張明錦，張健，紀托未，劉華，李勛，張艷，楊萬勤，陳良華*

1. 長江上游林業(yè)生態(tài)工程重點實驗室//生態(tài)林業(yè)研究所，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，四川 成都 611130；2. 高山森林生態(tài)系統(tǒng)定位研究站//華西雨屏區(qū)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測站，四川 成都 611130；3. 長江上游生態(tài)安全協(xié)同創(chuàng)新中心，四川 成都 611130

林窗對凋落物分解過程中細菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響

張明錦1,2,3，張健1,2,3，紀托未1,2,3，劉華1,2,3，李勛1,2,3，張艷1,2,3，楊萬勤1,2,3，陳良華1,2,3*

1. 長江上游林業(yè)生態(tài)工程重點實驗室//生態(tài)林業(yè)研究所，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，四川 成都 611130；2. 高山森林生態(tài)系統(tǒng)定位研究站//華西雨屏區(qū)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測站，四川 成都 611130；3. 長江上游生態(tài)安全協(xié)同創(chuàng)新中心，四川 成都 611130

基于細菌16S rDNA的PCR-DGGE方法，以林下（US）為對照，研究了長江上游低山丘陵區(qū)人為采伐形成的馬尾松（Pinus massoniana）人工林7種不同大小林窗（G1：100 m2、G2：225 m2、G3：400 m2、G4：625 m2、G5：900 m2、G6：1 225 m2、G7：1 600 m2）在冬夏兩季對凋落物分解過程中細菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響。結(jié)果表明，凋落物中的細菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性受到林窗大小的顯著影響，這種差異性受到季節(jié)的影響。有些菌綱只出現(xiàn)在特定大小的林窗，例如，綠彎菌綱（Chloroflexi）和放線菌綱（Actinobacteria）都只出現(xiàn)在US和G1林窗，芽孢桿菌綱（Bacilli）只出現(xiàn)在大中型（G4～G7）林窗，黃桿菌綱（Flavobacteria）只出現(xiàn)在中型（G4和G5）林窗，浮霉菌綱（Planctomycetacia）只存在于G5、G7和US。冬夏兩季細菌群落結(jié)構(gòu)差異較大，冬季的細菌類群高于夏季。在冬季，細菌群落的多樣性與林窗大小、凋落物含水率、日平均溫度、凋落物的全碳、可溶性有機碳和全氮含量顯著相關(guān)；在夏季，細菌群落的多樣性僅與日平均溫度和全碳含量顯著相關(guān)?？傮w來看，變形菌門是凋落物分解過程中的優(yōu)勢類群，有利于凋落物分解過程中的碳氮循環(huán)。林窗的形成改變了凋落物中的細菌群落結(jié)構(gòu)和組成，減小了凋落物分解過程中細菌群落的豐富度指數(shù)、多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)，但增大了優(yōu)勢度指數(shù)。冬季的細菌群落的豐富度、多樣性和均勻度高于夏季，優(yōu)勢度則低于夏季。

林窗；凋落物分解；細菌群落；多樣性；PCR-DGGE

微生物群落是凋落物分解過程中重要的生物因素，在陸地生態(tài)系統(tǒng)中的生物地球化學(xué)循環(huán)中扮演著重要的角色。已有研究表明，不同微生物群落的生長和發(fā)展可以改變土壤有機質(zhì)的周轉(zhuǎn)和命運（Creamer et al.，2015）。微生物的活動推動著土壤中碳和能量的流動，有研究表明土壤微生物具有很高的多樣性，但相關(guān)的研究較少（Prosser，2002）。微生物群落主要包括真菌和細菌，其豐富度（Bekku et al.，2004）和組成（Lipson et al.，2002；Schadt et al.，2003；Lipson，2007）具有較大的時空變化。這些變化與溫度（Wardle，1998）、水分（Michelsen et al.，2004）和養(yǎng)分有效性（Lipson et al.，2000）等非生物因素變化以及植物養(yǎng)分競爭（Bardgett et al.，2002）、植物與微生物互利共生（Wardle et al.，2004）等生物因素密切相關(guān)。同樣地，微生物群落的變化對凋落物分解、土壤養(yǎng)分循環(huán)的速度和養(yǎng)分的有效性也有影響（Corre et al.，2002）?？梢姡⑸锶郝涞淖兓瘡娏矣绊懼鷳B(tài)系統(tǒng)的功能和生產(chǎn)力（van der Heijden et al.，2008）。微生物群落的變化通?？梢詺w因于水分和溫度的變化，以及碳和氮的可用性等方面（Zhang et al.，1995）。

