張騫月，周建忠,，趙婉婉，吳偉,

1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇 無錫 214081；2. 蘇州市吳江區(qū)水產(chǎn)技術(shù)推廣站，江蘇 蘇州 215200；

3. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院內(nèi)陸漁業(yè)生態(tài)環(huán)境與資源重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214081

水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中磺胺類藥物的殘留分析及其耐藥菌株研究

張騫月1，周建忠1,2，趙婉婉1，吳偉1,3

1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇 無錫 214081；2. 蘇州市吳江區(qū)水產(chǎn)技術(shù)推廣站，江蘇 蘇州 215200；

3. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院內(nèi)陸漁業(yè)生態(tài)環(huán)境與資源重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214081

對2014年整個(gè)養(yǎng)殖周期中南美白對蝦養(yǎng)殖池塘的水樣和沉積物進(jìn)行采集，分析其中磺胺類藥物的殘留及其耐藥細(xì)菌的變化，探討其存在和分布與時(shí)間、空間及水產(chǎn)養(yǎng)殖活動(dòng)的相關(guān)性，在此基礎(chǔ)上對耐藥細(xì)菌進(jìn)行分離、鑒定并研究其生長性能。研究結(jié)果顯示，在整個(gè)養(yǎng)殖季節(jié)中，池塘水體中磺胺類的變化呈低-高-低的變化趨勢，養(yǎng)殖前、中、后期水體中磺胺類藥物的平均濃度為0.437、1.691和0.503 ng·mL-1；而沉積物中的磺胺類藥物的含量是逐漸遞增的，養(yǎng)殖前、中、后期的平均含量為2.110、4.059和6.090 ng·g-1。池塘水體的可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量在5.50×104～1.20×105CFU·mL-1間，呈先升后降的趨勢，沉積物中的可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量在9.83×105～1.86×106CFU·g-1間，呈不斷上升的趨勢，且沉積物中的可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量較同期水體中高 10～100倍。在相同濃度的磺胺二甲基嘧啶作用下，沉積物中的耐藥細(xì)菌數(shù)量顯著高于同期水體中的耐藥細(xì)菌數(shù)量，高10～100倍。從養(yǎng)殖池塘沉積物和水體中分離到2株磺胺類藥物的耐藥菌株NHA1401和NHA1402，經(jīng)細(xì)菌生理生化鑒定和16S rDNA序列分析，NHA1401和 NHA1402同屬奇異變形桿菌屬（Proteus mirabilis）。磺胺類藥物濃度越大，其對菌株NHA1401和NHA1402的生長壓力越大，NHA1401菌株對磺胺類藥物的耐受性要強(qiáng)于NHA1402。研究表明，養(yǎng)殖池塘環(huán)境中的磺胺類藥物與養(yǎng)殖過程有關(guān)，沉積物是養(yǎng)殖環(huán)境中耐藥細(xì)菌的主要存在場所。為保護(hù)環(huán)境和水產(chǎn)品質(zhì)量，必須對抗生素的使用嚴(yán)加管控。

水產(chǎn)養(yǎng)殖；水體；沉積物；磺胺類藥物；耐藥細(xì)菌；16S rDNA

近年來，抗生素因其有效防治水產(chǎn)動(dòng)物的細(xì)菌性疾病、促進(jìn)生長的功效而被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，對水產(chǎn)業(yè)的發(fā)展起到了一定的推動(dòng)作用（Cromwell，2002；Gaskins et al.，2002）。然而，隨著抗生素的過度使用，由抗生素引發(fā)的水環(huán)境污染問題日益受到社會(huì)各界的高度關(guān)注。研究表明，攝入到養(yǎng)殖動(dòng)物體內(nèi)的抗生素大約會(huì)有 80%以上以母體化合物的形式排放到周圍的環(huán)境中，可誘導(dǎo)水生生物體內(nèi)和環(huán)境介質(zhì)中產(chǎn)生耐藥菌株（高盼盼等，2009）772。目前，在我國地表水中已檢測出68種抗生素（王丹等，2014）743；有超過 16種抗生素在世界各水體及沉積物中被高頻次、高含量地檢出（Kümmerer，2003；Ternes et al.，2004），從而使環(huán)境中的微生物產(chǎn)生了選擇性壓力，在微生物體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生抗生素抗性基因（ARGs）。一旦ARGs在環(huán)境介質(zhì)中傳播和遷移，將導(dǎo)致抗生素的失效，產(chǎn)生嚴(yán)重的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。

