木瓜蛋白酶對(duì)胰島素提取后胰臟殘?jiān)乃庋芯?/h1>
2015-12-07 05:33:57喬德陽
現(xiàn)代鹽化工 2015年5期
喬德陽
（徐州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 徐州 221140）
木瓜蛋白酶對(duì)胰島素提取后胰臟殘?jiān)乃庋芯?/p>
喬德陽
（徐州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 徐州 221140）
地處江蘇徐州的江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司是亞洲最大的胰島素原料藥生產(chǎn)基地，從豬胰臟中提取胰島素后的剩余殘?jiān)ㄒ韵潞喎Q“胰渣”）資源豐富，價(jià)格低廉，蛋白質(zhì)含量高，極具開發(fā)價(jià)值。本文利用木瓜蛋白酶對(duì)胰渣進(jìn)行水解研究，分析了胰渣基本成分，其中蛋白質(zhì)含量極高，達(dá)50.49%；優(yōu)選出最佳水解工藝條件，為提高胰渣資源的綜合利用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
胰島素；胰渣；木瓜蛋白酶；水解
胰島素是目前治療糖尿病的最佳藥物之一，其中以豬胰臟為原料提取胰島素是獲得胰島素藥物的主要途徑之一。從豬胰臟中提取胰島素后的剩余殘?jiān)?，約占豬胰臟的78%。地處江蘇徐州的江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司是亞洲最大的胰島素原料藥生產(chǎn)基地，每年胰渣的產(chǎn)量約為300-400噸，常被丟棄或作為飼料蛋白添加劑。經(jīng)過初步的檢測胰渣蛋白質(zhì)含量異常豐富，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于天然的動(dòng)物組織中的蛋白質(zhì)含量。提高胰渣綜合利用價(jià)值的最好方法就是將胰渣蛋白質(zhì)降解，對(duì)水解液中的多肽以及氨基酸的組成與含量進(jìn)行測定，分離出具有一定抗氧化活性多肽[1]，并研究其在抗氧化等方面的特性[2]，制備成口服抗氧化活性多肽營養(yǎng)合劑。
1 材料與方法
1.1 材料與儀器
胰渣取自江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司，分裝于食品保鮮袋中凍藏備用；木瓜蛋白酶由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；其余試劑均為分析純。
2300型kjelteeTM自動(dòng)定氮儀器（丹麥foss分析儀器公司），721型分光光度計(jì), HZ211-220電子分析天平, M302210pH計(jì)等。
1.2 工藝流程
1.2.1 原料預(yù)處理
冷凍預(yù)處理：將胰渣分裝于食品保鮮袋中冷凍20h后解凍后烘干備用。
熱處理：將胰渣于120℃高溫高壓處理20min后烘干備用。
1.2.2 酶解工藝流程[3]
胰渣95℃干燥→粉碎→胰渣和水以1:1混合→調(diào)pH→加木瓜蛋白酶恒溫水解→酶滅活(90℃,10min) →高速離心(5000r/min) 30min得酶解液→測定游離氨基氮。
1.3 分析測定方法
1.3.1 胰渣基本成分分析方法
水分的測定：直接干燥法[4]；灰分的測定：灼燒法[4]；脂肪含量的測定：索氏抽提法[4]；氨基氮測定：甲醛電位滴定法[4]；蛋白質(zhì)的測定：微量凱氏定氮法。
1.3.2 酶活力測定
福林酚法酶活力(OD)定義為：在45℃，pH7.0 的條件下,每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1μg 酪氨酸為一個(gè)酶活力單位。實(shí)測木瓜蛋白酶活力為3.66萬u/mg。
1.3.3 蛋白質(zhì)水解度(DH)測定
DH=酶解液中游離氨基氮P樣品總氮量×100%；
2 結(jié)果與討論
2.1 胰渣基本成分分析
由試驗(yàn)測得胰渣中粗脂肪質(zhì)量含量為7.15%；水分含量為32.20%；蛋白質(zhì)含量為50.49%；灰分含量為5.58%。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，該胰渣中的蛋白質(zhì)含量高，作為蛋白質(zhì)水解的原料較好。
2.2 樣品預(yù)處理
