孫一帆，黃建芳，向軍儉，王彩霞，陳成楓

（暨南大學(xué) 廣東省分子免疫與抗體工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510632）

凡納濱對蝦過敏原精氨酸激酶的質(zhì)譜鑒定及其免疫交叉反應(yīng)研究

孫一帆，黃建芳，向軍儉*，王彩霞，陳成楓

（暨南大學(xué) 廣東省分子免疫與抗體工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510632）

目的：鑒定凡納濱對蝦分子質(zhì)量40 kD過敏原，并分析其在有殼水產(chǎn)食物中的免疫交叉反應(yīng)。方法：運(yùn)用基質(zhì)輔助激光解析串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（matrix assisted laser desorption ionization/time of fl ight mass spectrometry，MALDI-TOF/TOF-MS）鑒定凡納濱對蝦40 kD過敏原組分；使用軟件BLAST、Clustal X2、MEGA 5.0分析該蛋白氨基酸序列的種間同源性；制備抗凡納濱對蝦過敏原精氨酸激酶的多克隆抗體，并與17 種常見有殼水生動(dòng)物粗提液進(jìn)行Western blotting，以分析該過敏原的免疫交叉反應(yīng)。結(jié)果：凡納濱對蝦40 kD過敏原為精氨酸激酶（arginine kinase，AK）；其氨基酸序列同源性分析顯示AK在蝦類（96%～100%）、蟹類（91%～93%）、貝類（49%～52%）、蟑螂（83%）中具有很高的同源性；Western blotting結(jié)果顯示抗AK多抗與17 種不同蝦類、蟹類、貝類的AK均能發(fā)生反應(yīng)。結(jié)論：精氨酸激酶在甲殼類動(dòng)物、軟體動(dòng)物、甚至昆蟲中具有高度保守性，且能引起強(qiáng)免疫交叉反應(yīng)，是有殼水生動(dòng)物中的一種泛過敏原。

凡納濱對蝦；過敏原；精氨酸激酶；質(zhì)譜；序列同源性；免疫交叉反應(yīng)

過敏癥是一個(gè)長期威脅人們生命與健康的重要問題。2001年，在聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織公布的八大類主要過敏食物中，蝦蟹等甲殼類食物是其中重要一類[1]。在一些沿海國家例如中國，因食用有殼水產(chǎn)食物而導(dǎo)致過敏的消費(fèi)者在逐年增多[2]。

有殼水生動(dòng)物主要包括以蝦、蟹為代表的甲殼類動(dòng)物和以貝類為主的軟體動(dòng)物，其中蝦是最廣泛報(bào)道的水產(chǎn)過敏食物。近年來，國內(nèi)外的許多學(xué)者對甲殼類過敏原進(jìn)行了大量研究，尤其是針對蝦中的主要過敏原——36 kD原肌球蛋白（tropomysin，TM）的研究最為透徹，現(xiàn)已證明原肌球蛋白是蝦中致敏性最強(qiáng)的過敏原[3]。此外，被國際免疫學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)認(rèn)定的甲殼類食物過敏原還有21 kD的肌 質(zhì)鈣結(jié)合蛋白（sarcoplasmic calciumbinding protein，SCP）[4]、40 kD的精氨酸激酶（argininekinase，AK）[5]，以及肌球蛋白輕鏈（myosin light chain，MLC）[6]。2011年，血藍(lán)蛋白（hemocyanin，Hc）被鑒定為甲殼類食物中的一種新型過敏原[7]。已知蝦的36 kD原肌球蛋白在有殼水生動(dòng)物及蟑螂、塵螨等昆蟲間都存在強(qiáng)交叉反應(yīng)，所以當(dāng)蝦過敏患者食用蝦以外有殼水產(chǎn)食物后，常會(huì)因原肌球蛋白的交叉反應(yīng)性而引發(fā)過敏癥狀[8-9]。同原肌球蛋白相似，已發(fā)現(xiàn)AK在蝦以外的物種如鋸緣青蟹和章魚中也存在交叉反應(yīng)[5,10]，這就意味著精氨酸激酶可能是另一種種間高度保守的交叉過敏原。

