方 玲，孫才云，唐云明

（西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶市甘薯工程研究中心，三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，重慶 400715）

大豆過氧化氫酶的分離純化及性質(zhì)研究

方 玲，孫才云，唐云明*

（西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶市甘薯工程研究中心，三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，重慶 400715）

新鮮大豆芽經(jīng)勻漿、磷酸緩沖液抽提、硫酸銨分級沉淀、DEAE-Sepharose離子交換層析、Superdex-200凝膠過濾層析，獲得電泳純的過氧化氫酶。該酶酶活回收率為30.92%，純化倍數(shù)為293.09，酶比活力達(dá)到26 322.43 U/mg。該酶全分子質(zhì)量為234.9 kD，亞基分子質(zhì)量為57.42 kD；最適pH值為7.2，最適溫度為30 ℃，在pH 4.0～10.6及25～35 ℃范圍內(nèi)有較好的穩(wěn)定性；在30 ℃、pH 7.2條件下測得該酶對過氧化氫的Km值為31.82 mmol/L；十二烷基硫酸鈉、草酸、Ag+、Cu2+對該酶有強(qiáng)烈的抑制作用，Pb2+對該酶有雙重作用，低濃度時有激活作用而高濃度時抑制酶活性。

大豆；過氧化氫酶；分離純化；性質(zhì)

過氧化氫酶（catalase，CAT；EC 1.1 1.1.6）又稱觸酶，是一類廣泛存在于動植物及需氧微生物體內(nèi)的末端氧化還原酶，主要功能是催化過氧化氫發(fā)生歧化反應(yīng)生成水和氧氣，清除體內(nèi)的過氧化氫，從而使細(xì)胞免于遭受H2O2的毒害[1]。其酶促活性為機(jī)體提供了抗氧化防御機(jī)理，是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一[2]。它在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品加工、紡織、印染、環(huán)保等方面有十分重要的應(yīng)用價值[3-10]。因此，獲得來源廣泛且成本低廉的CAT在理論和實踐方面有十分重要的意義。大豆（Glycine max），別名黃豆，一年生草本植物，起源于我國，至今已有5 000 年的種植史，具有美容養(yǎng)顏、抗癌、增強(qiáng)人體組織機(jī)能等作用[11-12]。大豆來源廣泛，成本低廉，四季均可取材，經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)大豆中CAT含量十分豐富，且從大豆中分離純化CAT還未見報道，故本實驗嘗試以大豆為材料從中分離純化CAT，并對部分酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，旨在為該酶更深入研究、開發(fā)及應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

以新鮮大豆芽為材料，購自重慶市北碚區(qū)永輝超市。

DEAE-Sepharose、Superdex-200、凝膠過濾層析分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品、蛋白質(zhì)SDS-PAGE標(biāo)準(zhǔn)品 美國GE Healthcare公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺 瑞士Fluka公司；三羥甲基氨基甲烷、考馬斯亮藍(lán)R-250美國Bio-Rad公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

精密電子天平 瑞士Mettler-Toledo公司；PHS-32W微電路pH計 上海理達(dá)儀器廠；Mill-Q plus超純水儀美國Millipore公司；GL-21M高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀公司；蛋白核酸定量儀 日本島津公司；蛋白質(zhì)純化系統(tǒng) 美國GE Healthcare公司；垂直板電泳槽和電泳儀 美國Bio-Rad公司；MC4L冷凍干燥機(jī) 德國Uni Equip公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆CAT粗酶液的制備

取新鮮的大豆芽的子葉部分30 g，用蒸餾水洗凈，按1∶15的比例加入預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（0.0 5 mol/L、pH 7.2、含1 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）），勻漿后放于4 ℃冰箱中靜置抽提2 h后，紗布過濾，將濾液離 心40 min（4 ℃，12 000 r/min）， 收集上清液即為粗酶液。

1.3.2 硫酸銨分級鹽析

于粗酶液中加入硫酸銨粉末至30%飽和度，4 ℃靜置鹽析2 h，10 000 r/min離心0.5 h，收集上清液；再向其中加入硫酸銨粉末至40%飽和度，4 ℃靜置鹽析2 h，6 000 r/min離心0.5 h，收集沉淀，沉淀用抽提緩沖液（0.05 mol/L，pH 7.2，含1 mmol/L EDTA）溶解，4 ℃條件下用0.25 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.2，含1 mmol/L EDTA）透析12 h后即為初酶液。

