.5 氧化硫硫桿菌與單質硫的作用機理分析

從上述產酸特性實驗可知，嗜酸氧化硫硫桿菌JJU-1具有良好的氧化單質硫的能力，而且采用增加硫粉投加量、減小單質硫粒徑、投加表面活性劑劑吐溫60等方法均可以提高JJU-1菌株的產酸速率。從中我們可以看出，這幾種方法的共同點就是增加了細菌與單質硫的直接接觸空間和接觸面積，為單質硫進入硫桿菌細胞及后續(xù)的生化產酸反應提供了前提條件。而采用改變初始pH值的方法對菌株后期產酸性能影響較小，這是因為改變初始pH值僅僅改變了培養(yǎng)液的化學性質，影響了硫桿菌前期的生長，并沒有為細菌與單質硫的相互作用增大直接接觸面積。因此，可以推測氧化硫硫桿菌與單質硫表面的直接接觸是發(fā)生產酸反應的先決條件。

為了證實該推測，本實驗采用0.1 μm孔徑的平板微濾膜將3 g單質硫包裹密封，然后投加到裝有300 mL Waksman液體培養(yǎng)基和10 mL菌懸液的錐形瓶中，恒溫搖床培養(yǎng)（180 r·min-1、28 ℃）。同時，同樣條件下做一個對照實驗，即將單質硫直接加到接種菌懸液的培養(yǎng)基中。經過連續(xù) 10 d的培養(yǎng)，用微濾膜將單質硫包裹密封的培養(yǎng)液pH值基本保持在3左右，變化很小，而對照實驗的培養(yǎng)液pH值逐漸降低到1.0左右。

由上述掃描電鏡觀測可知，JJU-1菌株為短桿狀，長1～3 μm、寬0.5 μm左右，0.1 μm孔徑的平板微濾膜完全可以將氧化硫硫桿菌JJU-1與單質硫隔離，不讓兩者直接接觸。本實驗也證實了氧化硫硫桿菌與單質硫表面的直接接觸是發(fā)生產酸反應的先決條件。至于單質硫與氧化硫硫桿菌表面接觸后，如何進入嗜酸性氧化硫硫桿菌細胞體內不在本研究討論范圍。

3 結論

（1）通過菌落形態(tài)觀察、生理生化試驗、16S rDNA序列分析和同源性比較，篩選出的JJU-1菌株為嗜酸性氧化硫硫桿菌（Aciditythiobacillus thiooxidan）。

（2）對篩選出的JJU-1菌株進行產酸特性研究，發(fā)現(xiàn)該菌株具有良好的氧化單質硫產酸性能，在最佳生長條件（初始pH=2.5～3.5、θ=28～32 ℃）下，JJU-1菌株培養(yǎng)5 d后，培養(yǎng)液pH值從3.5降到1.5左右。

（3）在產酸特性研究中，對影響JJU-1菌株產酸的不同因素進行了分析：初始pH值對菌株培養(yǎng)前期有一定影響，對菌株后期產酸性能影響較小，初始pH值小于1時，菌株的生長受到抑制；硫粉投加量越大，菌株產酸效率越高；菌株產酸速率隨單質硫粒度的減小而增大，粒徑小于180 μm的硫粉比大于180 μm的硫粉產酸速率快；低濃度吐溫60能提高JJU-1菌株的產酸效率，而高濃度吐溫60則對產酸有抑制作用。

（4）對氧化硫硫桿菌與單質硫的作用機理進行分析，發(fā)現(xiàn)硫桿菌與單質硫表面的直接接觸是發(fā)生產酸反應的先決條件。

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Isolation, Identification of an Acidithiobacillus Thiooxidan Strain and Its Characteristic of Acid Production

YANG Qiyong1*, QIU Xiuwen1, CHENG Pengfei1, LI Ye1, HAN Jinfeng2, JIANG Shen2, SHAN Yaoyao2, SUN Chao2
1. Poyang Lake Eco-economy Research Center, Jiujiang University, Jiujiang 332005, China; 2. College of Chemistry and Environmental Engineering, Jiujiang University, Jiujiang 332005, China

Acidithiobacillus thiooxidan is the major microorganism in bioleaching of heavy metal from sewage sludge. The biological oxidation of sulfur by Acidithiobacillus thiooxidan is the committed step of bioleaching of heavy metal. In order to isolate and cultivate efficient Acidithiobacillus thiooxidan, its characteristic of acid production is studied, and then the method of improving the effect of its acid production is selected. An autotrophic sulfur-oxidizing bacterium (strain JJU-1) was isolated from the activated sludge of a sewage plant. According to its colonial morphology, SEM image of strain, physiological-biochemical properties and its16S rRNA gene sequence analysis, the strain was identified as Acidithiobacillus thiooxidan. Sulfur oxidation by JJU-1 was studied from four aspects, such as initial pH, quantity of sulfur, size of sulfur particle and concentration of surfactant agent (Tween 60). The culture mediums with different initial pH were studied and the results indicated that the initial pH of culture medium almost had no effect on growth of Acidithiobacillus thiooxidan in later stage, more specifically, the pH of culture mediums were almost the same on the 7thday. The experiment results also showed the growth of microorganism was restrained at pH below 1. Considering the influence by different amount of substrate sulfur added into the culture mediums, the rate of sulfate formation by JJU-1 strain was higher when the sulfur amount increased. On the 8thday the maximum difference of the culture mediums pH with different amount of sulfur was 0.54. The rate of sulfate formation by JJU-1strain increased with the decrease in sulfur particle size. The sulfur particles passing through 180 μm yielded lower rates of sulfate formation than these of size below 180 μm. The addition of Tween 60 had some effect on sulfate formation by JJU-1 strain. When the concentration of Tween 60 was at 0.4～1.6 g·L-1, it would increase the rate of sulfate formation. However, when the concentration of Tween 60 exceeded 2.0 g·L-1, there was a negative effect on the growth of JJU-1 strain on the 8thday. The microfiltration membrane experiment indicated that the Acidithiobacillus thiooxidan must be in direct physical contact with the sulfur particle before oxidation could take place. At the optimal growth conditions (pH=2.5～3.5, θ=28～32 ℃), the pH of culture media decreased from 3.5 to around 1.5 after 5 days, which indicated that the JJU-1 strain showed efficient in sulfur oxidation and sulfate formation. Therefore, The JJU-1 strain could be widely used in sewage sludge bioleaching

Acidithiobacillus thiooxidan; isolation and identification; 16S rDNA; characteristic of acid production

10.16258/j.cnki.1674-5906.2015.08.017

X172

A

1674-5906（2015）08-1366-09

楊期勇，邱秀文，程鵬飛，李也，韓金鳳，蔣晟，單瑤瑤，孫超. 嗜酸性氧化硫硫桿菌的分離鑒定及其產酸特性[J]. 生態(tài)環(huán)境學報, 2015, 24(8): 1366-1374.

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國家自然科學基金項目（21367014）；江西省自然科學基金項目（20151BAB203026）；江西省科技廳對外科技合作計劃項目（20132BDH80008）；江西省教育廳科技項目（GJJ14732）

楊期勇（1972年生），男，教授，博士，主要從事水污染控制及廢物資源化技術研究。E-mail: yqy46901@163.com *通信作者。

2015-05-30