在前期的研究工作中，通過對蝦蟹過敏患者血清樣本分析，鑒定出凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）中的40 kD蛋白組分是一種重要的過敏原[11]，并對其進(jìn)行分離純化。本研究對該過敏原進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，并通過使用生物信息學(xué)同源性分析和制備特異性鼠多克隆抗體，研究該過敏原在17 種常見有殼水產(chǎn)食物中的交叉反應(yīng)，以期探明該過敏原的分布和種屬間親緣關(guān)系，為預(yù)防和控制蝦蟹等有殼水產(chǎn)食物引發(fā)過敏癥提供參考信息，為過敏原交叉反應(yīng)的研究和廣譜脫敏疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

昆明小鼠購自南方醫(yī)院動(dòng)物中心。

17 種鮮活的蝦、蟹、貝類：凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）、刀額新對蝦（Metapenaeus ensis）、斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）、中國明對蝦（Fenneropenaeus chinensis）、日本對蝦（Penaeus japonicus）、羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）、口蝦菇（Oratosquilla oratoria）、克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）、三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）、鋸緣青蟹（Scylla serrata）、銹斑鱘（Charybdis feriata）、中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）、文蛤（Meretrix meretrix）、花蛤（Ruditapes philippinarum）、方斑東風(fēng)螺（Babyloniaareolata）、雜色鮑（Abalone）、竹蟶（Solen strictus）均購自廣州黃沙水產(chǎn)市場；精氨酸激酶由凡納濱對蝦粗提液中提取純化所得。

胰酶 美國Promega公司；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記羊抗小鼠IgG二抗 美國KPL公司；蛋白質(zhì)Marker 加拿大Fermentas公司；PVDF膜 美國Millipore公司；ECL試劑盒 美國Pierce公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Ultraflex MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀 美國Bruker Daltonics公司；Multiskan MK3酶標(biāo)儀 美國Thermo Fisher公司；MiniProtein II垂直電泳儀、電轉(zhuǎn)儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 質(zhì)譜鑒定與分析

將純化的凡納濱蝦40 kD過敏原進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE），將目的蛋白條帶切碎進(jìn)行膠內(nèi)蛋白酶切，酶切后的混合肽用Ultraflex基質(zhì)輔助激光解析串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（matrix assisted laser desorption ionization/time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF/TOF-MS）鑒定分析，質(zhì)譜測定條件設(shè)定為：N2激光源，波長337 nm，加速電壓25 kV，采用正離子和自動(dòng)獲取數(shù)據(jù)的模式，肽質(zhì)量指紋圖譜（peptide mass fingerprinting，PMF）質(zhì)量掃描范圍為800～4 500，取強(qiáng)度最大的峰進(jìn)行串級質(zhì)譜分析，圖譜用Bruker專用的Peptide Calibration Standard進(jìn)行外標(biāo)校正。使用Mascot（http://www.matrixscience.com）中的串級質(zhì)譜數(shù)據(jù)搜索功能（MS/MS Ions Search）與數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)肽段的質(zhì)量數(shù)及其串級質(zhì)譜圖譜在NCBInr數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行相關(guān)性比較檢索鑒定，搜索參數(shù)：切割酶Trypsin，允許最大未酶切位點(diǎn)（missed cleavage）數(shù)為1，固定修飾carbamidomethyl，可變修飾oxidation，質(zhì)譜的誤差10－4，二級質(zhì)譜誤差0.6 D。

1.3.2 序列同源性分析

以質(zhì)譜鑒定結(jié)果所得凡納濱對蝦40 kD過敏原的氨基酸序列為查詢序列，對GenBank中的非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLASTp分析，使用Clustal X2和MEGA 5.0程序進(jìn)行多序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3.3 過敏原特異性鼠多克隆抗體的制備與鑒定