當(dāng)固液比為0.6時(shí)，酶解時(shí)間8h，酶解溫度為55℃，酶量0.6%的條件下，分別選擇新鮮、冷凍預(yù)處理、高溫預(yù)處理的樣品，測定水解液中的氨基氮，計(jì)算水解度，結(jié)果如圖1所示。
圖1 樣品預(yù)處理與水解度的關(guān)系
由圖1可見，隨著樣品的預(yù)處理方法的不同，冷凍預(yù)處理和高溫預(yù)處理對(duì)胰渣有利于水解度的增加。冷凍預(yù)處理和高溫預(yù)處理都對(duì)胰渣蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)有一定的破壞作用，其中高溫預(yù)處理效果更明顯，這可能與高溫處理導(dǎo)致蛋白質(zhì)的變性更有利于胰渣蛋白質(zhì)酶解，故本試驗(yàn)的后續(xù)酶解原料均選擇高溫預(yù)處理后的胰渣。
2.3 加酶量的初步確定
當(dāng)采用高溫預(yù)處理，固液比為0.6時(shí)，酶解時(shí)間8h，酶解溫度為55℃的條件下，測定不同加酶量時(shí)，水解液中的氨基氮，計(jì)算水解度，結(jié)果如圖2所示。
圖2可見，隨著加酶量的增大，反應(yīng)體系水解度逐漸上升，而加酶量在0.6 %-1%之間時(shí)，水解度增加并不顯著，綜合考慮水解度和酶的用量，為了節(jié)約成本，故本試驗(yàn)加酶量取0.6%。
圖2 加酶量與水解度的關(guān)系
2.4 酶解溫度對(duì)水解度的影響
當(dāng)采用高溫預(yù)處理，固液比為0.6時(shí)， 加酶量0.6%，酶解時(shí)間為8h的條件下，測定不同酶解溫度的水解液中的氨基氮，計(jì)算水解度，結(jié)果如圖3所示。
圖3 酶解溫度對(duì)水解度的影響
由圖3可見，當(dāng)隨著酶解溫度的增加，反應(yīng)體系水解度逐漸上升，而當(dāng)酶解溫度達(dá)到55-60℃時(shí)，水解度達(dá)到最大；同時(shí)隨著酶解溫度增加，酶解的水解度逐漸下降，故本試驗(yàn)選擇最佳的酶解溫度為55℃。
2.5 酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響
當(dāng)采用高溫預(yù)處理，固液比為0.6時(shí)， 加酶量0.6%，酶解溫度為55℃的條件下，測定不同酶解時(shí)間時(shí)水解液中的氨基氮，計(jì)算水解度，結(jié)果如圖4所示。
圖4 酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響
由圖4可見，隨著酶解時(shí)間的增加，反應(yīng)體系水解度逐漸上升，而當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到8h以后，水解度增加并不明顯；同時(shí)隨著酶解時(shí)間的延長，木瓜蛋白酶的活性大大下降，且胰渣的酶解液有變質(zhì)并產(chǎn)生異味的現(xiàn)象，故本試驗(yàn)選擇最佳的酶解時(shí)間為8h。
2.6 固液比對(duì)水解度的影響
當(dāng)采用高溫預(yù)處理，加酶量0.6%，酶解時(shí)間8h，酶解溫度為55℃的條件下，測定不同固液比水解液中的氨基氮，計(jì)算水解度，結(jié)果如圖5所示。
圖5 固液比對(duì)水解度的影響
由圖5可見，隨著固液比的增大，反應(yīng)體系水解度逐漸下降，當(dāng)固液比高于0.6以后，產(chǎn)品的水解度下降非常明顯，這可能與胰渣蛋白質(zhì)的濃度太高對(duì)木瓜蛋白酶有一定的吸附和抑制作用，降低了木瓜蛋白酶對(duì)胰渣蛋白質(zhì)的水解作用，考慮到酶解效果，本試驗(yàn)加酶量取0.6%較為適宜。
3 結(jié)語
從豬胰臟中提取胰島素后剩余的胰臟殘?jiān)Y源豐富, 價(jià)格低廉, 蛋白含量高，極具開發(fā)價(jià)值。經(jīng)過初步的樣品分析，該殘?jiān)写种举|(zhì)量含量為7.15%；水分含量為32.20%；蛋白質(zhì)含量為50.49%；灰分含量為5.58%。采用木瓜蛋白酶，胰渣樣品經(jīng)過高溫處理20min，固液比為0.6，加酶量為0.6%，酶解時(shí)間8h，酶解溫度為55℃時(shí)，胰渣的水解度可以達(dá)到41.25%以上。該方法為提高胰島素提取后胰臟殘?jiān)Y源的綜合利用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
