尹永祺,吳進賢,劉春泉,李大婧,楊潤強,顧振新,*
(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)部農(nóng)畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制重點開放實驗室,江蘇 南京 210095;2.揚州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇 揚州 225127;3.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,江蘇 南京 210014)
低氧與低溫脅迫對發(fā)芽玉米籽粒中γ-氨基丁酸富集的影響
尹永祺1,2,吳進賢1,劉春泉3,李大婧3,楊潤強1,顧振新1,*
(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)部農(nóng)畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制重點開放實驗室,江蘇 南京 210095;2.揚州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇 揚州 225127;3.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,江蘇 南京 210014)
以玉米籽粒為實驗材料,研究低氧脅迫下發(fā)芽時間、低溫脅迫與回溫解凍下的溫度及時間對發(fā)芽玉米中γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)含量的影響,對其低氧和低溫脅迫工藝進行了優(yōu)化,同時對脅迫期間發(fā)芽玉米籽粒中GABA代謝酶活性的變化進行了研究。結(jié)果表明:玉米經(jīng)低氧脅迫發(fā)芽72 h后,在-18 ℃冷凍6 h和25 ℃回溫4 h條件下,發(fā)芽玉米中GABA含量增加29.9 倍,達(dá)到1.52 mg/g(以干質(zhì)量計);低氧脅迫下發(fā)芽玉米籽粒主要是通過GABA支路富集GABA的。玉米籽粒是富集GABA的良好原料,且低氧與低溫脅迫是富集發(fā)芽玉米中GABA的有效方式。
發(fā)芽玉米;低氧脅迫;低溫脅迫;γ-氨基丁酸;富集
γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì),已被國家衛(wèi)生部批準(zhǔn)為新資源食品,其具有改善大腦血液循環(huán)、降低血壓、治療癲癇和增強肝腎功能等作用[1-2]。近年來,植物富集GABA受到國內(nèi)外食品科學(xué)工作者的高度關(guān)注。植物正 常生長條件下GABA含量僅為0.3~32.5 μmol/g[3],而在受到低氧、冷激、熱激、鹽脅迫和機械傷害等逆境時,其GABA含量顯著增加[4]。目前,國內(nèi)外已對GABA在粟谷[5]、蠶豆[6]、大豆[7]和糙米[8]等植物性食品原料中的富集技術(shù)及其產(chǎn)品開發(fā)進行了大量研究,以玉米為原料富集GABA主要通過酶法富集玉米中GABA[8],而以玉米籽粒為原料通過逆境脅迫發(fā)芽富集發(fā)芽玉米中GABA的研究未見報道。
低氧與低溫脅迫均是安全環(huán)保、操作方便的GABA富集方式,二者均能激活有利于GABA合成的谷氨酸脫羧酶(glutamate decarboxylase,GAD,EC 4.1.1.15)、二胺氧化酶(diamine oxidase,DAO,EC 1.4.3.6)和氨基醛脫氫酶(aminoaldehyde dehydrogenase,AMADH,EC 1.2.1.19)活性。低氧脅迫下,植物細(xì)胞中H+濃度提高,引起植物細(xì)胞質(zhì)酸化,為GABA合成提供條件[9]。低溫脅迫可促使細(xì)胞中Ca2+釋放,提高鈣調(diào)蛋白表達(dá)水平,從而激活谷氨酸脫羧酶,以促進GABA積累[10]。
本研究以玉米為試材,研究低氧脅迫下發(fā)芽時間、低溫脅迫與回溫解凍下的溫度及時間對發(fā)芽玉米中GABA生成的影響,對低氧和低溫脅迫工藝進行了優(yōu)化,探討了脅迫期間發(fā)芽玉米籽粒中GABA代謝酶活性的變化,旨在探索低氧及低溫脅迫下發(fā)芽玉米中GABA富集規(guī)律,為開發(fā)功能性玉米食品提供理論依據(jù)。