林窗是森林生態(tài)系統(tǒng)中普遍存在的干擾方式之一，也是森林更新和演替的重要驅(qū)動力之一（Splechtna et al.，2005）。林窗的存在會直接影響太陽輻射量和到達地面的降水量。這些變量的差異影響著林窗和周圍林下的空氣溫度、相對濕度、土壤溫度和土壤含水量。與林下相比，林窗內(nèi)具有更高的太陽輻射量，能夠直接導(dǎo)致空氣溫度、土壤溫度的增加和相對濕度下降（Clinton，2003；Abd Latif et al.，2010）。林窗內(nèi)的非生物和生物條件的變化主要取決于林窗的大小和林窗內(nèi)的位置（Nagel et al.，2010）。一些研究發(fā)現(xiàn)較大的林窗由于太陽輻射的增加，因而具有較高的土壤溫度（Ritter，2005）。但也有研究發(fā)現(xiàn)較小的林窗中植被的保溫效應(yīng)好，因而較更大的林窗具有更高的土壤溫度（Sariyildiz，2008）。土壤水分與林窗大小之間的關(guān)系也并不明確，一些研究發(fā)現(xiàn)為負相關(guān)關(guān)系（Prescott et al.，2003），而有的研究表明兩者沒有關(guān)系（Ritter et al.，2005；Sariyildiz，2008），這些研究的不同結(jié)果可能是因為土壤含水率受較多因素的影響。較大的林窗往往減少了植物的蒸騰作用并且有較高的凈降水量，但同時具有較高的徑流和地面蒸發(fā)量（Gray et al.，2002）。可見，林窗的形成以及不同大小的林窗改變了森林生態(tài)系統(tǒng)中的微氣候環(huán)境，而微生物對周圍環(huán)境條件的變化非常敏感。雖然目前關(guān)于林窗對氣候因子的研究已取得了大量的成果，但關(guān)于林窗對森林凋落物分解過程中細菌群落結(jié)構(gòu)的影響的研究還很少。凋落葉分解過程中細菌群落結(jié)構(gòu)的變化不僅受到溫度、濕度等環(huán)境因子的影響，而且還可能會受到凋落物基質(zhì)養(yǎng)分有效性的影響。因此，有必要針對林窗對凋落物分解過程中細菌群落結(jié)構(gòu)的影響進行深入研究，以進一步認識林窗中微生物對有機質(zhì)分解的作用以及相關(guān)養(yǎng)分和碳循環(huán)的影響。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域概況

研究區(qū)域位于長江上游四川省宜賓市高縣境內(nèi) （ 28°35′45″N～28°36′19″N ， 104°33′37″E～104°34′22″E），地處岷江、金沙江交匯段，海拔高度410～560 m，是典型的低山丘陵地區(qū)；屬于亞熱帶季風(fēng)性濕潤氣候，雨量充沛，雨熱同季；最高氣溫40.3 ℃，最低氣溫-3.7 ℃，年均氣溫18.1 ℃；年均降水量1021.8 mm，相對濕度81%。試驗地位于來復(fù)鎮(zhèn)毛巔坳工區(qū)經(jīng)營小班，地處川云公路中段，總面積約為33.4 hm2。土壤為山地黃壤，成土母巖為黃色砂巖，土壤發(fā)育完善，層次過渡明顯，土壤養(yǎng)分狀況差，缺乏氮和磷。林地為42年生成熟馬尾松人工純林，坡度平緩，坡向S、SE，郁閉度0.7左右。林下灌木主要有枹櫟（Quercus serrata）、黃荊（Vitex negundo）、黃牛奶（Symplocos laurina）、梨葉懸鉤子（Rubus pirifolius）、野桐（Mallotus japonicus）、展毛野牡丹（Melastoma normale）等；草本主要有淡竹葉（Lophatherum gracile）、金星蕨（Parathelypteris glanduligera）、馬唐（Digitaria sanguinalis）、芒（Miscanthus sinensis）、芒萁（Dicranopteris dichotoma）、烏蕨（Stenoloma chusanum）、皺葉狗尾草（Setaria plicata）等。

