董蘭芳，張 琴，許明珠

（廣西壯族自治區(qū)海洋研究所，廣西海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 北海 536000）

方格星蟲多糖的分離純化及單糖組成

董蘭芳，張 琴*，許明珠

（廣西壯族自治區(qū)海洋研究所，廣西海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 北海 536000）

方格星蟲多糖經(jīng)堿法提取、三氯乙酸脫蛋白、DEAE-52纖維素柱層析、Sephadex G-100凝膠柱層析純化得到精制方格星蟲多糖（Sipunculus nudus polysaccharide，SNPS）。測(cè)定SNPS的理化性質(zhì)和單糖組成，結(jié)果表明：SNPS為白色粉末狀單一組分；經(jīng)理化性質(zhì)測(cè)定和紫外光譜分析，表明SNPS的多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.35%，糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為22.21%，不含蛋白質(zhì)和核酸，不含硫酸根；氣相色譜分析結(jié)果表明方格星蟲多糖SNPS主要由阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖組成，其物質(zhì)的量比為1.16∶9.54∶1。本研究表明SNPS是從方格星蟲中得到的均一組分純多糖。

方格星蟲；多糖；纖維素；凝膠；單糖

多糖廣泛地存在于動(dòng)物細(xì)胞膜、植物和微生物細(xì)胞壁中，是構(gòu)成生命的四大基本物質(zhì)之一。海洋生物多糖因具有免疫調(diào)節(jié)、抗凝血、抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗病毒、抗菌、抗輻射、抗氧化等多種活性[1-9]，在醫(yī)療保健、食品加工、美容化妝等方面具有良好的應(yīng)用前景，近年來，海洋生物多糖的藥用潛力逐漸被發(fā)掘出來。

方格星蟲（Sipunculus nudus）亦稱光裸星蟲，俗稱“沙蟲”，是無節(jié)、蠕蟲狀的海產(chǎn)體腔動(dòng)物，為暖水性世界廣布種，我國沿海從南到北均有分布，其中以廣西海區(qū)資源較為豐富。方格星蟲具有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，是一種具有多種機(jī)體調(diào)節(jié)功能的藥食佳品[10-13]。多糖是方格星蟲主要營養(yǎng)成分之一，已有研究表明，方格星蟲多糖（Sipunculus nudus polysaccharide，SNPS）具有抗病毒、抗輻射、抗疲勞、提高記憶力等多種生物學(xué)功能[14-17]。目前，國內(nèi)外研究方格星蟲多糖生物活性[14-17]和提取工藝[18-19]的報(bào)道較多，而方格星蟲多糖的分離純化方法鮮有報(bào)道。本研究對(duì)方格星蟲多糖進(jìn)行分離純化，并對(duì)其單糖組成進(jìn)行了分析，以期為方格星蟲多糖產(chǎn)品的利用和開發(fā)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

方格星蟲鮮活品，購于廣西北海市南珠市場(chǎng)。

DEAE-52纖維素、Sephadex G-100凝膠 北京慧德易科技有限責(zé)任公司；標(biāo)準(zhǔn)單糖：D（+）-葡萄糖（glucose，Glu）、木糖（xylose，Xyl）、果糖（fructose，F(xiàn)ru）、D-甘露糖（mannose，Man）、D-半乳糖（galactose，Gal）、D-阿拉伯糖（arabinose，Arb）、L-鼠李糖（rhamnose，Rha）、L（－）-巖藻糖（fucose，F(xiàn)uc）、肌醇（inositol）和標(biāo)準(zhǔn)糖醛酸：D-半乳糖醛酸，均購自上海金穂生物科技有限公司；三氟乙酸（trifl uoroacetic acid，TFA）、無水乙醇、三氯乙酸、氯化鈉、氫氧化鈉均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

GC-2010Plus氣相色譜儀 日本島津公司；EZ-2溶劑蒸發(fā)工作站 英國Genevac公司；Thermo KR25i高速冷凍離心機(jī) 美國Jouan公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋江蘇常州賽普實(shí)驗(yàn)儀器廠；BSZ-100自動(dòng)部分收集器上海青浦滬西儀器廠；Milli-Q Biocel超純水機(jī) 美國Millipore公司；UV6300紫外-可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 方格星蟲多糖的提取