純化的凡納濱對蝦40 kD過敏原1.5 mg/mL，與等體積弗氏完全佐劑充分混勻形成油包水乳化物，腹股溝、背部皮下多點(diǎn)及腹腔免疫昆明小鼠（0.2 mL/只）；此后每兩周用弗氏不完全佐劑以同樣劑量和方式加強(qiáng)免疫小鼠，重復(fù)3 次；末次免疫的10 d后，小鼠摘眼球采血，血液于37 ℃放置1 h，4 ℃放置4 h以上，然后4 ℃、1 500 r/min離心10 min，分離得到血清用來間接酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）測抗體效價(jià)。

1.3.4 不同有殼水產(chǎn)動(dòng)物蛋白粗提液的制備

參照《變態(tài)反應(yīng)學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》[12]中的方法，分別制備17 種有殼水產(chǎn)動(dòng)物蛋白粗提液：取新鮮的蝦、蟹、貝，蝦去頭去殼，蟹、貝去殼取肉，組織搗碎機(jī)分別搗碎；50%預(yù)冷丙酮脫脂3 次，后于2 倍體積的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）中攪拌2 h；4 ℃靜置過夜；4 ℃、12 000 r/min離心20 min，取上清液測定蛋白質(zhì)濃度，SDS-PAGE鑒定蛋白組分，－20 ℃分裝保存。

1.3.5 Western blotting分析AK的種間免疫交叉反應(yīng)

蛋白粗提液經(jīng)SDS-PAGE分離組分，再轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h，PBST洗滌3 次；20 000 倍稀釋的AK鼠多抗37 ℃孵育2 h，PBST洗滌3 次；1∶10 000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗鼠lgG二抗孵育37 ℃ 1 h，洗滌5 次；膜上滴加ECL化學(xué)發(fā)光試劑，X膠片曝光，經(jīng)顯影定影后掃描保存結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜鑒定分析結(jié)果

圖1 凡納濱對蝦40 kD過敏原蛋白的肽質(zhì)量指紋圖譜Fig.1 PMF of 40 kD-allergen from Litopenaeus vannamei

表1 Mascot檢索結(jié)果Table 1 Summary report of Mascot search results

2.2 序列同源性分析

由質(zhì)譜鑒定結(jié)果得到凡納濱對蝦精氨酸激酶的氨基酸序列（ABY57915.1），通過BLAST和Clustal X2軟件在數(shù)種具有代表性的有殼水生動(dòng)物AK序列信息中進(jìn)行多序列比對，所選物種均為常接觸物種（蝦、蟹、貝、蟑螂等）。通過MEGA 5.0中Neighbor-Joining（N-J）方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系（圖2）。結(jié)果顯示，凡納濱對蝦的AK與其他甲殼類動(dòng)物的AK氨基酸序列同源性很高，尤其在對蝦科內(nèi)最高，其AK的氨基酸序列基本相同，一致性達(dá)96%～100%；由進(jìn)化樹還可看出，同屬甲殼綱的蟹類（包括小龍蝦）與對蝦科親緣關(guān)系極近，處同一分支，蟹類AK與凡納濱對蝦AK一致性為91%～93%；貝類與蝦類、蟹類雖處于不同進(jìn)化樹分支，但一致性仍有49%～52%；此外，昆蟲綱蟑螂的AK與凡納濱對蝦AK親緣關(guān)系居于蝦蟹與貝類之間，一致性高達(dá)83%，這預(yù)示著昆蟲的AK可能和甲殼類動(dòng)物AK間存在強(qiáng)交叉反應(yīng)；然而有趣的是，雖同為蝦類，沼蝦科的羅氏沼蝦AK與對蝦科的凡納濱對蝦AK氨基酸序列一致性只有45%，親緣關(guān)系略遠(yuǎn)，原因可能是兩者進(jìn)化來源差異較大。以上數(shù)據(jù)均表明，精氨酸激酶在蝦類、蟹類、貝類、甚至蟑螂中都具有較高的同源性。

圖2 有殼水生動(dòng)物精氨酸激酶系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of AKs from shellfi shes