1.2 樣地設(shè)置

2011年8月在試驗區(qū)域?qū)拥氐闹参锒鄻有?、土壤理化性質(zhì)、林分結(jié)構(gòu)等作初步調(diào)查。2011年10月在踏查基礎(chǔ)上在實驗區(qū)選擇立地條件相近的馬尾松（Pinus massoniana）人工純林進行采伐，形成7種面積不等的近正方形林窗各3個，面積大小分別為G1：100 m2、G2：225 m2、G3：400 m2、G4：625 m2、G5：900 m2、G6：1225 m2、G7：1600 m2，未砍伐的人工林作為對照-US（林下）。林窗斑塊主要位于山體中部和中上坡位，坡向基本為東，坡度為20°～30°，海拔400 m左右，林窗間距大于10 m。將林窗內(nèi)砍伐的樹枝、樹干等殘體移出，但未進行掘根處理。樣地基本情況見表1。

1.3 動態(tài)采樣

在2013年10月下旬凋落物高峰期，在研究區(qū)域收集人工林下新鮮的馬尾松凋落葉，帶回實驗室風(fēng)干。實驗處理采用凋落物袋分解法，凋落物袋大小約為20 cm×20 cm，孔徑0.5 mm。將風(fēng)干的馬尾松凋落葉按每袋10 g裝入凋落物分解袋并封口，在7種不同大小林窗的林窗中心和林窗邊緣2個位置和林下對照放置凋落物分解袋，每種林窗大小和林下對照都設(shè)置了3個重復(fù)樣地，計劃進行7次采樣，每次采樣在每個放置點采 3袋，所以共計（7×2×3+3）×3×7=945袋。于2013年11月中旬，在 7個大小梯度的林窗中心和林窗邊緣及林下對照，去除樣地表面凋落物層，將凋落物樣袋放置于土壤表面，讓凋落葉自然分解。在7個林窗的中心、邊緣及林下的凋落物袋中放入紐扣式溫度記錄器（Button DS1923-F5，Maxim/Dallas Semiconductor，Sunnyvale，CA，USA），每2 h記錄一次溫度數(shù)據(jù)。分別在冬季（2014年2月中旬）和夏季（2014年8月中旬）進行采樣，在每個設(shè)置的樣點各采集3袋凋落物分解袋。將樣品裝入已滅菌的封口聚乙烯袋，并標記，迅速放入冰盒中帶回實驗室。除去樣品中的土壤、根系等雜質(zhì)后，剪碎過2 mm篩，一部分裝入已滅菌的封口聚乙烯袋于 4 ℃保存用于測定細菌群落結(jié)構(gòu)，另一部分烘干用于凋落物含水率、全碳、全氮、全磷和可溶性有機碳的測定。

1.4 測定方法

凋落物 C、N、P含量的測定參照《中華人民共和國林業(yè)行業(yè)標準 LY/T─1999》。全碳用重鉻酸鉀氧化外加熱法測定。樣品用硫酸-高氯酸消煮，用凱式定氮儀（浙江托普儀器有限公司KDN系列）測定全N，用鉬銻抗比色法測定全P。DOC含量的測定步驟如下（王春陽等，2011）：將烘干的植物樣品粉碎過2 mm篩，精確稱取植物樣品0.05 g于20 mL離心管中，加入10 mL蒸餾水，振蕩0.5 h，4000 r·min-1、4 ℃離心 15 min，取上清液在-0.08 MPa下經(jīng)孔徑為0.45 μm濾膜（上海市新亞凈化器件廠生產(chǎn)，使用前首先要用蒸餾水淋洗濾膜，以淋洗濾膜可能殘留的有機組分）過濾，即獲得植物凋落物DOC提取液，4 ℃低溫保存待測液，用TOC分析儀（multi N/C 2100，AnalytikJena）測定待測液中DOC濃度。

凋落物中細菌基因組DNA的提取采用北京艾德萊生物科技有限公司（Aidlab Biotechnologies Co.，Ltd.，China）的SoilPure試劑盒，按操作說明提取并純化，純化后的DNA在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。采用細菌通用引物對總基因組 16S rDNA的V3區(qū)進行PCR擴增，其引物序列為：F338：5′GC-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG3′；R518：5′ATTACCGCGGCTGCTGG3′；F338的5′GC夾子結(jié)構(gòu)為：5′CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGG CCCGCCGCCCCCGCCCC3′。PCR反應(yīng)體系為：25 ng模板、2.5 pmol正反引物，10 μg Bovine Serum Albumin（TaKaRa）、12.5 μL Premix Taq（TaKaRa）、無菌純水補足到25 μL。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸5 min。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物。