用剪 刀將鮮活的方格星蟲剖開，去除體腔液和內(nèi)臟，體壁用蒸餾水洗凈，經(jīng)高速組織勻漿機(jī)勻漿打碎成糊狀。體壁肉醬加入6 倍體積6% NaOH，50 ℃提取4 h，調(diào)pH值至7.0，9 000 r/min離心30 min，棄去沉淀，得上清液，用三氯乙酸法[20]去蛋白2～3 次，于工作站濃縮至終體積為原來的1/4左右，加乙醇至終體積分?jǐn)?shù)為75%，4 ℃沉淀過夜。4 ℃、9 000 r/min離心10 min，沉淀以無水乙醇、丙酮洗滌多次，置于通風(fēng)處晾干后用超純水溶解，用截留相對(duì)分子質(zhì)量為10 000以上的玻璃紙流水透析48 h，乙醇再沉淀，離心，冷凍干燥得到方格星蟲粗多糖。

1.3.2 DEAE-52 纖維素柱層析

DEAE-52纖維素層析柱先用超純水平衡，方格星蟲粗多糖0.5 g用少量超純水溶解，9 000 r/min離心，取上清液上柱，0.5 mol/L NaCl洗脫，用恒流泵控制流速為1 mL/min，自動(dòng)收集器收集，每管5 mL，以苯酚-硫酸法跟蹤檢測(cè)，以管號(hào)為橫坐標(biāo)，吸光度A490nm為縱坐標(biāo)繪制洗脫曲線。根據(jù)測(cè)定結(jié)果合并吸收峰的洗脫液，濃縮后用超純水透析至無Cl－，乙醇沉淀，離心，凍干。

1.3.3 Sephadex G-100凝膠柱層析

Sephadex G-100凝膠柱（2.6 cm×45 cm，40～120 μm）層析用超純水平衡過夜。經(jīng)DEAE-52纖維素柱分離的方格星蟲多糖凍干品0.05 g用超純水溶解，0.45 μm濾膜過濾后上柱，用超純水以流速 0.2 mL/min洗脫，自動(dòng)收集器收集，每管5 mL，以苯酚-硫酸法跟蹤檢測(cè)，以管號(hào)為橫坐標(biāo)，吸光度A490nm為縱坐標(biāo)繪制洗脫曲線。合并吸收峰洗脫液，于工作站減壓濃縮，冷凍干燥，得方格星蟲精制多糖。

1.3.4 多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

將方格星蟲多糖配成1 mg/mL水溶液，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，按苯酚-硫酸法測(cè)定總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.5 糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

將方格星蟲精制多糖配制成5 mg/mL水溶液，取適量，以葡萄糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品，按硫酸-咔唑法[21]測(cè)定糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.6 硫酸根質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

取方格星蟲精制多糖5 mg，用1 mol/mL鹽酸完全水解后，以無水硫酸鉀為標(biāo)準(zhǔn)品，采用明膠-比濁法[22]測(cè)定硫酸根的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.7 蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

方格星蟲精制多糖以超純水配成1 mg/mL溶液，取適量，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，采用Folin-酚法[23]測(cè)定蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.8 紫外光譜分析

將純化后的方格星蟲多糖用超純水配成1 mg/mL溶液，以蒸餾水為空白對(duì)照，紫外分光光度計(jì)在190～400 nm波長(zhǎng)范圍掃描檢測(cè)，看是否有無特征吸收。

1.3.9 單糖組成分析

多糖的水解：精密稱取5.0 mg方格星蟲精制多糖于厭氧水解管中，加入1.0 mL 2 mol/mL的TFA，充氮?dú)夂笊w好軟塞，旋緊密封蓋，105 ℃水解6 h，水解液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加甲醇繼續(xù)旋蒸至干，重復(fù)3 次，以除去TFA。

單糖衍生物的制備：采用糖腈乙酸酯衍生法對(duì)單糖標(biāo)準(zhǔn)品和多糖水解得到的單糖樣品衍生后進(jìn)行氣相色譜分析。單糖標(biāo)準(zhǔn)品和多糖水解樣品各5.0 mg，分別加入10.0 mg鹽酸羥胺，再加入0.5 mL吡啶，90 ℃水浴中加熱反應(yīng)30 min，間歇振蕩。取出反應(yīng)液冷卻至室溫，加入0.5 mL乙酸酐，90 ℃水浴中繼續(xù)反應(yīng)30 min進(jìn)行乙酰化，得糖腈乙酸酯衍生物。離心，上清液直接作氣相色譜分析。