在我國地表水中所檢測出的抗生素中，磺胺類的比例高達(dá)33%，位列第一（王丹等，2014）744?；前奉悓僮钤缡褂玫娜斯ず铣煽咕?，抗菌譜廣，療效穩(wěn)定，對大多數(shù)由革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌引起的疾病均具有較好的防治效果，對某些放線菌、衣原體和原生動(dòng)物也有一定的抑制作用。磺胺類藥物因與對氨苯甲酸（PABA）結(jié)構(gòu)相似，可通過與PABA競爭二氫葉酸合成酶，使二氫葉酸不能合成葉酸而抑制細(xì)菌的生長和繁殖。磺胺類在水產(chǎn)養(yǎng)殖中對爛鰓病、癤瘡、細(xì)菌性豎鱗病、弧菌病、腸炎、赤鰭病、鞭毛蟲病的防治效果良好，使用較為普遍（巢磊，2002）。目前，在不同的環(huán)境介質(zhì)中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn) 4種磺胺類抗性基因的存在（Thompson et al.，2007）。因此以磺胺類藥物為目標(biāo)，研究其耐藥細(xì)菌的特征具有重要的意義。

本文研究了南美白對蝦養(yǎng)殖池塘中磺胺類藥物的殘留動(dòng)態(tài)及相應(yīng)的耐藥菌分布，篩選得到2株對磺胺二甲基嘧啶具有較強(qiáng)耐藥性的菌株，在生理生化分析的基礎(chǔ)上結(jié)合16S rDNA等分子生物學(xué)手段進(jìn)行了鑒定，并研究了其生長特性，以期為后續(xù)的抗性基因的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

所用試劑為：磺胺類藥物ELISA試劑盒，北京勤邦生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；磺胺二甲基嘧啶，BR，99%，Sigma-Aldrich產(chǎn)品；鹽酸、氫氧化鈉、乙腈、乙酸乙酯、正已烷、無水乙醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉均為分析純（A.R），以及牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、瓊脂粉等，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司產(chǎn)品；SK8255（細(xì)菌）DNA提取試劑盒，生工（上海）生物工程有限公司產(chǎn)品；微量生化管細(xì)菌鑒定系統(tǒng)，杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品。

所用儀器為：Elx 808酶標(biāo)儀（美國Bio Tek公司），Elx 50洗板機(jī)（美國Bio Tek公司），MIR153培養(yǎng)箱（日本SANYO公司），2-16 K低溫冷凍離心機(jī)（德國SIGMA公司），AL104電子天平（瑞士METTLER公司）、Autoclave SS-325全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋（日本TOMY公司）、XW-80A渦旋混合器（上海宏冉儀器），BIOER 746102基因擴(kuò)增儀（杭州博日科技公司），ZHJH-124垂直流超凈工作臺(tái)（上海智誠分析儀器公司）、SHR-080恒溫生化培養(yǎng)箱（常州華冠儀器制造有限公司）、QHZ-98B全溫度光照震蕩培養(yǎng)箱（上海皓莊儀器）、UV-1200紫外-可見分光光度計(jì)（上海析譜儀器有限公司）、氮吹儀（上海皓莊儀器）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘中磺胺類藥物的分析與檢測

樣品采集于 2014年江蘇某南美白對蝦養(yǎng)殖場的養(yǎng)殖池塘。選擇3個(gè)面積均為0.67 hm2的池塘（養(yǎng)殖與管理情況一致），分別在養(yǎng)殖前期（4月下旬）、養(yǎng)殖中期（6月下旬）和養(yǎng)殖后期（9月中旬）采集水樣和沉積物樣品，分析水體和沉積物中磺胺類藥物的含量變化。用采水器在每個(gè)池塘的四周采集水面下0.5 m處的水樣1 L，混合后裝入無菌樣品瓶中；同樣用采泥器采集池塘沉積物，裝入無菌樣品袋。水樣和沉積物樣品冷藏于4 ℃之下，48 h內(nèi)分析完畢。

采用 ELISA試劑盒測定水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘中水體和沉積物中磺胺類藥物的含量，磺胺類藥物的單位為ng·mL-1（或ng·g-1），最低檢出限為0.5 ng·mL-1（或ng·g-1）。測試方法為96微孔板比色法，酶標(biāo)儀波長為450 nm/630 nm雙波長（操作按試劑盒說明書進(jìn)行）試驗(yàn)結(jié)果使用 SPSS軟件進(jìn)行差異顯著性分析，P<0.05表明差異顯著，P<0.01表明差異極顯著。