1.1 材料與試劑
玉米籽粒品種為京甜紫花糯,2012年收獲,由北京燕禾金農(nóng)業(yè)科技發(fā)展中心提供,原料封裝于聚乙烯塑料袋中,4 ℃保存;GABA標(biāo)準(zhǔn)品、對二甲氨基苯磺酰氯、NAD+和4-氨基丁醛 美國Sigma公司;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。
1.2 儀器與設(shè)備
Agilent 1200 Series高效液相色譜儀 美國Agilent公司;UV-2802型紫外-可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司;BCD-185HFA型冰箱 澳柯瑪股份有限公司;Orion818型pH測試儀 美國Orion科學(xué)儀器公司。
1.3 方法
1.3.1 玉米浸泡處理
稱取成熟飽滿未破損的玉米籽粒20 g,經(jīng)體積分?jǐn)?shù)1%的次氯酸鈉溶液浸泡消毒30 min,用離子水沖洗至pH值中性后,置于培養(yǎng)箱中于30 ℃黑暗條件下浸泡12 h。
1.3.2 低氧脅迫
浸泡后的玉米籽粒用去離子水潤洗數(shù)次后,以200 mL去離子水為培養(yǎng)液,通入空氣(通氣量1.0 L/min,即溶氧量為4.6 mg/L),于30 ℃浸泡發(fā)芽4 d,每隔12 h取樣測定GABA含量和酶活力。玉米發(fā)芽期間,每隔12 h更換培養(yǎng)液,直至培養(yǎng)結(jié)束。
1.3.3 低溫脅迫
低溫脅迫溫度和時間實驗:取經(jīng)低氧脅迫發(fā)芽72 h的發(fā)芽玉米,除去表面水分后,分別于5、-5、-18 ℃貯存10 h,每隔2 h取樣并將其置于密封袋中,于25 ℃解凍4 h,測定發(fā)芽玉米中GABA含量及GAD酶活力。
回溫解凍溫度和時間實驗:取經(jīng)低氧脅迫發(fā)芽72 h的發(fā)芽玉米,除去表面水分,分別于5、-5、-18 ℃貯存12 h后,將玉米置于密封袋中,于25 ℃解凍8 h,解凍期間每隔1 h取樣,測定測定發(fā)芽玉米中GABA含量及GAD酶活力。
1.3.4 指標(biāo)測定
GABA含量:參照Yang Runqiang等[11]方法測定,結(jié)果以干質(zhì)量計;GAD活力:參照Li Yan等[6]的方法測定,結(jié)果以干質(zhì)量計。
DAO活力:參照何生根等[12]的方法,并略作修改。取待測玉米2 g,加入6 mL酶提取液(70 mmol/L磷酸鉀緩沖液pH 6.5,體積分?jǐn)?shù)10%甘油),冰浴研磨成漿后10 000 r/min冷凍離心15 min,上清液即為DAO酶粗提液。DAO活力測定的反應(yīng)混合液含2 mL磷酸鉀緩沖液(70 mmol/L,pH 6.5)、0.2 mL愈創(chuàng)木酚(25 mmol/L)、0.1 mL過氧化物酶溶液(250 U/mL)及0.5 mL DAO提取液?;旌弦河?7 ℃水浴預(yù)保溫3 min后分別加入0.1 mL 腐胺(50 mmol/L)啟動反應(yīng),于555 nm波長處連續(xù)測定吸光度5 min。以每分鐘A555nm變化0.01 個單位為1 個酶活力單位(U),結(jié)果以干質(zhì)量計。
AMADH活力:稱取1 g玉米,加入5 mL預(yù)冷酶提取液(0.1 mol/L pH 8.0 磷酸鉀緩沖液,5 mmol/L 二硫蘇糖醇,1mmol/L乙二胺四乙酸二鈉,10 g/100 mL蔗糖),冰浴研磨成漿后于12 000 r/min冷凍離心30 min;上清液即為粗酶液。取適量酶液加入0.1 mol/L pH 8.0 Tris-鹽酸緩沖液,內(nèi)含1 mmol/L NAD+,加入終體積為1 mmol/L的4-氨基丁醛啟動反應(yīng),37 ℃于340 nm波長處連續(xù)測定吸光度,以每分鐘A340nm變化0.01 個單位為1 個酶活力單位(U)[13],結(jié)果以干質(zhì)量計。
1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析
2.1 低氧脅迫發(fā)芽時間對GABA含量的影響
圖1 玉米低氧脅迫發(fā)芽期間GABA含量的變化Fig.1 Changes in GABA contents of maize during germination under hypoxia