PCR 產(chǎn)物檢測后，通過 CBS Denaturing Gradient Gel Electrophoresis System（CBS Scientific Company，Inc）電泳儀進行 DGGE電泳分離。電泳緩沖液為 1×TAE，膠濃度為 8%，變性梯度為40%～70%。PCR產(chǎn)物和6×LoadingBuffer按照5∶1混合均勻后點樣。電泳條件設(shè)置：電壓為100 V，溫度為60 ℃，時間為930 min，電泳結(jié)束后進行銀染，并用 GS-800TM Calibrated Densitometer（Bio-Rad Laboratories，Hercules，USA）進行掃描成像。使用Quantity One（Bio-Rad，Hercules，USA）軟件對 DGGE圖譜進行細菌群落組成結(jié)構(gòu)和多樣性的分析。選擇電泳膠上的優(yōu)勢條帶進行切膠回收，回收DNA用不含GC夾子的引物進行PCR擴增，擴增后進行純化。純化產(chǎn)物連接到pMD19-T載體（TaKaRa），再轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α在培養(yǎng)皿中進行培養(yǎng)，挑陽性單克隆送華大基因研究院進行測序，以確定優(yōu)勢條帶所對應(yīng)的細菌種屬。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

DGGE主要條帶的測序結(jié)果去除載體序列后，在GenBank中進行BLAST分析，找出相似性大于95%的相似序列，以確定條帶所對應(yīng)的細菌類群。用Quantity One軟件分析出各泳道條帶的相對強度后，結(jié)合Blast比對的測序結(jié)果，計算細菌類群在各樣品中的相對比例。用Quantity One軟件對DGGE圖譜進行分析，通過計算各個樣品的Patrick豐富度指數(shù)即條帶數(shù)（S）、Shannon多樣性指數(shù)（H）、Pielou均勻度指數(shù)（EH）、Simpson優(yōu)勢度指數(shù)（C）來評價樣品中細菌群落的多樣性。其中，計算公式如下：

式中，S表示每個泳道檢測到的不同條帶的總和，Pi表示每個泳道中各個條帶的強度占總強度的百分含量。

采用SPSS 17.0作統(tǒng)計分析，用單因素方差分析方法（one-way ANOVA）和Duncan（D）多重比較法檢驗不同季節(jié)凋落物含水率在不同大小林窗間的差異。用配對樣本T檢驗（Paired Sample T test）檢驗不同大小林窗下不同林窗位置處凋落物含水率在冬夏兩季之間的差異。細菌多樣性指數(shù)與環(huán)境因子的相關(guān)關(guān)系采用Pearson法進行分析。數(shù)據(jù)整理和計算采用Microsoft Excel 2007軟件，作圖采用Origin 9.0。

表1 馬尾松人工林不同面積林窗樣地基本概況Table 1 General characteristics in the sampling plots in different size forest gaps of Pinus massoniana plantations

2 結(jié)果與分析

2.1 日平均溫度和凋落物含水率

從采樣當月的日平均溫度來看（表2），在冬季，林窗中心的最低和最高日平均溫度分別是 9.27 ℃（G2）和10.15 ℃（G7），林窗邊緣是8.78 ℃（G5）和10.67 ℃（G6）。在G1～G5林窗，林窗中心的日平均溫度高于林窗邊緣，但在G6和G7，林窗中心的日平均溫度低于林窗邊緣。在夏季，林窗中心的最低和最高日平均溫度分別是 23.81 ℃（G2）和28.10 ℃（G7），林窗邊緣是 22.97 ℃（G2）和26.13 ℃（G3）。林窗中心的日平均溫度都高于林窗邊緣。

表2 采樣當月的日平均溫度Table 2 Average daily temperature in sampling month ℃

從凋落物含水率來看（圖 1所示），在冬季，無論在林窗中心還是林窗邊緣，大型林窗（G6和G7）中的凋落物含水率都只有15.43%～19.78%，顯著低于林下和 G1～G4林窗。在夏季，凋落物的含水率隨林窗大小無顯著變化。在G5～G7和G3林窗中心和邊緣，以及G1林窗中心，凋落物在冬季的含水率顯著低于夏季，其余無顯著差異。