1.2.2 水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘中磺胺類耐藥菌株的分布與變化

無菌條件下吸取上述所采集的水樣（先振蕩均勻）1 mL于9 mL無菌水中，得到10-1的稀釋度，并依次獲得10-2、10-3的稀釋度。分別從10-2和10-32個(gè)不同的稀釋度中取0.1 mL，加入含磺胺二甲基嘧啶0、50、500和1000 μg·mL-1的營養(yǎng)肉湯瓊脂平板中，每個(gè)做3個(gè)平行，放入30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，計(jì)數(shù)平板上的菌落數(shù)。

同樣，無菌條件下取養(yǎng)殖池塘的沉積物 1 g，置于9 mL無菌水中，渦旋混勻后得到10-1的稀釋度，并依次獲得 10-3、10-4的稀釋度。分別從 10-3和10-4稀釋度溶液中取0.1 mL，加入含磺胺二甲基嘧啶0、50、500和1000 μg·mL-1的營養(yǎng)肉湯瓊脂平板中，每個(gè)做3個(gè)平行，放入30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，計(jì)數(shù)平板上的菌落數(shù)。

試驗(yàn)結(jié)果以耐藥菌株的出現(xiàn)率來表示，耐藥菌株的出現(xiàn)率（%）：含磺胺二甲基嘧啶平板上的菌落數(shù)/不含磺胺二甲基嘧啶平板上的菌落數(shù)的比值×100%。

營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基為：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCL 5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。含磺胺二甲基嘧啶的營養(yǎng)肉湯瓊脂只需在上述已滅菌好的培養(yǎng)基中加入經(jīng)過濾除菌的不同濃度磺胺二甲基嘧啶溶液即可。

1.2.3 水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘中磺胺類耐藥菌株的分離與鑒定

無菌下用接種環(huán)將上述所得的10-1的水樣或沉積物的稀釋液在含磺胺二甲基嘧啶50、500和1000 μg·mL-1的營養(yǎng)肉湯瓊脂平板上劃線分離，于30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，觀察平板上的菌落情況。將能在2個(gè)濃度下生長的菌落接入含磺胺二甲基嘧啶500 μg·mL-1的液體營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液，30 ℃的恒溫振蕩培養(yǎng)48 h。為了進(jìn)一步確定所篩菌株的種屬，采用細(xì)菌生化鑒定管對所篩菌株的生化特性進(jìn)行分析，并結(jié)合16S rDNA的方法進(jìn)行菌株鑒定。按SK8255（細(xì)菌）試劑盒的操作程序提取菌株的DNA，使用細(xì)菌通用引物 7f（序列 5'→3' CAGAGTTTGATCCTGGCT）和1540R（序列5'→3' AGGAGGTGATCCAGCCGCA）擴(kuò)增其片段，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳觀察（1%瓊脂糖電泳，150 V、100 mA，20 min），擴(kuò)增產(chǎn)物由生工（上海）生物工程有限公司進(jìn)行測序。將所得基因序列經(jīng)BLAST程序與GenBank核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析，最后采用MEGA5.1軟件進(jìn)行同源性比對分析并建立系統(tǒng)發(fā)育樹（王瓊等，2014）。PCR的反應(yīng)體系（25 μL）為：10×buffer（含Mg2+）2.5 μL，2.5 mM dNTP 1.0 μL，正反引物（10 μM）各0.5 μL，DNA模板0.5 μL，Taq DNA聚合酶（5 U·μL）0.2 μL，無菌水19.8 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 4 min預(yù)變性；94 ℃ 45 sec，55 ℃ 45 sec，72 ℃ 1 min，循環(huán)30次；72 ℃ 10 min修復(fù)延伸；4 ℃終止反應(yīng)。

1.2.4 水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘中磺胺類耐藥菌株的生長特性

將上述所篩得的耐藥菌株接入滅菌的含磺胺二甲基嘧啶0、50、500和1000 μg·mL-1的液體營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，于30 ℃的恒溫振蕩連續(xù)培養(yǎng)96 h。從試驗(yàn)開始每隔24 h取樣分析菌液的OD600，了解耐藥菌株的生長情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘中磺胺類藥物的分布和變化