1.3.3 DEAE-Sepharose離子交換層析

先用 0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 8.0，含1 mmol/L EDTA）平衡DEAE-Sepha rose離子交換層析柱后，取初酶液10 mL上柱，用0～0.5 mol/L的NaCl溶液（含0.05 mol/L，pH 8.0的磷酸緩沖液，1 mmol/L的EDTA）進(jìn)行線性梯度洗脫，流速0.65 mL/min，每管收集6.5 mL；測定各管CAT活性和蛋白含量，收集活性較高的各管酶液，于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 Superdex-200凝膠過濾層析

先用0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 8.0，含1 mmol/L EDTA）平衡Superdex-200層析柱后，取在1.3.3節(jié)中收集的活力較高的CAT酶液4 mL上柱，用0.05 mol/L pH 8.0磷酸緩沖液（含1 mmol/L的EDTA）洗脫，流速0.3 mL/min，每管收集10 min；測定各管CAT活性和蛋白含量；收集活性較高的酶液，4 ℃超純水透析脫鹽12 h，冷凍干燥后于－20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 CAT活力的測定

以H2O2為底物，采用鉬酸銨終止法[13]進(jìn)行測定。酶活力單位定義為：在測定條件下，每分鐘催化分解1 μmol H2O2所需的酶量為一個酶活力單位（U）。

1.3.6 CAT純度鑒定與分子質(zhì)量測定[14]

用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）對大豆CAT進(jìn)行純度鑒定，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的分離膠和5%的濃縮膠，上樣量8 μL。該酶亞基分子質(zhì)量用SDS-PAGE測定，全分子質(zhì)量用Superdex-200凝膠過濾層析測定。

1.3.7 蛋白質(zhì)含量的測定

用Bradford染料法與紫外分光光度法進(jìn)行測定[14]。

1.3.8 大豆CAT部分性質(zhì)研究

1.3.8.1 CAT最適pH值及pH值穩(wěn)定性

用不同pH值（3.0～10.6）的緩沖液配制底物過氧化氫溶液，在37 ℃條件下，測定CAT在pH 3.0～10.6反應(yīng)底物中的酶活力，每組實驗重復(fù)3 次，取平均值（以下實驗重復(fù)次數(shù)相同）。以酶活力最高值為100%，計算相對酶活力，以研究CAT最適pH值。將酶液置于不同pH值（3.0～10.6）的緩沖溶液中，室溫放置90 min后，測定CAT酶活力，以酶活力最高值為100%，計算該酶在不同pH值條件下的相對酶活力，研究該酶的pH值穩(wěn)定性。

1.3.8.2 CAT最適溫度和熱穩(wěn)定性

測定CAT在不同溫度（15～75 ℃），pH 7.2條件下的酶活力，以酶活力最高值為100%，計算相對酶活力，以研究CAT最適反應(yīng)溫度。將酶液分別置于不同溫度（25～65 ℃）下保溫不同時間（1～5 h）后，在pH 7.2、37 ℃條件下測定其酶活力，以酶液不保溫時的酶活力為100%，計算其相對酶活力，以研究CAT的熱穩(wěn)定性。

1.3.8.3 CAT米氏常數(shù)（Km）的測定

在最適條件下（30 ℃、pH 7.2），測定大豆CAT以不同濃度的過氧化氫（5、10、20、30、40、50 mmol/L）為底物時的酶活力，采用雙倒數(shù)法（Lineweaver-Burk法）[15]，計算出該酶的Km值。

1.3.8.4 不同化合物對CAT活 性的影響

分別將不同化合物配成200 mmol/L母液，按一定比例與磷酸鹽抽提緩沖液和酶液混合，使得各化合物終濃度分別為5、10、15、20、25、30 mmol/L，在4 ℃條件下作用30 min后，測酶活力，以不加化合物時的酶活力為100%，計算CAT的相對酶活力。

1.3.8.5 不同有機(jī)溶劑對CAT活性的影響

分別將甲醇、乙醇、異丙醇按一定比例與磷酸鹽抽提緩沖液和酶液混合，使得各有機(jī)溶劑終體積分?jǐn)?shù)分別為10%、20%、30%、40%、50%、60%，在4 ℃條件下作用30 min后，測酶活力，以不加有機(jī)物時的酶活力為100%，計算CAT的相對酶活力。