由圖1可知,玉米在低氧條件下發(fā)芽0~96 h期間,GABA含量呈先增加后減少趨勢。發(fā)芽0~24 h階段GABA含量增加緩慢,其后GABA含量快速增加,72~84 h時GABA含量最高。發(fā)芽72 h時其GABA含量是發(fā)芽初始的13.15 倍。
2.2 低氧脅迫發(fā)芽過程中GAD活力變化
圖2 玉米低氧脅迫發(fā)芽期間GAD活力變化Fig.2 Changes in GAD activity of maize during germination under hypoxia
由圖2可知,低氧脅迫發(fā)芽期間,GAD活力呈先增加后降低趨勢。在發(fā)芽36~48 h階段GAD活力最高,是發(fā)芽0 h的2.14 倍,發(fā)芽48~72 h內(nèi)GAD活力維持在較高水平,其后酶活力顯著下降。
2.3 低氧脅迫發(fā)芽過程中DAO和AMADH活力變化
圖3 玉米低氧脅迫發(fā)芽期間GAD(A)和AMADH(B)活力變化Fig.3 Changes in GAD (A) and AMADH (B) activities in maize during germination under hypoxia
由圖3A可知,在玉米低氧脅迫發(fā)芽96 h期間,多胺降解途徑中合成GABA的限速酶——DAO活力總體呈下降趨勢,72 h時其酶活力僅為發(fā)芽初始36.8%,其后無顯著性變化。
AMADH是多胺降解途徑合成GABA最后一步反應(yīng)的酶。圖3B顯示,玉米中AMADH活力在低氧脅迫發(fā)芽72 h內(nèi)呈較穩(wěn)定趨勢,72 h后其酶活力顯著下降。
2.4 低溫脅迫及回溫解凍的溫度和時間對GABA含量的影響
由圖4A可知,玉米低溫脅迫0~10 h后,在常溫條件(25 ℃)回溫解凍4 h時GABA含量呈現(xiàn)逐漸增加而后降低的趨勢。其中-18 ℃冷凍玉米0~6 h再解凍4 h后發(fā)芽玉米GABA含量顯著增加,直至達(dá)到峰值(1.38 mg/g),是未低溫處理者的2.3 倍,其后無顯著變化。5 ℃低溫處理的效果最差,但低溫處理后GABA含量比未處理者增加0.91 倍。-5 ℃低溫處理8 h后GABA富集量達(dá)到1.19 mg/g。
由圖4B可知,玉米低溫脅迫12 h后在常溫條件(25 ℃)回溫解凍0~8 h,GABA含量呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢,其中以在-18 ℃條件下冷凍后回溫解凍的玉米GABA含量最高,回溫4 h后為未低溫處理者的1.44 倍,含量高達(dá)1.57 mg/g,其后無顯著增加。-5 ℃冷凍后回溫處理的GABA含量達(dá)到1.42 mg/g。5 ℃處理的玉米效果較差,但其GABA含量比未低溫處理的增加36.5%。解凍4 h后玉米中GABA含量無顯著變化。
圖4 玉米低溫脅迫(A)及回溫解凍(B)對GABA含量的影響Fig.4 Effect of freezing-thawing (A) or chilling-warming (B) on GABA contents of maize
2.5 低溫脅迫及回溫解凍過程中GAD活力變化
如圖5A所示,發(fā)芽玉米經(jīng)過不同程度低溫脅迫并經(jīng)歷不同時間后,在常溫(25 ℃)下回溫解凍4 h后,GAD活力對比未處理組均有提高,且其變化趨勢與GABA變化趨勢一致。對比3 種低溫處理,以-18 ℃處理GAD活力提高效果最好,其GAD活力在處理過程中一直高于-5 ℃和5 ℃處理,冷凍6 h、解凍4 h后,玉米GAD活力是未冷凍常溫放置4 h玉米的2.13 倍。其次為-5 ℃處理,冷凍4 h后再解凍后其GAD活力均能保持7.5 U/g的水平,5 ℃處理條件下玉米GAD活力增加最少。
由圖5B可知,發(fā)芽玉米經(jīng)低溫處理并解凍后其GAD活力變化趨勢一致,均呈先下降后趨于穩(wěn)定趨勢。-18 ℃條件下冷凍的玉米解凍過程中其GAD活力持續(xù)高于-5 ℃和5 ℃處理。
圖5 低溫脅迫(A)及回溫解凍過程(B)中玉米GAD活力的變化Fig.5 Changes in GAD activity of maize during freezing-thawing (A) or chilling-warming (B)
2.6 低氧和低溫脅迫對發(fā)芽玉米GABA富集作用的影響