圖1 凋落物含水率Fig. 1 Water content of litter

2.2 細菌群落組成

如圖2所示，從已知的細菌類群來看，在冬季，凋落物中的細菌主要歸屬于變形菌門（ Proteobacteria） 中 的 α-變 形 菌 綱（ Alphaproteobacteria ）、 β-變 形 菌 綱（ Betaproteobacteria ） 、 γ-變 形 菌 綱（Gammaproteobacteria），酸桿菌門（Acidobacteria）的酸桿菌綱（Acidobacteria），異常球菌-棲熱菌門（ Deinococcus-Thermus） 的 異 常 球 菌 綱（Deinococci），擬桿菌門（Bacteroidetes）的鞘脂桿 菌 綱 （ Sphingobacteria） 、 黃 桿 菌 綱（Flavobacteria），厚壁菌門（Firmicutes）的芽孢桿菌綱（Bacilli），綠彎菌門（Chloroflexi）的綠彎菌綱（Chloroflexi），放線菌門（Actinobacteria）的放線菌綱（Actinobacteria），共7大門10大綱。在林窗中心（圖 2a），已知細菌類群只占了16.99%～40.95%。在林窗邊緣（圖2b），已知細菌類群也只有29.12%～65.56%，多數(shù)類群為未知類群。從已知的細菌類群來看，無論是在林窗中心還是林窗邊緣，除了G3林窗是以γ-變形菌綱為優(yōu)勢類群外，其余林窗中心和邊緣以及林下都是以α-變形菌綱為優(yōu)勢類群。在林窗中心，β-變形菌綱只出現(xiàn)在G2～G5林窗；在林窗邊緣，β-變形菌綱也只出現(xiàn)在G2、G3和G5林窗。黃桿菌綱只出現(xiàn)在G4林窗中心和邊緣，以及G5林窗中心。芽孢桿菌綱只出現(xiàn)在G4、G6、G7林窗中心和邊緣，以及G5林窗中心。只有G1林窗中心和邊緣以及US出現(xiàn)了綠彎菌綱和放線菌綱。

圖2 冬季不同林窗內(nèi)凋落物中不同細菌類群的相對含量Fig. 2 Percentage of relative content of different bacterial groups of litter in different forest gap in winter

如圖3所未，從已知的細菌類群來看，夏季凋落物中的細菌主要歸屬于變形菌門（Proteobacteria）的 α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）、β-變形菌綱（ Betaproteobacteria ） 、 γ- 變 形 菌 綱（Gammaproteobacteria），擬桿菌門（Bacteroidetes）的鞘脂桿菌綱（Sphingobacteria），放線菌門（Actinobacteria）的放線菌綱（Actinobacteria），浮霉 菌 門 （ Planctomycetes） 的 浮 霉 菌 綱(Planctomycetacia)，酸桿菌門（Acidobacteria）的酸桿菌綱（Acidobacteria），共5大門7大綱。林窗中心的已知類群占細菌群落的11.14%～57.82%（圖3a），林窗邊緣的已知類群為28.37%～56.59%（圖3b），多數(shù)類群仍為未知類群。從已知的細菌類群來看，在US和G5林窗中心，放線菌綱為優(yōu)勢類群；在G1、G3和G6林窗中心，α-變形菌綱為優(yōu)勢類群；在G2林窗中心，β-變形菌綱占優(yōu)勢類群；在G4和G7林窗中心，γ-變形菌綱所占比例最高。在林窗邊緣，除了G5和G6林窗的優(yōu)勢類群為鞘脂桿菌綱外，其余林窗邊緣的優(yōu)勢類群都是α-變形菌綱。酸桿菌綱只在G1和G3林窗邊緣以及G4林窗中心和邊緣出現(xiàn)，浮霉菌綱只出現(xiàn)在 G5和 G7林窗中心以及US。

圖3 季不同林窗內(nèi)凋落物中不同細菌類群的相對含量Fig. 3 Percentage of relative content of different bacterial groups of litter in different forest gap in summer

