馬艷秋，鄭喜群,*，劉曉蘭，孫 琪

（1.齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾大學(xué) 黑龍江省普通高校農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑 龍江 齊齊哈爾 161006）

玉米蛋白酶解物的解酒作用

馬艷秋1,2，鄭喜群1,2,*，劉曉蘭1,2，孫 琪1

（1.齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾大學(xué) 黑龍江省普通高校農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑 龍江 齊齊哈爾 161006）

采用堿性蛋白酶Alcalase和復(fù)合蛋白酶Protamex分步對(duì)膨化的玉米蛋白粉進(jìn)行酶解改性，應(yīng)用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的方法研究玉米蛋白酶解物的解酒作用。結(jié)果表明：玉米蛋白酶解物中分子質(zhì)量小于1 000 u的組分占87.76%，含有較高比例的谷氨酸、亮氨酸和丙氨酸；與酒精模型組相比，雙酶酶解得到的玉米蛋白酶解物可使小鼠血液中乙醇含量降低59.43%；在一定時(shí)間范圍內(nèi)，玉米蛋白酶解物可以提高小鼠胃中乙 醇脫氫酶和肝臟中超氧化物歧化酶活性，降低肝臟中丙二醛含量，增加谷胱甘肽含量。

玉米蛋白酶解物；解酒作用；雙酶分步酶解

中國(guó)是酒的故鄉(xiāng)，無(wú)酒不成席。近年來(lái)，過(guò)度飲酒導(dǎo)致了許多急性或慢性疾病[1]，人們逐漸開(kāi)始關(guān)注酒的保健問(wèn)題。研究顯示，人體攝入含有大量氨基酸或多肽的蛋白產(chǎn)品對(duì)酒精代謝有促進(jìn)作用[2]。

玉米蛋白粉（corn gluten meal，CGM）是玉米濕法生產(chǎn)淀粉的主要副產(chǎn)物，其含有62%～74%的蛋白質(zhì)。玉米蛋白氨基酸組成不平衡、水溶性差，這一特點(diǎn)限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用[3-4]。但是，與其他谷物蛋白相比，玉米蛋白含有高比例的亮氨酸、丙氨酸和異亮氨酸等疏水性脂肪族氨基酸，在其多肽鏈中存在抗氧化、抗高血壓，促酒精代謝等的功能序列區(qū)[5-8]，采用必要的改性方法，可以使其功能特性釋放出來(lái)，用于開(kāi)發(fā)功能食品。

玉米蛋白的結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，這使其改性具有一定難度[9]。本研究首先用擠壓膨化的方法預(yù)處理CGM，使維系其高級(jí)結(jié)構(gòu)的次級(jí)鍵力減弱，玉米蛋白部分變性[10-11]，再采用蛋白酶對(duì)其改性，研究玉米蛋白酶解物（corn protein hydrolysate，CPH）的解酒作用，為蛋白類解酒產(chǎn)品的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

CGM 黑龍江龍鳳玉米開(kāi)發(fā)有限公司；ICR小鼠長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司。

堿性蛋白酶Alcalase、復(fù)合蛋白酶Protamex 丹麥諾維信公司；52°紅星二鍋頭白酒 北京紅星股份有限公司；海王金樽 深圳市海王健康科技發(fā)展有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DS32-Ⅱ型雙螺桿擠壓膨化機(jī) 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；GC-2010型氣相色譜儀 日本島津公司；L-8800型氨基酸自動(dòng)分析儀 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 CGM的擠壓膨化處理

CGM過(guò)80 目篩，調(diào)節(jié)其含水量至16%，放置過(guò)夜后用DS32-Ⅱ型雙螺桿擠壓膨化機(jī)擠壓膨化，膨化機(jī)工作參數(shù)設(shè)置為溫度160 ℃，壓力1 MPa。將膨化后的CGM干燥、粉碎，過(guò)80 目篩，作為原料待用。

1.3.2 CGM的酶解

用蛋白酶Alcalase和Protamex分步酶解質(zhì)量濃度為5 g/mL的CGM，以A酶單酶酶解做對(duì)照。Alcalase加酶量為3%，反應(yīng)溫度為60 ℃，pH 8.5，酶解時(shí)間為120 min；Protamex加酶量為1%，反應(yīng)溫度為50 ℃，pH 7.0，酶解時(shí)間為180 min。第一階段酶解（Alcalase）之后，調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH值 至7.0，加入蛋白酶Protamex，繼續(xù)酶解CGM。水解度的測(cè)定采用pH-stat法[10]。