圖6 低氧與低溫脅迫對GABA含量的影響Fig.6 Effect of hypoxia stress and cold stress on GABA content
由圖6可知,玉米經(jīng)低氧脅迫和低溫脅迫處理后其GABA含量達(dá)1.52 mg/g,是浸泡后玉米的30.9 倍,其中低氧脅迫和低溫脅迫階段產(chǎn)生的GABA含量分別占玉米富集GABA總含量的37.4%和59.4%。
植物受到洪澇缺氧、干旱、鹽脅迫、冷激和熱激等逆境脅迫時,體內(nèi)GABA含量顯著增加[4],其中以低氧脅迫誘導(dǎo)植物積累GABA量最大[14]。植物在低氧環(huán)境中呼吸受到抑制,氧的虧缺造成代謝過程電子傳遞中斷,糖類多轉(zhuǎn)化為丙酮酸,最終分解為乳酸和乙醇,導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)酸化。存在于植物細(xì)胞質(zhì)中的GAD在酸性條件下被激活,催化Glu脫羧生成GABA,從而達(dá)到富集GABA的效果[4]。玉米ZHN在低氧脅迫發(fā)芽0~96 h期間GABA含量呈現(xiàn)先增加后下降的變化趨勢。從萌發(fā)至發(fā)芽24 h階段,GABA增加緩慢,這可能是玉米在此萌發(fā)階段需氧量小、低氧環(huán)境對其發(fā)芽脅迫不顯著的緣故,其后GABA含量顯著增加,直至72 h;玉米發(fā)芽84 h后GABA含量下降,可能是內(nèi)部營養(yǎng)物質(zhì)逐漸消耗,導(dǎo)致合成GABA的底物不足,同時,GABA合成時消耗用于合成其他蛋白質(zhì)和氨基酸[15],進而影響GABA的富集。
高等植物主要通過GABA支路和多胺降解途徑合成GABA。GAD作為GABA支路中合成GABA的限速酶[16],在玉米籽粒發(fā)芽早期其活力顯著提高,由此GABA含量逐步提高。GAD活力在36~72 h階段保持較高水平,同期GABA含量成倍增加。姚森等[17]在研究糙米后均指出,GABA和GAD呈顯著正相關(guān)。DAO是多胺降解途徑富集GABA的關(guān)鍵酶[18],AMADH則是該途徑的限速酶。本研究顯示低氧脅迫下玉米發(fā)芽過程中DAO活力一直處于低水平,這與Yang Runqiang等[11]低氧脅迫下發(fā)芽蠶豆富集GABA研究中的DAO活力有兩個數(shù)量級的差距,而與陳惠等[19]采用DAO專一抑制劑——氨基胍抑制低氧聯(lián)合鹽脅迫蠶豆發(fā)芽后DAO活力相當(dāng)。由此推測,多胺降解途徑對于低氧脅迫下玉米發(fā)芽富集GABA貢獻率不高。AMADH活力水平低也證實多胺降解途徑對玉米富集GABA影響有限。
Mazzucotelli等[10]在闡述低溫脅迫對大麥幼苗GABA積累的影響機制時表明,-3 ℃處理大麥幼苗16 h后正常發(fā)芽48 h時,GABA含量比對照提高30 倍。本研究中-18、-5 ℃和5 ℃處理低氧脅迫發(fā)芽的玉米后GABA含量均有提高,其中以-18 ℃處理8 h再常溫解凍4 h后的玉米中GABA含量最高。低溫處理及回溫解凍后增加的GABA含量主要在解凍0~2 h內(nèi)完成,同期GAD活力較高但快速下降。這表明低溫處理是富集GABA的預(yù)處理,解凍過程才是GABA的富集階段。推測其原因是低溫冷凍過程中細(xì)胞內(nèi)形成冰晶并不斷“長大”,以至嚴(yán)重?fù)p傷細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),當(dāng)回溫解凍后,冰晶消融,細(xì)胞液流動性增加,此時Ca2+和H+迅速進入細(xì)胞質(zhì),激活GAD,催化底物谷氨酸脫羧形成GABA。
本研究中,玉米籽粒經(jīng)低氧脅迫發(fā)芽72 h后,在-18℃冷凍6 h和25℃回溫4 h條件下,發(fā)芽玉米中GABA含量達(dá)1.52 mg/g,較原料中其含量增加29.9 倍。據(jù)報道,發(fā)芽粟谷[5]、發(fā)芽大豆[20]和發(fā)芽蠶豆[19]中GABA含量分別為 0.24、1.20、6.14 mg/g。經(jīng)富集后原料中GABA含量有所不同可能是由于物種差異導(dǎo)致,但玉米經(jīng)脅迫處理后其GABA含量是原料中的30.9 倍,這提示玉米籽粒是富集GABA的良好原料,且低氧與低溫脅迫是富集發(fā)芽玉米中GABA的有效方式。