1.3.8.6 金屬離子對CAT活性的影響

分別將不同金屬離子（K+、Mn2+、Co2+、Mg2+、Pb2+、Ca2+、Li+、Ba2+、Cd2+、Cu2+、Ag+）配成50 mmol/L母液，按一定比例與磷酸鹽抽提緩沖液和酶液混合，使得各金屬離子的終濃度分別為1、2、3、4、5 mmol/L，在4 ℃條件下作用30 min后，測酶活力，以不加金屬離子時的酶活力為100%，計算CAT的相對酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆CAT的分離純 化

圖1 大豆CAT的DEAE-Sepharose離子交換層析Fig.1 DEAE-sepharoseion-exchange chromatography profi le of crude CAT solution

圖2 大豆CAT的Superdex-200凝膠過濾層析Fig.2 Superdex-200 gel fi ltration chromatography of catalase from Glycine max

表1 大豆CAT的分離純化Table 1 Summary of isolation and purifi cation of catalase from soybean

大豆CAT的初酶液經(jīng)DEAE-Sepharose離子交換層析的結(jié)果如圖1所示，酶活性主要集中在18～22 管，收集酶活性較高管的洗脫液直接用于凝膠層析，經(jīng)Superdex-200凝膠層析后的洗脫圖譜如圖2所示，酶活性主要集中在37～41 管，收集酶活性較高管的酶液，蒸餾水透析、冷凍干燥后，經(jīng)SDS-PAGE電泳，顯示為單一條帶（圖3），說明該酶經(jīng)過分離純化后已達(dá)到了電泳純。酶的整個分離純化結(jié)果如表1所示，最終得到大豆CAT的回收率為30.92%，酶比活力為26 322.43 U/mg，純化倍數(shù)為293.09。

2.2 大豆CAT的分子質(zhì)量

圖3 大豆CAT的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.3 SDS-PAGE of purified catalase from soybean

純化后的CAT用SDS-PAGE電泳分析為單一條帶（圖3），測得大豆CAT的亞基分子質(zhì)量為57.42 kD用Superdex-200凝膠過濾層析測得全酶的分子質(zhì)量為234.9 kD（圖4），由此可以推斷該酶由4 個相同的亞基組成。

圖4 Superdex-200凝膠過濾層析測大豆CAT的分子質(zhì)量Fig.4 Molecular weight estimation of catalase by Superdex-200 gel fi ltration chromatography

2.3 大豆CAT的最適溫度與熱穩(wěn)定性

圖5 溫度對大豆CAT酶活力的影響Fig.5 Effect of temperature on CAT activity

由圖5可知，大豆CAT的最適溫度為30 ℃。該酶在25～35 ℃范圍內(nèi)有相當(dāng)好的熱穩(wěn)定性，保溫5 h相對酶活力在86%以上，45 ℃時保溫5 h相對酶活 力仍在50%以上，超過此溫度相對酶活力迅速下降，65 ℃時保溫1 h，酶活力幾乎完全喪失（圖6）。可能是因為高溫破壞了酶分子的天然三維空間結(jié)構(gòu)使酶的催化功能發(fā)生改變。

圖6 大豆CAT的熱穩(wěn)定性Fig.6 Thermal stability of CAT

2.4 大豆CAT的最適pH值與pH值穩(wěn)定性

圖7 pH值對大豆CAT酶活力的影響Fig.7 Effect of pH on catalase activity

圖8 大豆CAT的pH值穩(wěn)定性Fig.8 pH stability of catalase activity

由圖7可知，大豆CAT的最適pH值為7.2。由圖8可知，該酶在pH 4.0～10.6范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好，室溫放置90 min，相對酶活力均保持在75%以上，說明該酶對酸堿的耐受范圍較廣，有非常好的應(yīng)用價值。

2.5 米氏常數(shù)（Km）的測定結(jié)果

由實驗結(jié)果可知，在30 ℃，pH 7.2條件下分別測定以不同濃度（5、10、20、30、40、50 mmol/L）為底物時該酶的反應(yīng)速率，按Lineweaver-Burk作圖法，計算出大豆CAT的Km值為31.82 μmol/L（圖9）。該酶Km值為31.82 μmol/L，與蘆薈[13]（34 mmol/L）、蒜苗[16]（38.2 mmol/L）、鴨肝[17]（37.29 mmol/L）的Km值相接近，而遠(yuǎn)高于蘋果[18]（2.27 mmol/L）、重組大腸桿菌[19]（7.75 mmol/L）、發(fā)芽的黑綠豆（16.2 mmol/L）[20]的Km值，也遠(yuǎn)低于韭菜[20]（46.93 mmol/L）、大鼠肝臟[21]（56 mmol/L）、氧化葡糖桿菌[22]（61 mmol/L）的Km值，說明不同來源的CAT對底物的親和力有差異。