1.3.3 CPH的分子質(zhì)量分布測(cè)定

采用凝膠色譜法測(cè)定CPH的分子質(zhì)量分布。稱取2 mg樣品溶于1 mL 0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0），樣液于4 ℃條件下10 000 r/min離心10 min，再用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾。取100 μL樣液進(jìn)行 Superdex peptide PE 10/300 GL（10 mm×300 mm，13 μm）凝膠色譜，用含有0.15 mol/L NaCl的0.02 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）洗脫，流速為0.25 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm。蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)如下：藍(lán)色萄聚糖2000（2 000 ku）、Aprotinine（6 511.51 u）、桿菌肽（1 422.69 u）、氧化型谷光甘肽（612.63 u）、還原型谷光甘肽（307.32 u）。色譜柱外水體積采用藍(lán)色萄聚糖2000進(jìn)行測(cè)定。以蛋白標(biāo)準(zhǔn)物分子質(zhì)量對(duì)數(shù)值（lgMr）為 縱坐標(biāo)，有效分配系數(shù)（Kav）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為lgMr=－3.503 4Kav+4.694 5（R2=0.983）。

1.3.4 CPH的氨基酸組成測(cè)定

采 用氨基酸自動(dòng)分析儀對(duì)CPH進(jìn)行氨基酸組成分析，采用氨基酸的變化系數(shù)（t）表示樣品間的差異性，計(jì)算公式如下。

式中：Ai為CPH的各氨基酸含量占總氨基酸總量的 百分?jǐn)?shù)/%；A0為CGM的各氨基酸含量占總氨基酸總量的百分?jǐn)?shù)/%。

1.3.5 CPH解酒作用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

將體質(zhì)量20 g的ICR小鼠常規(guī)飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為4 組，每組10 只，4 組分別為空白組、酒精模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和CPH組，分別標(biāo)記為B、M、P和C。

CPH組按小鼠體質(zhì)量給予8 mg/g劑量CPH，陽(yáng)性對(duì)照組按小鼠體質(zhì)量給予1.5 mg/g劑量陽(yáng)性藥物（海王金樽），空白組和酒精模型組按小鼠體質(zhì)量給予生理鹽水，30 min后，除空白組，其余3 組均按3.5 mL/kg的劑量灌服52°白酒，開(kāi)始計(jì)時(shí)。

4 組小鼠分別于計(jì)時(shí)后的5、15、30、45、60、75 min摘取眼球取血，采用氣相色譜法測(cè)定全血中乙醇質(zhì)量濃度；同時(shí)取肝臟和胃組織冷凍保存，由南京建成生物工程研究所完成組織中乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）酶活力、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）酶活力、還原型谷胱甘肽（glutataione，GSH）含量和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用表示，利用Duncan極差檢驗(yàn)評(píng)價(jià)樣品平均值間的顯著性差異（P＜0.05），應(yīng)用Origin 8.6統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 CGM的分步酶解

圖1 Alcalase和Protamex酶解擠壓膨化CGM的水解度Fig.1 Degree of hydrolysis (DH) of extruded CGM by Alcalase and Protamex

由圖1可知，在酶解初期，Alcalase酶解反應(yīng)速率很快，隨后逐漸減慢，到2 h時(shí)反應(yīng)基本停滯。再加入Protamex酶，水解度迅速提高后又趨于平緩，與Alcalase單酶酶解相比水解度增加了4.97%?？赡苁且?yàn)镃GM在Alcalase酶作用后，會(huì)暴露出利于Protamex酶的酶切位點(diǎn)，所以水解度有所提高，達(dá)到34.14%。

2.2 CPH的分子質(zhì)量分布

經(jīng)計(jì)算，CPH中分子質(zhì)量小于1 000 u的組分占87.76%，說(shuō)明CGM通過(guò)蛋白酶水解作用后，得到含有高比例小分子質(zhì)量多肽的混合物，這些低肽更有利于人體的消化吸收[12]，同時(shí)，這些小分子質(zhì)量的CPH通常具有特殊的生理活性，如抗氧化、抗高血壓、醒酒等作用[5-8]。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)蛋白（a）和CPH（b）的凝膠色譜圖Fig.2 Gel fi ltration chromatograms of standard proteins (a) and CPH (b)