表3 細菌群落多樣性指數(shù)Table 3 bacterial community diversity index

2.3 細菌群落多樣性

如表3所示，在冬季，無論在林窗中心還是林窗邊緣，細菌群落的Patrick豐富度指數(shù)和Shannon多樣性指數(shù)除了G1高于林下外，其余林窗都低于林下，且隨著林窗面積的增大，兩者均先減小后增大，其中G4林窗的最小。Simpson優(yōu)勢度指數(shù)與前兩者相反，除了G1林窗略低于林下外，其余林窗都高于林下，且隨著林窗面積的增大先增大后減小，在 G4林窗達到最大。在林窗中心，除了 G1和G6以外，其余林窗的Pielou均勻度指數(shù)都低于林下；在林窗邊緣，除了G1、G6和G7以外，其余林窗也低于林下。在夏季，在林窗中心，除了G4和G6的Patrick豐富度指數(shù)高于林下外，其余林窗都低于林下，Shannon多樣性指數(shù)除了G4高于林下外，其余林窗都低于林下。林窗中心的Pielou均勻度指數(shù)都低于林下，但Simpson優(yōu)勢度指數(shù)都高于林窗。在林窗邊緣，只有G4和G5的Patrick豐富度指數(shù)低于林下。除了 G2和 G3林窗的Shannon多樣性指數(shù)高于林下外，其余林窗都低于林下。Simpson優(yōu)勢度指數(shù)與此相反，除了G2和G3低于林下外，其余林窗都高于林下。在林窗邊緣，除了G3林窗外，其余林窗的Pielou均勻度指數(shù)都低于林下?？傮w來看，林窗的形成減小了凋落物分解過程中細菌群落的 Patrick豐富度指數(shù)、Shannon多樣性指數(shù)和Pielou均勻度指數(shù)，但增大了Simpson優(yōu)勢度指數(shù)。從季節(jié)變化來看，夏季的patrick豐富度指數(shù)、Shannon多樣性指數(shù)和Pielou均勻度指數(shù)低于冬季，但Simpson優(yōu)勢度指數(shù)高于冬季。

2.4 細菌群落多樣性與環(huán)境因子和凋落物化學(xué)質(zhì)量的相關(guān)分析

從相關(guān)性分析結(jié)果來看（表4），在冬、夏兩季，環(huán)境因子和凋落物化學(xué)質(zhì)量對細菌群落結(jié)構(gòu)多樣性的影響差異較大。在冬季，豐富度和多樣性指數(shù)與林窗大小顯著相關(guān)，豐富度指數(shù)還與WC、DOC、N顯著相關(guān)，多樣性指數(shù)與DOC、N呈顯著正相關(guān)，均勻度指數(shù)與WC呈顯著負相關(guān)，與AT、TC呈顯著正相關(guān)，優(yōu)勢度指數(shù)與N呈顯著負相關(guān)。在夏季，細菌群落結(jié)構(gòu)的豐富度、多樣性、均勻度和優(yōu)勢度指數(shù)與林窗大小的相關(guān)性都不顯著，但都與AT顯著相關(guān)，均勻度指數(shù)還與TC顯著相關(guān)。

表4 細菌群落多樣性指數(shù)的相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis of bacterial community diversity index

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

林窗大小是林窗的重要特征之一，不同大小的林窗干擾可能產(chǎn)生不同的森林微環(huán)境（光照、溫度及水分等）（Galhidy et al.，2006），從而影響到土壤養(yǎng)分有效性以及土壤微生物群落等（Muscolo et al.，2007）。在冬季，細菌群落的豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)與林窗大小的相關(guān)性都極顯著（表4）。一些菌綱的細菌類群只出現(xiàn)在特定大小的林窗內(nèi)。這可能與冬季凋落物的含水率隨林窗大小有顯著變化有關(guān)。細菌群落結(jié)構(gòu)不僅在不同大小林窗間有差異，在冬、夏兩季間的差異也很明顯（圖2和圖3）。從已知類群來看，在冬季凋落物分解中，出現(xiàn)了 7大菌門中的 10個菌綱的細菌類群，但在夏季，只出現(xiàn)了5大門中7個菌綱的細菌類群。冬季的細菌類群高于夏季。一方面，可能是因為不同細菌類群的生態(tài)適應(yīng)性有所差異（蒲玲玲，2006；鄭賀云等，

2012）。研究區(qū)域冬夏兩季溫差很大，冬冷夏熱（表2），同時夏季的雨水較多，凋落物的含水率明顯高于冬季（圖1）。另一方面，可能與凋落物養(yǎng)分有效性的改變有關(guān)（Marschner et al.，2011），在本研究中，馬尾松凋落葉中DOC、N、P的平均含量分別從冬季的9.65、10.60、0.45 g·kg-1減少到只有4.40、2.00、0.42 g·kg-1，DOC/TC從0.03減小到0.01，TC/TN從34.75增大到313.99。有研究發(fā)現(xiàn)微生物底物有效性較差，所能支持的微生物類群及數(shù)量相對較少（Taylor et al.，1989）。林窗大小的改變和凋落物分解的不同階段導(dǎo)致的溫度、水分、養(yǎng)分有效性的差異使細菌群落發(fā)生著變化，細菌群落多樣性和結(jié)構(gòu)組成的變化直接關(guān)系到微生物類群的功能和作用（Torsvik et al.，2002；Wellington et al.，2003）。