色譜條件：色譜柱為RTx-1石英毛細(xì)柱（30 m× 0.25 mm，0.25 μm）；氫火焰離子化檢測(cè)器（hydrogen flame ionization detector，F(xiàn)ID）；升溫程序：初始溫度140 ℃，以6 ℃/min 升溫至240 ℃，保持5 min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；檢測(cè)器溫度250 ℃；載氣N2；進(jìn)樣量1 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 方格星蟲多糖的分離純化

2.1.1 DEAE-52 纖維素柱層析

方格星蟲體壁經(jīng)堿液提取、三氯乙酸脫蛋白、透析、醇沉、凍干處理后得黃褐色多糖粉末，易溶于水不溶于乙醇，得率為1.47%，多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)64.15%。由圖1可知，經(jīng)過DEAE-52 纖維素陰離子交換層析，0.5 mol/L NaCl洗脫后只有一個(gè)洗脫峰，說明方格星蟲多糖為酸性多糖[24]，收集洗脫峰各管，透析脫鹽，濃縮后冷凍干燥得到一種DEAE-52纖維素純化乳白色粉末狀多糖級(jí)分SNPS’，經(jīng)測(cè)定SNPS’多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為88.37%。

圖1 DEAE-52纖維素柱純化方格星蟲多糖的洗脫曲線Fig.1 Elution curve of Sipunculus nudus polysaccharide on DEAE-52 celluose column

2.1.2 Sephadex G-100凝膠柱層析

圖2 Sephadex G-100 凝膠柱純化方格星蟲多糖的洗脫曲線Fig.2 Elution curve of Sipunculus nudus polysaccharide on Sephadex G-100 column

由圖2可知，SNPS’過Sephadex G-100凝膠柱后，在19～25 管即洗脫體積為95～125 mL得到一個(gè)單一對(duì)稱性很好的洗脫峰，說明該組分為單一的多糖組分，透析、濃縮后凍干后，得到方格星蟲白色粉末狀精制多糖SNPS。

2.2 SNPS基本理化性質(zhì)

結(jié)果表明，SNPS不含蛋白質(zhì)，多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.35%，純度較高，不含硫酸根，糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為22.21%。

圖3 方格星蟲多糖紫外光譜Fig.3 UV absorption spectrum of SNPS

2.3 SNPS紫外光譜分析由圖3可知，在195 nm波長(zhǎng)處出現(xiàn)糖的較強(qiáng)吸收峰，在260 nm和280 nm波長(zhǎng)處無明顯的蛋白、核酸吸收峰，這與蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果相符，表明被測(cè)物為多糖，且不含核酸及蛋白質(zhì)。因此，分離純化得到的SNPS為純多糖。

2.4 方格星蟲多糖SNPS單糖組成

圖4 混合標(biāo)準(zhǔn)單糖氣相色譜圖Fig.4 GC chromatogram of monosaccharide standards

圖5 SNPS氣相色譜圖Fig.5 GC chromatogram of SNPS

實(shí)驗(yàn)以Glu、Xyl、Fru、Man、Gal、Arb、Rha和Fuc為標(biāo)準(zhǔn)單糖樣品，混合標(biāo)準(zhǔn)單糖衍生物的保留時(shí)間與每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)單糖衍生物的保留時(shí)間進(jìn)行對(duì)照比較，確定各單糖衍生物的出峰時(shí)間。由圖4各單糖衍生物的保留時(shí)間依次為Rha 7.934 min，Arb 8.127 min，Xyl 8.303 min，F(xiàn)uc 11.724 min，Glu 11.845 min，Man 11.978 min，Gal 12.287 min，Inositol 14.083 min，F(xiàn)ru 16.355 min。對(duì)方格星蟲多糖單糖組成氣相色譜圖（圖5）分析可知，SNPS中1～3 號(hào)峰的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)單糖氣相色譜圖中峰2、5、7保留時(shí)間基本一致，表明峰1為阿拉伯糖，峰2為葡萄糖，峰3為半乳糖，從而證明SNPS由葡萄糖、阿拉伯糖和半乳糖3 種單糖組成，物質(zhì)的量比為1.16∶9.54∶1。另外，多糖氣相譜圖中存在不少雜峰，這是由于多糖水解衍生過程復(fù)雜，使用試劑較多，試劑可能有殘留或試劑不純。劉玉明等[25]測(cè)定了方格星蟲的單糖組成為阿拉伯糖和葡萄糖，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為7.91%和79.32%；張桂和等[26]通過紅外光譜分析確定方格星蟲體壁多糖中存在木糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖。這與本實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果有一些差異，這可能是提取純化處理方法、單糖測(cè)定方法、材料來源等的不同造成的。