2.3 CPH氨基酸組成

表1 CPH的氨基酸組成Table 1 Amino acid composition of CPH

實(shí)驗(yàn)測(cè)定了CPH的17 種氨基酸含量，結(jié)果見(jiàn)表1。與CGM相比，CPH的氨基酸組成發(fā)生變化，Cys、His和Ile比例減少，Arg比例增大，酶解作用對(duì)氨基酸組成的影響順序?yàn)镠is＞Arg＞Cys＞Ile。極性氨基酸比例有所增加，堿性氨基酸比例減小，而酸性氨基酸無(wú)明顯變化。本實(shí)驗(yàn)酶解參數(shù)下制得的CPH含有高比例的Glu、Leu和Ala，而Cys、Lys和His含量較低。研究發(fā)現(xiàn)，在酒精代謝過(guò)程中，氨基酸可以發(fā)揮一定作用，其中，Ala和Leu的大量供應(yīng)生成丙酮酸，驅(qū)動(dòng)NAD+生成系統(tǒng)，使NAD+供給量增加，促進(jìn)乙醇代謝進(jìn)入三羧酸循環(huán)系統(tǒng)，進(jìn)而加快乙醇的代謝進(jìn)程[13]。因此，攝入富含Ala和Leu的CPH具有促進(jìn)人體內(nèi)酒精代謝的潛力。

2.4 CPH的解酒作用

2.4.1 小鼠血液中乙醇質(zhì)量濃度的變化

表2 小鼠血液中乙醇含量Table 2 Effect of CPH administration on blood ethanol concentrations of mice mg/100 mL

由表2可知，酒精模型組小鼠血液中乙醇含量在5 min時(shí)為最大值，而CPH組在30 min到達(dá)最大值，同時(shí)，CPH組每一時(shí)間點(diǎn)血醇含量均低于酒精模型組，經(jīng)計(jì)算5 min時(shí)CPH組小鼠血液中乙醇含量與酒精模型組相比降低59.43%；15～45 min之間，CPH組小鼠血醇含量隨時(shí)間變化不明顯，而酒精模型組小鼠血醇含量隨時(shí)間迅速下降，60 min時(shí)，二者含量趨于一致，變化不顯 著。這些結(jié)果表明，CPH能夠推遲乙醇進(jìn)入血液的速率，同時(shí)減少進(jìn)入血液的乙醇的量，這可能與CPH影響胃腸對(duì)乙醇的吸收有關(guān)。

2.4.2 小鼠肝臟中ADH活性

表3 小鼠肝臟中ADH酶活力Table 3 Effect of CPH administration on ADH activities in mouse liverTable 3 Effect of C U/mg pro

ADH是一種含鋅酶類，主要存在于生物的肝臟中，它以NAD+為輔酶，催化伯醇和醛之間的可逆反應(yīng)，是生物體內(nèi)主要短鏈醇代謝的關(guān)鍵酶[14-15]。小鼠肝臟中ADH活性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。除15 min陽(yáng)性對(duì)照組外，每一時(shí)間點(diǎn)4 個(gè)實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟中ADH活性變化均不顯著，說(shuō)明肝臟中ADH活性不受酒精及CPH含量的影響。

2.4.3 小鼠胃中ADH活性

除肝臟中含有ADH，胃中也有ADH的存在，在胃黏膜上存在的ADH能夠代謝酒精，參與首過(guò)效應(yīng)[16]。小鼠胃中ADH活性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。與酒精模型組比較，除75 min外，CPH組小鼠胃中ADH活性顯著升高，表明CPH能夠使胃中ADH活性增強(qiáng)，該結(jié)果與血液中乙醇含量測(cè)定結(jié)果相一致，表明CPH可能屬于胃腸吸收抑制劑型解酒食品[17]，通過(guò)提高胃中ADH活性，抑制胃腸對(duì)酒精的吸收作用，減少血液中酒精含量，從而降低酒精對(duì)機(jī)體的損害作用。于國(guó)才等[18]發(fā)現(xiàn)在體外玉米肽可以激活A(yù)DH的活性。

表4 小鼠胃中ADH酶活力Table 4 Effect of CPH administration on ADH activities in mouse stomach U/mg pro

2.4.4 小鼠肝臟中SOD活性

表5 小鼠肝臟中SOD酶活力Table 5 Effect of CPH administration on SOD activities in mouse liverTable 5 Effect of CU/mg pro

酒精代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量自由基，如O2－、·OH、H2O2、C2H5O－等，這些自由基會(huì)形成自由基反應(yīng)，最終造成暈眩、頭痛、局部皮膚過(guò)敏、腸胃不適等酒后癥狀[19]。SOD是人體重要的清除自由基的酶，小鼠肝中SOD活性結(jié)果見(jiàn)表5。與空白組相比，酒精模型組SOD活性顯著降低，這是因?yàn)榫凭?謝中生成中間產(chǎn)物H2O2，H2O2能夠破壞SOD活性中心的金屬配位場(chǎng)，引起酶受損，導(dǎo)致酶活力下降[20]。5～60 min內(nèi)，相對(duì)于酒精模型組，除60、75 min外，CP H組和陽(yáng)性對(duì)照組均可顯著提高肝臟中SOD活性，從而快速清除自由基，減慢自由基反應(yīng)，減輕酒后不良癥狀。