2.3 鼠多克隆抗體的制備與鑒定

用純化的凡納濱對蝦40 kD過敏原精氨酸激酶免疫昆明小鼠制備特異性鼠多克隆抗體，凡納濱對蝦AK包被質(zhì)量濃度為100 ng/孔，間接ELISA檢測抗體效價(jià)。如圖3所示，兩只小鼠產(chǎn)生的抗體的效價(jià)分別約為130 000和100 000，混合兩份多抗血清進(jìn)行交叉反應(yīng)研究。

圖3 抗AK鼠多克隆抗體效價(jià)Fig.3 Titer of AK-specifi c polyclonal antibodies

2.4 AK在有殼水生動(dòng)物中的免疫學(xué)交叉反應(yīng)分析

共制備了17 種有殼水生動(dòng)物的蛋白粗提液，進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果如圖4A所示，17 種水產(chǎn)食物在40 kD附近均有蛋白條帶。蝦類、蟹類、貝類的蛋白組成雖有明顯差異，但蝦、蟹在40 kD處均有較粗條帶出現(xiàn)；貝類中對應(yīng)于AK位置的條帶在40 kD略上方，可能是其AK分子質(zhì)量大小與蝦、蟹略有不同。由電泳結(jié)果還可看出，AK在這17 種有殼水生動(dòng)物的蛋白粗提液中均有較高的蛋白含量，是水產(chǎn)食物中的一種重要蛋白組成成分。

將抗AK多克隆抗體與這17 種有殼水生動(dòng)物蛋白粗提液進(jìn)行Western blotting，結(jié)果顯示（圖4B），多抗與17 種蝦、蟹、貝在40 kD左右處均有反應(yīng)條帶，且其反應(yīng)程度結(jié)果吻合于信息學(xué)同源性比對結(jié)果。其中，與凡納濱對蝦同屬對蝦科的5 種（1～5）對蝦粗提液反應(yīng)最強(qiáng)，其AK同源性96%～100%；多抗與小龍蝦（7）和4 種蟹類（8～11）的反應(yīng)也較強(qiáng)，同源性比對結(jié)果顯示該5 種水產(chǎn)食物與凡納濱對蝦的AK同源性達(dá)91%～93%；而多抗與羅氏沼蝦（6）、口蝦蛄（17）及5 種貝類（12～16）的反應(yīng)則相對較弱，但仍有可見條帶，該7 種水產(chǎn)食物與凡納濱對蝦的AK同源性僅有50%左右。綜合上述結(jié)果可知，在有殼水生動(dòng)物尤其是在甲殼類動(dòng)物中，精氨酸激酶之間存在較強(qiáng)的免疫交叉反應(yīng)，反應(yīng)強(qiáng)弱存在差異且與其氨基酸序列同源性相關(guān)。故精氨酸激酶是有殼水產(chǎn)動(dòng)物尤其是甲殼類動(dòng)物中的一種泛過敏原。

圖4 17種有殼水生動(dòng)物蛋白粗提液的SDS-PAGE及其與AK多抗的Western blotting結(jié)果Fig.4 SDS-PAGE of extracts from 17 shellfi sh species and Western blotting of these extracts probed with AK-specifi c polyclonal antibody

3 討 論

本研究通過質(zhì)譜鑒定分析證明凡納濱對蝦分子質(zhì)量為40 kD的過敏原是精氨酸激酶（AK），經(jīng)氨基酸序列比對分析，表明其在蝦、蟹、貝等有殼水生動(dòng)物及蟑螂中高度保守，免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了AK在蝦、蟹、貝等17 種有殼水生動(dòng)物中存在強(qiáng)免疫交叉反應(yīng)，即AK的種間同源性較高，是一種有殼水產(chǎn)食物的交叉過敏原。