從已知類群來看，在冬夏兩季，變形菌門、放線菌門、擬桿菌門和酸桿菌門均存在，這說明在調(diào)落物分解過程中，這4類細菌對環(huán)境的適應(yīng)能力和凋落物的分解能力較強。在冬季，變形菌門是凋落物分解過程中的優(yōu)勢菌類群。在夏季，變形菌門、擬桿菌門和放線菌門分別在不同大小林窗的中心和邊緣具有優(yōu)勢地位。細菌種類不同其功能也有所差異，細菌群落組成的變化將直接影響到各種細菌類群不同功能的發(fā)揮（Taylor et al.，1989），以及相互間的互作關(guān)系，從而對各種營養(yǎng)元素的循環(huán)、有機物的分解利用、植物對養(yǎng)分的吸收和生長發(fā)育產(chǎn)生影響。關(guān)于變形菌門的研究發(fā)現(xiàn)變形菌門是土壤中較為豐富的一個細菌門（Janssen，2006；楊鑫等，2008），對全球的碳、氮循環(huán)具有極為重要的作用（Kersters et al.，2006）。變形菌門在凋落物分解過程中的優(yōu)勢地位有利于凋落物分解過程中的碳氮循環(huán)。馬尾松分解過程中的擬桿菌主要以黃桿菌綱和鞘脂桿菌綱為主，該類菌群也是調(diào)落物分解過程中的重要細菌類群，這類細菌對凋落物中纖維素的降解起著重要作用（趙野逸，2013）。放線菌能促使凋落物迅速腐爛，在氮素循環(huán)中起著重要作用。在冬季，不同大小林窗內(nèi)凋落物中的優(yōu)勢細菌類群都屬于變形菌門。但到了夏季，不同大小林窗內(nèi)的優(yōu)勢細菌類群出現(xiàn)了差異，且不同細菌類群的相對含量也有很大變化。這說明隨著馬尾松凋落葉分解，不同大小的林窗對凋落物中細菌群落結(jié)構(gòu)有著顯著影響，進而可能會影響凋落物的分解過程。

從細菌群落多樣性的相關(guān)性分析可以看出，環(huán)境因子和凋落物質(zhì)量與細菌群落結(jié)構(gòu)多樣性的相關(guān)性在冬夏兩季之間差異很大（表4）。在冬季，細菌多樣性不僅與WC和AT顯著相關(guān)，同時與TC、DOC和N也有著很強的相關(guān)性。前人的研究也表明土壤溫度（Rinnan et al.，2007；Frey et al.，2008；Feng et al.，2009）、碳氮的可利用性（Hogberg et al.，2007；Ushio et al.，2008）影響著土壤微生物群落。而在夏季，除了均勻度指數(shù)與TC有顯著的相關(guān)性，其余指數(shù)只與AT有顯著的相關(guān)性。WC和AT的變化受林窗大小的影響，而TC、DOC和N含量作為凋落物基質(zhì)的基本特征，隨凋落物分解過程不斷發(fā)生改變。細菌主要通過對凋落物的分解而獲取碳源和氮源，隨著凋落物的分解，凋落物的可溶性有機碳（DOC）、全氮（N）等分解逐漸釋放，含量不斷減少，養(yǎng)分有效性降低，進而導(dǎo)致可供細菌利用的能源物質(zhì)減少，對細菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性影響也逐漸減小（周曉慶等，2011）