實(shí)驗(yàn)測(cè)定CPH對(duì)小鼠肝臟中過(guò)氧化氫酶及谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶活性的影響（未顯示數(shù)據(jù)），結(jié)果顯示CPH對(duì)這兩種酶活性均無(wú)顯著影響。

2.4.5 小鼠肝臟中MDA含量

表6 小鼠肝臟中MDA含量Table 6 Effect of CPH administration on MDA concentrations in mouse liverTable 6 Effect of CPH anmol/mg pro

MDA是氧自由基和生物膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物，其含量變化可間接反映組織中氧自由基的含量；MDA會(huì)引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，具有細(xì)胞毒性，也會(huì)影響線粒體呼吸鏈復(fù)合物及線粒體內(nèi)關(guān)鍵酶活性[21]，小鼠肝中MDA含量結(jié)果見(jiàn)表6。與空白組相比，酒精模型組MDA含量有所增加，30 min時(shí)，MDA含量顯著升高。與酒精模型組相比，CPH可顯著降低肝臟中MDA的含量，表明CPH可以降低酒后產(chǎn)生的MAD對(duì)機(jī)體的危害，該結(jié)果也間接表明CPH可降低肝臟中氧自由基的含量。

2.4.6 小鼠肝臟中GSH含量

表7 小鼠肝臟中GSH含量Table 7 Effect of CPH administration on GSH concentrations in mouse liver nmol/mg pro

GSH的結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)活潑的巰基，易被氧化脫氫，這一特異結(jié)構(gòu)使其成為體內(nèi)主要的自由基清除劑[22]。小鼠肝中GSH含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表7。在5 min時(shí)，CPH組較酒精模型組GSH含量顯著升高，較空白組變化不顯著，陽(yáng)性對(duì)照組較酒精模型組變化不顯著；與空白組相比較，酒精模型組肝臟中GSH含量在5～30 min之間顯著降低，表明代謝初期，乙醇可產(chǎn)生大量自由基，消耗還原型GSH，使其含量下降；相對(duì)于酒精模型組，CPH組GSH含量在5～30 min之間有顯著提高，表明CPH對(duì)乙醇降低的GSH含量有提高作用，從而減少酒精產(chǎn)生的自由基，降低醉酒對(duì)機(jī)體的危害。

3 結(jié) 論

在本實(shí)驗(yàn)的酶解工藝下，可獲得水解度為34.14%，富含丙氨酸及亮氨酸的短肽鏈CPH，CPH能夠有效地降低血液中乙醇質(zhì)量濃度，具有良好的解酒作用；在解酒機(jī)制方面，實(shí)驗(yàn)制得的CPH屬于胃腸吸收抑制劑型解酒食品，抑制胃腸對(duì)乙醇的吸收作用，減少血液中乙醇質(zhì)量濃度，減少自由基含量，從而降低乙醇對(duì)機(jī)體的損害作用。

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Anti-alcoholism Effects of Corn Protein Hydrolysate

MA Yanqiu1,2, ZHENG Xiqun1,2,*, LIU Xiaolan1,2, SUN Qi1
(1. College of Food and Biological Engineering, Qiqihar University, Qiqihar 161006, China; 2. Key Constructive Laboratory of Processing Agricultural Products of Heilongjiang Province Normal University, Qiqihar University, Qiqihar 161006, China)

The enzymatic hydrolysate of extruded corn gluten produced by sequential hydrolysis with Alcalase and Protamex was evaluated for its anti-alcoholism effect in mice. The results showed that the hydrolysate contained 87.76% peptides which molecular weight is less than 1 000 u, and was richer in glutamic acid, leucine and alanine than corn gluten. Gavage administration of the enzymatic hydrolysate resulted in a 59.43% reduction in blood alcohol concentrations in mice when compared with the model group. Moreover, this hydrolysate increased alcohol dehydrogenase (ADH) activity in the stomach of mice, and enhanced superoxide dismutase (SOD) activity and glutataione (GSH) content but reduced malondialdehyde (MDA) content in the liver within a certain time range.

corn protein hydrolysate; anti-alcoholism effects; sequential two-enzyme hydrolysis

TS210.9

A

1002-6630（2015）01-0191-05

10.7506/spkx1002-6630-201501036

2014-08-11

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31071629）；黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（12521606）

馬艷秋（1987—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)。E-mail：mayanqiu908@163.com

*通信作者：鄭喜群（1963—），男，教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工及應(yīng)用酶學(xué)。E-mail：zhengxiqun@126.com