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Effects of Hypoxia and Cold Stress on γ-Aminobutyric Acid Accumulation in Germinating Maize
YIN Yongqi1,2, WU Jinxian1, LIU Chunquan3, LI Dajing3, YANG Runqiang1, GU Zhenxin1,*
(1. Key Laboratory of Agricultural and Animal Products Processing and Quality Control, Ministry of Agriculture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 2. College of Food Science and Technology, Yangzhou University, Yangzhou 225127, China; 3. Institute of Farm Product Processing, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China)
The effects of hypoxia and cold stress on γ-aminobutyric acid (GABA) accumulation of germinating maize were investigated. The GABA content in germi nating maize was monitored with respect to germination time under hypoxia stress and freezing or chilling followed by exposure to room temperature (25 ℃). Results suggested that the optimal conditions for GABA accumulation in 72 h-germinated maize during cold stress were freezing at -18 ℃ for 6 h followed by thawing for 4 h at 25 ℃. Under these conditions, the maximum GABA level (1.52 mg/g DW) was obtained, which was 30.9 folds higher than that of the control. Moreover, it was also indicated that GABA synthesis in germinating maize was mainly achieved by the GABA shunt. Maize can be used as a good raw material to accumulate GABA. Besides, hypoxia stress and cold stress are confi rmed as an effective way to accumulate GABA content in germinated maize.
germinating maize; hypoxia stress; cold stress; γ-aminobutyric acid; accumulation
TS210.2
A
1002-6630(2015)01-0089-05
10.7506/spkx1002-6630-201501017
2014-01-19
江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程項目;江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項目(CX(11)2067)
尹永祺(1988—),男,博士研究生,研究方向為食品中功能成分的富集技術(shù)。E-mail:2011208009@njau.edu.cn
*通信作者:顧振新(1956—),男,教授,博士,研究方向為生物技術(shù)與功能食品。E-mail:guzx@njau.edu.cn