[1] Tsuge, N., Eikawa, Y., Nomura, Y., Yamamoto, M.,& Sugisawa, K. (1991). Antioxidative activity of peptides prepared by enzymatic hydrolysis of egg-white albumin.Nippon Nogei Kagaku Kaishi, 65, 1635-1641 (in Japanese).
[2] Kim, S. K., Kim, Y. T., Byun, H. G., Nam, K. S., Joo, D.S., & Shahidi, F.(2001). Isolation and characterization of antioxidative peptides from gelatin hydrolysate of Alaska pollack skin. Journal of Agriculture Food Chemistry, 49,1984-1989.
[3] 張芝芬，楊文鴿.木瓜蛋白酶對(duì)蚌肉蛋白質(zhì)的水解［D］.無錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào).2002,21(3):299-301.
[4] 大連輕工業(yè)學(xué)院等八大院校.水分、灰分、脂肪、甲醛滴定法.食品分析［J］.北京:中國輕工業(yè)出版社.1994（6）：75-235.
Study on the Hydrolysis of Pancreatic Residue After Extraction of Insulin from the Pancreas by Trypsin
QIAO Deyang
(Xuzhou College of Industrial Technology, Xuzhou 221140 , China)
Xuzhou Jiangsu, Jiangsu, is located in the Asia's largest production base of raw material medicine, from the pig pancreas to extract the remaining residue (hereinafter referred to as "pancreatic residue") is rich in resources, low price, high protein content, great development value. In this paper,the research on the hydrolysis of pancreatic residue by using the papaya protease, the basic components of pancreatic residue, the protein content is high, and the optimum hydrolysis conditions are 50.49%.
Insulin; Pancreatic residue; Papaya protease; Hydrolysis
喬德陽（1963.9- ），男，南京工業(yè)大學(xué)制藥與生命科學(xué)學(xué)院生物化工工學(xué)碩士，徐州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，教授，生物技術(shù)類專業(yè)學(xué)科帶頭人，黨校常務(wù)副校長、機(jī)關(guān)黨總支書記。
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喬德陽
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喬德陽
（徐州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 徐州 221140）
地處江蘇徐州的江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司是亞洲最大的胰島素原料藥生產(chǎn)基地，從豬胰臟中提取胰島素后的剩余殘?jiān)ㄒ韵潞喎Q“胰渣”）資源豐富，價(jià)格低廉，蛋白質(zhì)含量高，極具開發(fā)價(jià)值。本文利用木瓜蛋白酶對(duì)胰渣進(jìn)行水解研究，分析了胰渣基本成分，其中蛋白質(zhì)含量極高，達(dá)50.49%；優(yōu)選出最佳水解工藝條件，為提高胰渣資源的綜合利用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