2014年某南美白對蝦養(yǎng)殖池塘養(yǎng)殖前、中、后期的水樣和沉積物中磺胺類藥物的含量變化結(jié)果見表1。

表1 水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘水體及沉積物中磺胺類藥物的含量Table 1 The residual contents of sulfonamides in water and sediments in the aquaculture ponds

由表1可見，養(yǎng)殖前期水體中磺胺類藥物的含量在ND.～1.312 ng·mL-1間，均值為0.437 ng·mL-1，3個(gè)池塘中2個(gè)未檢出；隨著養(yǎng)殖的推進(jìn)，養(yǎng)殖中期水體中磺胺類藥物的含量在0.785～3.156 ng·mL-1間，均值為1.691 ng·mL-1，與養(yǎng)殖前期差異顯著（P＝0.019，<0.05）；養(yǎng)殖后期水體中磺胺類藥物的含量在ND.～1.510 ng·mL-1間，均值為0.503 ng·mL-1，3個(gè)池塘中同樣有2個(gè)未檢出，與養(yǎng)殖中期差異顯著（P＝0.030，<0.05），但與養(yǎng)殖前期無顯著性差異（P＝0.982，>0.05）。在整個(gè)養(yǎng)殖季節(jié)中，池塘水體中磺胺類的變化呈低-高-低的變化趨勢，而池塘沉積物中的磺胺類藥物的含量是逐漸遞增的，由養(yǎng)殖前期的 2.110 ng·g-1，提高至養(yǎng)殖后期的 6.090 ng·g-1，差異性顯著（P＝0.002，<0.01）。上述結(jié)果表明，養(yǎng)殖池塘環(huán)境中的磺胺類藥物與養(yǎng)殖過程有關(guān)。養(yǎng)殖前期氣溫較低，投餌料少，水質(zhì)相對較好，病害發(fā)生率低，沒有使用藥物，故3個(gè)池塘水樣中2個(gè)未檢出。另一個(gè)檢出的含量也較低，可能是沉積物中的殘留溶出等因素造成。而養(yǎng)殖中期氣溫高，生物生長快，投餌量大，病原生物活躍，故使用了防控疾病的藥物，水體中磺胺類的含量顯著上升。養(yǎng)殖后期因氣溫下降和養(yǎng)殖生物逐漸出池，藥物使用減少直至不使用，故水樣中含量又顯著下降?；前奉愃幬锊灰自谒w中累積，更易在沉積物中積聚。曾有研究表明，磺胺類藥物進(jìn)入水環(huán)境后主要被沉積物吸附，沉積物中的有機(jī)質(zhì)有助于其吸附。而其在水體中的降解主要是通過水解和光降解等非生物降解，湖水中磺胺類的半衰期達(dá)115 d（金彩霞等，2011）。因本研究中所采水樣為水面下0.5 m處，屬透光率較好的水層，光降解條件好，可能是磺胺類不易累積的原因之一。至于磺胺類在養(yǎng)殖池塘不同深度水層的分布則有待于進(jìn)一步深入研究。

磺胺類藥物目前在水產(chǎn)養(yǎng)殖上是可以使用的，考慮到其在水體和沉積物中的分布和累積，在養(yǎng)殖生產(chǎn)中應(yīng)嚴(yán)格控制使用劑量和使用頻次，并經(jīng)常使用氧化性底改修復(fù)池塘底質(zhì)，加速其降解，減少其在沉積物中的殘留。

2.2 水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘中磺胺類耐藥菌株的分布與變化

2014年某南美白對蝦養(yǎng)殖池塘養(yǎng)殖前、中、后期水樣和沉積物中磺胺類耐藥菌的數(shù)量變化結(jié)果見表2。

表2 水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘水體及沉積物中磺胺類耐藥細(xì)菌的數(shù)量Table 2 Viable count of sulfonamide resistant bacteria in water and sediments in the aquaculture ponds