圖9 雙倒數(shù)法測得大豆CAT的米氏常數(shù)曲線Fig.9 Lineweaver-Burk plot for Kmdetermination of CAT

2.6 不同有機(jī)溶劑對大豆CAT活性的影響

圖10 甲醇、乙醇、異丙醇對大豆CAT酶活力的影響Fig.10 Effect of methanol. ethanol and isopropyl alcohol on CAT activity

由圖10可知，3種有機(jī)溶劑對大豆CAT都有抑制作用，當(dāng)有機(jī)溶劑體積分?jǐn)?shù)在10%～30%范圍時，該酶的相對酶活性變化趨勢不大，超出此范圍，有機(jī)溶劑體積分?jǐn)?shù)越大，抑制作用就越大，可能是因為有機(jī)溶劑的加入使酶周圍的水化層被破壞，導(dǎo)致由水分子直接或間接參與形成的氫鍵、疏水鍵及范德華力已被破壞，從而引起酶構(gòu)象發(fā)生改變，使酶活性下降[23]。

2.7 不同化合物對大豆CAT活性的影響

圖11 不同化合物對大豆CAT的酶活力的影響Fig.11 Effect of various compounds on CAT activity

由圖11可知，SDS對該酶活性的抑制作用最強(qiáng)，當(dāng)濃度達(dá)到5 mmol/L時，酶活性完全喪失，可能是因為SDS是一種陰離子去污劑能夠破壞酶蛋白分子中的氫鍵和疏水鍵，改變酶的空間構(gòu)象，使酶活性降低[23]。草酸對該酶活性也有較強(qiáng)的抑制作用，當(dāng)濃度達(dá)到20 mmol/L時，酶幾乎完全失活。而脲素、EDTA對該酶活性影響不大，當(dāng)濃度達(dá)到30 mmol/L時，相對酶活力均在85%以上。

2.8 金屬離子對大豆CAT活性的影響

圖12 不同金屬離子對大豆CAT酶活力的影響Fig.12 Effect of metal ions on CAT activity

由圖12可知，Cu2+、Ag+對大豆CAT的抑制作用最強(qiáng)，當(dāng)濃度在1 mmol/L時，該酶的相對酶活力為0。Li+、Mn2+、Mg2+、K+對該酶活性的抑制作用相對較弱，而Ba2+、Cd2+、Co2+、Ca2+對該酶的抑制作用較明顯。Pb2+在低濃度（≤3 mmol/L）時對該酶活性有激活作用，高濃度（＞3 mmol/L）時對該酶活性有抑制作用。

3 討 論

本實驗以來源廣泛、成本低廉、四季均可取材的大豆子葉為實驗材料，經(jīng)勻漿、磷酸緩沖液抽提、硫酸銨分級沉淀、DEAE-Sepharose離子交換層析及Superdex-200凝膠過濾層析，從大豆子葉中分離純化出了CAT的均一組分。用pH 7.2磷酸鹽緩沖液平衡DEAE-Sepharose離子交換柱時，目的蛋白沒有被該離子柱所吸附，通過實驗發(fā)現(xiàn)，用pH 8.0的磷酸鹽緩沖液平衡柱子，目的蛋白能有效地吸附在離子柱上，與雜蛋白分離效果較好，且收集到的樣品酶活較高，無需濃縮可直接上Superdex-200凝膠過濾層析柱，減少實驗步驟的同時減少了酶活損失，同時得到了電泳純的大豆CAT；雖然酶活回收率低于蒜苗CAT[17]（蒜苗CAT的回收率40.05%），但比活力和純化倍數(shù)高于蒜苗CAT[17]（蒜苗CAT的比活力為25 975.36 U/mg，純化倍數(shù)為125.97）。

該酶最適反應(yīng)溫度為30 ℃，與火龍果[27]（30 ℃）的最適溫度一致，而低于其他來源的CAT的最適溫度，該酶在25～35 ℃范圍內(nèi)有相當(dāng)好的熱穩(wěn)定性，保溫5 h相對酶活力在86%以上，45 ℃時保溫5 h相對酶活仍在50%以上；該酶在pH 4.0～10.6范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好，室溫放置90 min，相對酶活力均保持在75%以上，說明該酶對酸堿的耐受范圍較廣，有非常好的應(yīng)用價值，最適pH值為7.2，與韭菜[21]（7.2）、蒜苗[16]（7.2）的最適pH值相一致，而與鴨肝[17]（7.0）、貽貝[26]（7.0）、大鼠[22]（7.5）、火龍果[27]（7.0）、蘆薈[13]（7.5）的最適pH值近似，說明不同來源的CAT對環(huán)境中的pH值有相似的適應(yīng)性。