3 結(jié) 論

方格星蟲粗多糖經(jīng)DEAE-52纖維素柱和Sephadex G-100凝膠柱純化后得到白色粉末狀單一組分SNPS。理化性質(zhì)測(cè)定及紫外光譜分析結(jié)果：SNPS多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.35%，不含蛋白質(zhì)和核酸，不含硫酸根，糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為22.21%。上述結(jié)果表明采用DEAE-52纖維素柱層析和Sephadex G-100凝膠柱層析的常規(guī)方法對(duì)于純化方格星蟲多糖具有良好的效果。氣相色譜分析結(jié)果表明SNPS由阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖3 種單糖組成，物質(zhì)的量比為1.16∶9.54∶1。

[1] ZVYAGINTSEVA T N, SHEVCHENKO N M, NAZAROVA I V, et al. Inhibition of complement activation by water-soluble polysaccharides of some fareastern brown seaweeds[J]. Comparative Biochemistry and Physiology, 2000, 126(3): 209-215.

[2] 劉志峰, 宮曉黎, 魏淑貞. 五種海藻多糖體外抗血小板聚集作用的觀察[J]. 中國海洋藥物, 2001, 20(2): 36-38.

[3] 董浦江, 姚棒祥. 昆布多糖硫酸醋對(duì)化療藥物治療肝癌細(xì)胞的增敏作用[J]. 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)衛(wèi)生, 2003, 19(3): 255-256.

[4] 李福川, 唐志紅, 崔博文, 等. 三種海帶多糖的降糖作用[J]. 中國海洋藥物, 2000, 19(5): 12-15.

[5] 侯建明, 藍(lán)進(jìn). 海洋生物多糖(AC-1)防治高脂血癥的實(shí)驗(yàn)報(bào)告[J].海軍醫(yī)學(xué)雜志, 2001, 22(3): 197-199.

[6] 耿美玉, 李澤琳. 海洋硫酸多糖類藥物911抗艾滋病毒作用及其機(jī)理研究[J]. 中國藥理學(xué)會(huì)通訊, 2001, 18(4): 13-14.

[7] 于紅, 張學(xué)成. 螺旋藻多糖抗HSV-1作用的體外實(shí)驗(yàn)研究[J]. 高技術(shù)通訊, 2002, 12(9): 65-69.

[8] 顧寧琰, 劉宇峰. 紫球藻胞外多糖抗輻射的生物活性研究[J]. 海洋科學(xué), 2002, 26(12): 53-56.

[9] XUE Changhu, FANG Yu, LIN Hong, et al. Chemical characters and antioxidative properties of sulfated polysaccharides from Laminaria japonica[J]. Journal Applied Phycology, 2001, 13(1): 67-70.

[10] 陳細(xì)香, 林秀雁, 盧昌義, 等. 方格星蟲屬動(dòng)物的研究進(jìn)展[J]. 海洋科學(xué), 2008, 32(6): 66-70.

[11] 蔣定文, 沈先榮, 賈福星, 等. 海洋星蟲提取物的營養(yǎng)分析及免疫調(diào)節(jié)作用的初步觀察[J]. 中國生化藥物雜志, 2004, 25(2): 96-97.

[12] 張桂和, 李理, 趙謀明, 等. 方格星蟲營養(yǎng)成分分析及抗疲勞作用研究[J]. 營養(yǎng)學(xué)報(bào), 2008, 30(3): 318-320.

[13] 沈先榮, 蔣定文, 賈福星, 等. 方格星蟲延緩衰老作用研究[J]. 中國海洋藥物, 2004, 23(1): 30-32.