由表2可見，養(yǎng)殖過程中水體的可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量在5.50×104～1.20×105CFU·mL-1間，呈先升后降的趨勢，但養(yǎng)殖中后期顯著高于養(yǎng)殖初期；沉積物中的可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量在9.83×105～1.86×106CFU·g-1間，呈不斷上升的趨勢。沉積物中的可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量較同期水體中高 10～100倍。水體中細(xì)菌數(shù)量的變動(dòng)與水溫和養(yǎng)殖生物的代謝有關(guān)，而沉積物中的細(xì)菌數(shù)量除了上述因素影響外，還與有機(jī)質(zhì)等的不斷累積有關(guān)。在相同濃度的磺胺二甲基嘧啶作用下，沉積物中的耐藥細(xì)菌數(shù)量顯著高于同期水體中的耐藥細(xì)菌數(shù)量，高10～100倍。在1000 μg·mL-1高濃度的磺胺二甲基嘧啶中，整個(gè)養(yǎng)殖過程的水樣中都沒有耐藥細(xì)菌的存在，而養(yǎng)殖中后期的沉積物中有 1.10%和 2.92%的耐藥細(xì)菌的出現(xiàn)；在 500 μg·mL-1濃度的磺胺二甲基嘧啶中，養(yǎng)殖前期水樣中沒有出現(xiàn)耐藥細(xì)菌，養(yǎng)殖中后期耐藥細(xì)菌的出現(xiàn)率為0.38%和1.13%，而同期沉積物中均出現(xiàn)耐藥細(xì)菌，分別為0.88%、5.80%和6.81%；在50 μg·mL-1濃度的磺胺二甲基嘧啶中，養(yǎng)殖前中后期水樣中耐藥細(xì)菌的出現(xiàn)率分別為1.13%、2.48%和4.86%，同期沉積物中耐藥細(xì)菌的出現(xiàn)率分別為 14.22%、22.50%和29.57%。由此可以認(rèn)為，養(yǎng)殖池塘的沉積物是養(yǎng)殖環(huán)境中耐藥細(xì)菌的主要存在場所，這與水產(chǎn)養(yǎng)殖中抗生素的使用方式有一定的關(guān)系。在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，抗生素一方面直接潑灑于水體中，另一方面可通過添加于飼料中使用。直接潑灑的抗生素可通過吸附、沉降等方式進(jìn)入沉積物，而未被消化利用的飼料等則直接進(jìn)入了沉積物。這與其它一些研究者的研究報(bào)道是相吻合的（高盼盼等，2009）772。

2.3 水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘中磺胺類耐藥菌株的分離與鑒定

分離自沉積物樣品的耐藥菌株為NHA1401，其在含磺胺二甲基嘧啶50、500和1000 μg·mL-1的營養(yǎng)肉湯瓊脂平板上均能生長，而分離自水樣的耐藥菌株為NHA1402，其在含磺胺二甲基嘧啶50和500 μg·mL-1的營養(yǎng)肉湯瓊脂平板上能生長。這2株菌在營養(yǎng)瓊脂平板上的菌落均為無色半透明狀，呈扁平生長，表面光滑。

將上述菌株培養(yǎng)后用 SK8255（細(xì)菌）試劑盒提取DNA。以耐藥菌株的基因組DNA為模板，利用引物7f（序列5'→3' CAGAGTTTGATCCTGGCT）和1540R（序列5'→3'AGGAGGTGATCCAGCCG CA）對耐藥菌株16S rDNA片斷進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖1。

圖1 耐藥菌株NHA1401和NHA1402的16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig. 1 PCR amplification of NHA1401 and NHA1402 16S rDNA

圖中右側(cè)為耐藥菌株 NHA1401和 NHA1402的16S rDNA的擴(kuò)增片斷，左側(cè)為Marker作為對比。從凝膠成像圖的結(jié)果可以看出，PCR反應(yīng)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物片斷長度約為1400 bp左右，符合16S rDNA的片斷1500 bp左右，NHA1401和NHA1402為同一種類細(xì)菌。

耐藥菌株 NHA1401（或 NHA1402）的 16S rDNA序列分析發(fā)育樹如圖2所示。該菌株與多株奇異變形桿菌的核苷酸同源性較高。

為更好地對菌株進(jìn)行鑒別，利用生理生化反應(yīng)管對菌株NHA1401和NHA1402進(jìn)行生理生化特性分析，所測得菌株的生理生化特征見表3。

由表3可知，菌株NHA1401和NHA1402的尿素酶、過氧化氫酶反應(yīng)為陽性，不液化明膠，可以利用葡萄糖、半乳糖為碳源，可利用葡萄糖銨和苯丙氨酸，還原硝酸。這些生理生化特征與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》等一些專著和報(bào)告對奇異變形桿菌的描述基本吻合（布坎南等，1994；盧雪明等，2010；李欣南等，2011；陳偉峰等，2012）。上述生理生化反應(yīng)結(jié)合 16S rDNA序列分析，NHA1401和NHA1402耐藥菌株均屬于奇異變形桿菌（Proteus mirabilis）。