該酶亞基分子質(zhì)量為5 7.4 2 k D，與鴨肝[17]（6 2.5 k D）、蒜苗[16]（5 9.1 6 k D）、韭菜[21]（62.34 kD）、蘆薈[13]（60.60 kD）的亞基分子質(zhì)量相接近，而與貽貝[26]（76 kD）的CAT的亞基分子質(zhì)量有差異，說明不同來源的CAT在分子結(jié)構(gòu)上具有物種特異性。

通過實驗表明：Cu2+、Ag+對該酶有強(qiáng)烈的抑制作用，濃度為1 mmol/L時酶活完全喪失，與蒜苗[16]中Cu2+、Ag+對CAT的強(qiáng)烈抑制作用相似，可能是因為金屬離子直接作用于酶的活性部位，減弱了酶的催化功能[24]，而在鴨肝[17]、貽貝[25]及火龍果[26]中Cu2+對酶有激活作用，可能是因為該金屬離子的加入促進(jìn)反應(yīng)時形成酶蛋白、金屬離子、底物三元配合物的穩(wěn)定過渡態(tài)，從而降低反應(yīng)的活化能，使酶促反應(yīng)速度加快[29]。Pb2+對該酶活性有雙重作用，低濃度時對酶有激活作用高濃度時抑制酶活，可能是因為二價的 Pb2+的濃度會影響該酶本身的帶電情況，在低濃度時，可能對CAT的帶電量影響較弱，酶分子空間結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生明顯變化，并可以促進(jìn)底物與酶活性中心相互結(jié)合，形成底物-酶-金屬離子復(fù)合物[23]，因而對酶有激活作用；但當(dāng)Pb2+濃度增大時，大量Pb2+的聚集改變了酶蛋白本身的帶電情況，影響了酶分子的空間構(gòu)型，從而逐漸抑制酶活性。Li+、Mn2+、Mg2+、K+、Ba2+、Ca2+對該酶都有一定的抑制作用，而在鴨肝[17]和貽貝[25]中Mg2+對酶有激活作用，在蒜苗[16]中Li+對酶有激活作用，K+對酶有雙重作用，在嗜熱鏈霉菌[27]中Ca2+對酶有激活作用，在蘆薈[13]中K+、Ba2+對酶有激活作用，以上對比結(jié)果說明了同種金屬離子對不同來源的CAT有不同的作用，可能是因為不同物種對環(huán)境的適應(yīng)能力有差異和在進(jìn)化過程中基因選擇性表達(dá)的結(jié)果[25]。

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Isolation, Purifi cation and Partial Characterization of Catalase from Soybean (Glycine max)

FANG Ling, SUN Caiyun, TANG Yunming*
(Key Laboratory of Eco-environments in Three Gorges Reservoir Region, Ministry of Education, Chongqing Sweet Potato Engineering Research Center, School of Life Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)

Electrophoresis-purity catalase (CAT) was obtained from freshly sprouted soybean (Glycine max) by the sequential steps of homogenization, buffer solution extraction, ammonium sulfate precipitation, DEAE-Sepharose ion exchange chromatography and Superdex-200 gel filtration chromatography. The purifi ed enzyme had a specifi c activity of 26 322.43 U/mg, with a 30.92% activity recovery and a 293.09-fold purifi cation. The molecular mass of the CAT enzyme comprising a 57.42 kD subunit was 234.9 kD. Its optimum pH and temperature were 7.2 and 30 ℃, respectively. This enzyme was stable at pH 4.0–10.6 and at 25–35 ℃. Its Kmtowards H2O2was 31.82 mmol/L. The enzyme activity was strongly inhibited by sodium dodecyl sulfate (SDS), oxalic, Ag+and Cu2+, but was activated by low concentration of Pb2+.

soybean; catalase; isolation and purification; characterization

Q946.5

A

1002-6630（2015）01-0140-06

10.7506/spkx1002-6630-201501027

2014-02-09

重慶市科委科技攻關(guān)重點項目（CSTC2011AB1027）

方玲（1988—），女，碩士研究生，主要從事蛋白質(zhì)與酶工程研究。E-mail：xuemeifl @163.com

*通信作者：唐云明（1960—），男，教授，博士，主要從事蛋白質(zhì)與酶工程研究。E-mail：tbright@swu.edu.cn