[14] 夏乾峰, 譚河林, 覃西, 等. 方格星蟲多糖抗乙型肝炎病毒的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 山東醫(yī)藥學(xué), 2010, 50(7): 44-45.

[15] 李珂嫻, 沈先榮, 蔣定文, 等. 方格星蟲多糖對(duì)小鼠抗輻射能力的影響[J]. 中華航海醫(yī)學(xué)與高氣壓醫(yī)學(xué)雜志, 2011, 18(3): 33-36.

[16] 劉玉明, 錢甜甜, 莫琳芳, 等. 方格星蟲多糖對(duì)運(yùn)動(dòng)小鼠抗疲勞作用實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中國海洋藥物, 2012, 31(3): 41-44.

[17] 何穎, 沈先榮, 蔣定文, 等. 方格星蟲多糖對(duì)記憶障礙模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響[J]. 中國海洋藥物, 2012, 31(1): 38-41.

[18] 劉玉明, 錢甜甜, 何穎, 等. 方格星蟲多糖不同提取工藝的比較有研究[J]. 時(shí)珍國醫(yī)國藥, 2011, 22(6): 1454-1455.

[19] 許明珠, 張琴, 童潼. 方格星蟲多糖水法提取的條件及優(yōu)化[J]. 廣西科學(xué), 2013, 20(4): 285-288.

[20] 許靜. 超聲波提取縊蟶多糖及脫蛋白工藝[J]. 食品研究與開發(fā), 2012, 33(8): 91-94.

[21] 張惟杰. 糖復(fù)合物生化研究技術(shù)[M]. 杭州: 浙江大學(xué)出版社, 1999: 20.

[22] TERHO T T, HARTIALA K. Method for determination of the sulfate content of glycosaminoglycans[J]. Analytical Biochemistry, 1971, 4l(2): 471-476.

[23] OLIVERH B, LOWRY, NIRA J, et a1. Protein measurement with the folin phenol reagent[J]. Journal of Biological Chemistry, l951, 193(1): 265-270.

[24] 夏瑋, 呂慶, 張文清, 等. 桑葉多糖 SDS-1和 SDT-1的系統(tǒng)分離純化[J].華東理工大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2007, 33(5): 678-682.

[25] 劉玉明, 錢甜甜, 李珂嫻, 等. 氣相色譜法分析方格星蟲多糖的單糖組成[J]. 藥物分析雜志, 2012, 32(8): 1362-1365.

[26] 張桂和, 趙謀明, 王煒. 方格星蟲多糖分離純化及性質(zhì)鑒定[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2006, 25(4): 63-66.

Isolation, Purifi cation and Monosaccharide Analysis of Polysaccharide from Sipunculus nudus

DONG Lanfang, ZHANG Qin*, XU Mingzhu
(Key Laboratory of Marine Biotechnology of Guangxi, Guangxi Institute of Oceanology, Beihai 536000, China)

Crude polysaccharide was obtained from Sipunculus nudus by alkali extraction and deproteinized by Sevag method. The polysaccharide was sequentially purified by ion exchange chromatography on DEAE-52 cellulose column and Sephadex G-100 Gel column. Then, the purified polysaccharide from Sipunculus nudus (SNPS) was characterized for physicochemical properties and monosaccharide composition. The results showed that SNPS with a purity of 99.35% contained 22.21% alduronic acid without protein, nuclein or sulfate ions. Gas chromatography analysis showed that the monosaccharide compositions of SNPS were arabinose, glucose and galactose, with a molar ratio of 1.16:9.54:1. This study demonstrated that SNPS was a homogeneous component obtained from Sipunculus nudus.

Sipunculus nudus; polysaccharide; cellulose; gel; monosacharide

R284.2

A

1002-6630（2015）01-0109-04

10.7506/spkx1002-6630-201501021

2014-02-25

廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（桂科攻11107011-6）；廣西科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)資助項(xiàng)目（12YJ25HYS20）

董蘭芳（1987—），女，助理研究員，本科，主要從事水產(chǎn)動(dòng)物天然產(chǎn)物開發(fā)的研究。E-mail：0xiao0dong0@163.com

*通信作者：張琴（1982—），女，副研究員，博士，主要從事水產(chǎn)動(dòng)物天然產(chǎn)物開發(fā)研究。E-mail：celery996@yahoo.com.cn