2.4 水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘中磺胺類耐藥菌株的生長特性

將所篩得的耐藥菌株 NHA1401和 NHA1402接入滅菌的含磺胺二甲基嘧啶0、50、500和1000μg·mL-1的液體營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，于30 ℃的恒溫振蕩連續(xù)培養(yǎng)96 h。從試驗(yàn)開始每隔24 h取樣分析菌液的OD600，菌株生長情況見圖3。

圖2 耐藥細(xì)菌的16S rDNA序列分析發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree construction of sulfonamide resistant bacteria strain based on 16S rDNA sequence analysis

表3 耐藥菌株的生理生化特征Table 3 Physiologic and biochemical characteristics of sulfonamide resistant bacteria

由圖 3（a）可見，分離自沉積物的耐藥細(xì)菌NHA1401菌株在含0～1000 μg·mL-1磺胺二甲基嘧啶的液體營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中均能良好生長，只是生長速率有所不同。當(dāng)磺胺二甲基嘧啶的濃度為50、500 μg·mL-1時(shí)，該菌株的生長速率、生長量略低于不含藥物的空白對照組，但差異不顯著；而當(dāng)磺胺二甲基嘧啶的濃度達(dá)1000 μg·mL-1時(shí)，該菌在48 h內(nèi)的生長速率和生長量顯著受到抑制，24和 48 h的生長抑制率為84.06%和59.91%，但在48～72 h間生長快速，生長速率高于其它組，生長量已接近其它組，抑制率僅為19.02%，至96 h則基本相同，表明該菌株在高濃度藥物的壓力下有一段時(shí)間的適應(yīng)期，前24 h所受的生長壓力較大。由圖3（b）可見，分離自水體的耐藥細(xì)菌NHA1402菌株在含0～500 μg·mL-1磺胺二甲基嘧啶的液體營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中均能良好生長，生長趨勢一致，但隨著藥物濃度的增加，菌株的生長速率和生長量呈一定程度的下降，且在含1000 μg·mL-1磺胺二甲基嘧啶的液體營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中無法生長。生長試驗(yàn)表明，雖然NHA1401和NHA1402菌株均都來自養(yǎng)殖池塘，都屬奇異變形桿菌，但其對磺胺類藥物的耐受能力具有一定的差異，NHA1402菌株顯著弱于NHA1401菌株。曾有研究表明，沉積物中磺胺類藥物的停留時(shí)間和濃度均顯著高于水體，其對菌株耐藥性的誘導(dǎo)強(qiáng)度較高，導(dǎo)致沉積物耐藥菌中抗性基因的表達(dá)水平要高于水體中的耐藥菌（黃志堅(jiān)等，2012；Kim et al.，2007；徐冰潔等，2010），具體的機(jī)制還有待下一步通過抗性基因的表達(dá)研究來加以分析說明。

圖3 耐藥細(xì)菌的生長曲線Fig. 3 The growth curve of sulfonamide resistant bacteria

3 結(jié)論

（1）在 2014年某地南美白對蝦的整個(gè)養(yǎng)殖季節(jié)中，池塘水體中磺胺類的變化呈低—高—低的變化趨勢，養(yǎng)殖前、中、后期水體中磺胺類藥物的平均濃度為0.437、1.691和0.503 ng·mL-1；而沉積物中的磺胺類藥物的含量是逐漸遞增的，養(yǎng)殖前、中、后期的平均含量為2.110、4.059和6.090 ng·g-1，表明養(yǎng)殖池塘環(huán)境中的磺胺類藥物與養(yǎng)殖過程有關(guān)。

（2）整個(gè)養(yǎng)殖過程中池塘水體的可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量在5.50×104～1.20×105CFU·mL-1間，呈先升后降的趨勢，沉積物中的可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量在 9.83×105～1.86×106CFU·g-1間，呈不斷上升的趨勢，均是養(yǎng)殖中后期顯著高于養(yǎng)殖前期，且沉積物中的可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量較同期水體中高 10～100倍。在相同濃度的磺胺二甲基嘧啶作用下，沉積物中的耐藥細(xì)菌數(shù)量顯著高于同期水體中的耐藥細(xì)菌數(shù)量，高出10～100倍，養(yǎng)殖池塘的沉積物是養(yǎng)殖環(huán)境中耐藥細(xì)菌的主要存在場所。