3.2 結(jié)論

綜上所述，人工林窗的形成對凋落物中細菌群落的多樣性有著顯著影響。林窗的形成減小了凋落物分解過程中細菌群落的豐富度指數(shù)、多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)，但增大了優(yōu)勢度指數(shù)。從季節(jié)變化來看，夏季的豐富度指數(shù)、多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)都低于冬季，但優(yōu)勢度指數(shù)高于冬季。由于冬、夏兩季氣候特征的差異以及凋落物分解引起的自身有機質(zhì)和養(yǎng)分含量的變化導(dǎo)致了冬、夏兩季凋落物分解過程中細菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的差異。相同氣候下不同大小林窗的形成使得在林窗內(nèi)形成了不同的微氣候環(huán)境，微氣候環(huán)境的差異能在一定程度上改變凋落物分解過程中的細菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性，進而影響到森林生態(tài)系統(tǒng)中的物質(zhì)和能量循環(huán)。雖然林窗的形成導(dǎo)致了細菌菌落結(jié)構(gòu)的改變，但由于對很多細菌類群的生物學(xué)和生態(tài)學(xué)特性的研究還相對缺乏，因此林窗與細菌群落之間的關(guān)系有待進一步研究。

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Influence of Forest Gap on Bacterial Community Structure and Diversity during Litter Decomposition

ZHANG Mingjin1,2,3, ZHANG Jian1,2,3, JI Tuowei1,2,3, LIU Hua1,2,3, LI Xun1,2,3, ZHANG Yan1,2,3, YANG Wanqin1,2,3, CHEN Lianghua1,2,3*
1. Key laboratory of Ecological Forestry Engineering of Sichuan Province//Institute of Ecology & Forest, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China; 2. Long-term Research Station of Alpine Forest Ecosystems//Monitoring Station for Eco-environments in the Rainy Zone of SW China, Chengdu 611130, China; 3. Collaborative Innovation Center of Ecological Security in the Upper Reaches of Yangtze River, Chengdu 611130, China

The research on the bacterial community structure and diversity in litter in winter and summer was based on polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE) for 16S rDNA in seven gap sizes of a Pinus massoniana plantation (G1: 100 m2, G2: 225 m2, G3: 400 m2, G4: 625 m2, G5: 900 m2, G6: 1 225 m2, G7: 1 600 m2) in a hilly area of the upper Yangtze River. Results indicated that the bacterial community structure and diversity in litter were influenced by gap size, and this difference was also affected by the seasons. Some bacteria classes only appeared in forest gap of certain size, for example, Chloroflexi and Actinobacteria only appeared in US and G1, Bacilli only appeared in large and medium-sized (G4 to G7) forest gap, Flavobacteria only appeared in medium-sized (G4 and G5) forest gap, Planctomycetacia only existed in G5, G7 and US. The difference of bacteria community structure between winter and summer was very big. The bacteria groups of winter were more than summer. In winter, the diversity of bacterial community showed very close correlation with gap size, litter water content, daily average temperature, total carbon, dissolved organic carbon and total nitrogen content of litter; in summer, it was only related to daily average temperature and total carbon content of litter. Overall, Proteobacteria was the dominant in the process of litter decomposition, was conducive to the cycle of carbon and nitrogen in the process of litter decomposition. The formation of forest gap changed bacterial community structure and composition in litter, reduced the richness index, diversity index and evenness index of bacterial community in the process of litter decomposition, but increased the dominance index. Richness, diversity and evenness of bacterial community in winter were higher than those in summer, but dominance was lower than that in summer.

forest gap; litter decomposition; bacterial community; diversity; PCR-DGGE

10.16258/j.cnki.1674-5906.2015.08.005

Q948；X171.1

A

1674-5906（2015）08-1287-08

張明錦，張健，紀托未，劉華，李勛，張艷，楊萬勤，陳良華. 林窗對凋落物分解過程中細菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響[J]. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報, 2015, 24(8): 1287-1294.

ZHANG Mingjin, ZHANG Jian, JI Tuowei, LIU Hua, LI Xun, ZHANG Yan, YANG Wanqin, CHEN Lianghua. Influence of Forest Gap on Bacterial Community Structure and Diversity during Litter Decomposition [J]. Ecology and Environmental Sciences, 2015, 24(8): 1287-1294.

國家自然科學(xué)基金項目（31370628）；國家科技支撐計劃項目（2011BAC09B05）；四川省科技支撐計劃項目（12ZC0017）；四川省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)項目（2012JY0047）；四川省教育廳科技創(chuàng)新團隊計劃項目（11TD006）

張明錦（1990年生），碩士研究生，主要從事退化人工林生態(tài)恢復(fù)與重建研究。E-mail: 958192283@qq.com *通信作者：陳良華（1982年生），副研究員，研究生導(dǎo)師，主要從事植物生理生態(tài)，生態(tài)環(huán)境修復(fù)等研究。E-mail: chenlh@sicau.edu.cn

2015-06-01