精氨酸激酶是甲殼類動(dòng)物的重要過敏原，亦是調(diào)節(jié)無脊椎動(dòng)物能量代謝的一種重要酶，其功能類似于脊椎動(dòng)物的肌酸激酶[13]。2003年，Yu Chiajung等[5]首次在斑節(jié)對蝦中鑒定出精氨酸激酶（Pen m 2）是一種新的甲殼類動(dòng)物過敏原，且與克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）、鋸緣青蟹（Scylla serrata）存在交叉反應(yīng)；2011年，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)甲殼類動(dòng)物中的精氨酸激酶具有高達(dá)70%左右的致敏率，是僅次于原肌球蛋白的重要過敏原[7]，隨后Ayuso等[14]還利用重疊肽合成技術(shù)獲取了精氨酸激酶上的8 個(gè)免疫球蛋白E線性表位肽段。近幾年，國內(nèi)的一些學(xué)者在精氨酸激酶的重組表達(dá)、過敏原性鑒定及其免疫球蛋白E結(jié)合表位的結(jié)構(gòu)分析等方面的研究中也做出了重要貢獻(xiàn)[15-17]。然而，在該過敏原的交叉反應(yīng)問題上，研究數(shù)據(jù)卻比較匱乏。

本研究從凡納濱對蝦中分離純化出能與蝦蟹過敏患者血清反應(yīng)的40 kD蛋白組分，通過蛋白組學(xué)質(zhì)譜鑒定方法，證明該過敏原為精氨酸激酶，這與國外報(bào)道相符[5]。為進(jìn)一步探究精氨酸激酶在有殼水產(chǎn)食物中的分布狀況及是否存在交叉反應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)選取了蝦類、蟹類、貝類共計(jì)17 種日常飲食中的水產(chǎn)食物，并制備其粗提液，運(yùn)用Western blotting和生物信息學(xué)同源性分析方法，證實(shí)了精氨酸激酶在甲殼類動(dòng)物和軟體動(dòng)物中具有較高同源性，是有殼水生動(dòng)物的一種泛過敏原，為過敏癥的預(yù)防控制，探尋甲殼類食物過敏原檢測靶位點(diǎn)，以及廣譜脫敏疫苗的研發(fā)提供了重要信息。

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Proteomics and Immunological Analysis of Arginine Kinase, an Important Shrimp Allergen from Litopenaeus vannamei

SUN Yifan, HUANG Jianfang, XIANG Junjian*, WANG Caixia, CHEN Chengfeng
(Guangdong Province Key Laboratory of Molecular Immunology and Antibody Engineering, Jinan University, Guangzhou 510632, China)

This study aimed to identify the 40-kD allergen of Litopenaeus vannamei and to analyze its immune crossreactivity among shellfi sh species. Several proteomics and immunological experiments were performed. By using matrixassisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/TOF-MS), the 40 kD allergen from Litopenaeus vannamei was identifi ed as arginine kinase (AK). Its amino acid sequence was compared with that of known proteins by BLAST, Clustal X2 and MEGA 5. The results revealed that AK had high homology among shrimp (96%－100%), crab (91%－93%), cockroach (83%) and mollusca (49%－52%)．The purifi ed AK was injected subcutaneously into mice to produce specifi c polyclonal antibodies for analyzing its immune cross-reactivity by Western blotting. It was shown that the proteins with relative molecular mass (Mr) of about 40 kD corresponding to AKs from 17 species of shellfi sh could be recognized by the AK-specifi c polyclonal sera. The results of both proteomics and immunological analysis have shown that AK is a pan-allergen among crustacean and mollusca.

Litopenaeus vannamei; allergen; arginine kinase; mass spectrometry; sequence homology; immune cross-reactivity

R392.8

A

1002-6630（2015）01-0170-04

10.7506/spkx1002-6630-201501032

2014-03-15

廣東省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)項(xiàng)目（2011A060901017）

孫一帆（1988—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)橹卮蠹膊≡\斷試劑盒研發(fā)及食物過敏原。E-mail：sunyifantian@163.com

*通信作者：向軍儉（1952—），男，教授，碩士，研究方向?yàn)榭贵w藥物及食品安全。E-mail：txjj@jnu.edu.cn