（3）從養(yǎng)殖池塘沉積物和水體中分離到2株磺胺類藥物的耐藥菌株NHA1401和NHA1402，經(jīng)細(xì)菌生理生化分析和菌體16S rDNA序列分析，可以判定NHA1401和NHA1402屬同一種類，為奇異變形桿菌（Proteus mirabilis）。NHA1401和NHA1402菌株在磺胺二甲基嘧啶脅迫下的生長性能表明，磺胺類藥物濃度越大，其對菌株的生長壓力越大，NHA1401菌株對磺胺類藥物的耐受性強(qiáng)于NHA1402菌株。

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Analysis of Sulfonamides Residues and Isolation of Sulfonamides Resistant Strains in the Aquaculture Environment

ZHANG Qianyue1, ZHOU Jianzhong1,2, ZHAO Wanwan1, WU Wei1,3
1. Wuxi Fishery College, Nanjing Agricultural University, Wuxi 214081, China; 2. Fisheries Technology Extension Station in the Wujiang District of Suzhou, Suzhou 215200, China; 3. Freshwater Fisheries Research Center; Key Laboratory of Inland Fishery Eco-environment and Resource, Chinese Academy of Fishery Sciences, Wuxi 214081, China

Water and sediment samples were collected from a vannamei pond during an entire breeding cycle in 2014. Sulfonamide residues and the variations of resistant bacterial strains were analyzed. The relationships between their existence, spatial and temporal distribution, and aquaculture activities, were investigated. The resistant bacterial strains were isolated, identified and their growth performance studied. The results obtained during the entire breeding season indicated that a low-high-low trend of sulfonamides in pond water, with the average concentrations of the early, middle, late culture in water for sulfonamides were 0.437, 1.691 and 0.503 ng·mL-1respectively. The resultant sediment sulfonamide content observed gradual increment as compared to the registered average concentration for the early, middle and late culture stages with 2.110, 4.059 and 6.090 ng·g-1respectively. Bacteria amounts isolated from water were observed to show an increment reduction trend from 1.20×105to 5.50×104CFU·mL-1, while the sediment bacterial amounts registered a rising trend ranging from 9.83×105to 1.86×106CFU·g-1. The sediment cultured bacteria were 10～100 times higher than the water cultured bacteria during the same growing period. Similarly in unified concentration of sulfamethazine, the amounts of resistant bacteria in the sediments were 10～100 times significantly higher than those in water. Two sulfonamides resistant strains NHA1401 and NHA1402 were identified from the pond sediment and water respectively. The microbial physiological and biochemical test results and our analysis of 16S rDNA sequences, suggested that NHA1401 and NHA1402 belonged to the family Proteus mirabilis. Increment of the sulfonamides concentration resulted in the growth of pressure strain NHA1401 and NHA1402. Higher concentrations of sulfonamides resulted in more pressure to the growth of NHA1401 and NHA1402 strains. Our results suggested that NHA1401 had a stronger sulfonamides resistance as compared to the NHA1402 strain. This research shows that sulfonamides are associated with the breeding process in aquaculture ponds and that sediment is the main niche for drug-resistant bacteria in aquaculture environment. It is deemed necessary to strictly control the use of antibiotics for the purpose of protecting the aquatic environment and product quality.

aquaculture; water; sediments; sulfonamides; resistant bacteria; 16S rDNA

10.16258/j.cnki.1674-5906.2015.08.015

X174

A

1674-5906（2015）08-1354-07

張騫月，周建忠，趙婉婉，吳偉. 水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中磺胺類藥物的殘留分析及其耐藥菌株研究[J]. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào), 2015, 24(8): 1354-1360.

ZHANG Qianyue, ZHOU Jianzhong, ZHAO Wanwan, WU Wei. Analysis of Sulfonamides Residues and Isolation of Sulfonamides Resistant Strains in the Aquaculture Environment [J]. Ecology and Environmental Sciences, 2015, 24(8): 1354-1360.

國家水產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估項(xiàng)目（GJFP2014009）

張騫月（1991年生），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槲廴旧鷳B(tài)學(xué)及環(huán)境微生物學(xué)。*通信作者：吳偉（1967年生），男，研究員，主要從事污染生態(tài)學(xué)及環(huán)境生物學(xué)的研究。Email: wuw@ffrc.cn; wuwhz@263.net

2015-05-14