胰島素；胰渣；木瓜蛋白酶；水解
胰島素是目前治療糖尿病的最佳藥物之一，其中以豬胰臟為原料提取胰島素是獲得胰島素藥物的主要途徑之一。從豬胰臟中提取胰島素后的剩余殘?jiān)?，約占豬胰臟的78%。地處江蘇徐州的江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司是亞洲最大的胰島素原料藥生產(chǎn)基地，每年胰渣的產(chǎn)量約為300-400噸，常被丟棄或作為飼料蛋白添加劑。經(jīng)過初步的檢測胰渣蛋白質(zhì)含量異常豐富，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于天然的動(dòng)物組織中的蛋白質(zhì)含量。提高胰渣綜合利用價(jià)值的最好方法就是將胰渣蛋白質(zhì)降解，對(duì)水解液中的多肽以及氨基酸的組成與含量進(jìn)行測定，分離出具有一定抗氧化活性多肽[1]，并研究其在抗氧化等方面的特性[2]，制備成口服抗氧化活性多肽營養(yǎng)合劑。
1 材料與方法
1.1 材料與儀器
胰渣取自江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司，分裝于食品保鮮袋中凍藏備用；木瓜蛋白酶由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；其余試劑均為分析純。
2300型kjelteeTM自動(dòng)定氮儀器（丹麥foss分析儀器公司），721型分光光度計(jì), HZ211-220電子分析天平, M302210pH計(jì)等。
1.2 工藝流程
1.2.1 原料預(yù)處理
冷凍預(yù)處理：將胰渣分裝于食品保鮮袋中冷凍20h后解凍后烘干備用。
熱處理：將胰渣于120℃高溫高壓處理20min后烘干備用。
1.2.2 酶解工藝流程[3]
胰渣95℃干燥→粉碎→胰渣和水以1:1混合→調(diào)pH→加木瓜蛋白酶恒溫水解→酶滅活(90℃,10min) →高速離心(5000r/min) 30min得酶解液→測定游離氨基氮。
1.3 分析測定方法
1.3.1 胰渣基本成分分析方法
水分的測定：直接干燥法[4]；灰分的測定：灼燒法[4]；脂肪含量的測定：索氏抽提法[4]；氨基氮測定：甲醛電位滴定法[4]；蛋白質(zhì)的測定：微量凱氏定氮法。
1.3.2 酶活力測定
福林酚法酶活力(OD)定義為：在45℃，pH7.0 的條件下,每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1μg 酪氨酸為一個(gè)酶活力單位。實(shí)測木瓜蛋白酶活力為3.66萬u/mg。
1.3.3 蛋白質(zhì)水解度(DH)測定
DH=酶解液中游離氨基氮P樣品總氮量×100%；
2 結(jié)果與討論
2.1 胰渣基本成分分析
由試驗(yàn)測得胰渣中粗脂肪質(zhì)量含量為7.15%；水分含量為32.20%；蛋白質(zhì)含量為50.49%；灰分含量為5.58%。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，該胰渣中的蛋白質(zhì)含量高，作為蛋白質(zhì)水解的原料較好。
2.2 樣品預(yù)處理
當(dāng)固液比為0.6時(shí)，酶解時(shí)間8h，酶解溫度為55℃，酶量0.6%的條件下，分別選擇新鮮、冷凍預(yù)處理、高溫預(yù)處理的樣品，測定水解液中的氨基氮，計(jì)算水解度，結(jié)果如圖1所示。
圖1 樣品預(yù)處理與水解度的關(guān)系
由圖1可見，隨著樣品的預(yù)處理方法的不同，冷凍預(yù)處理和高溫預(yù)處理對(duì)胰渣有利于水解度的增加。冷凍預(yù)處理和高溫預(yù)處理都對(duì)胰渣蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)有一定的破壞作用，其中高溫預(yù)處理效果更明顯，這可能與高溫處理導(dǎo)致蛋白質(zhì)的變性更有利于胰渣蛋白質(zhì)酶解，故本試驗(yàn)的后續(xù)酶解原料均選擇高溫預(yù)處理后的胰渣。
2.3 加酶量的初步確定
當(dāng)采用高溫預(yù)處理，固液比為0.6時(shí)，酶解時(shí)間8h，酶解溫度為55℃的條件下，測定不同加酶量時(shí)，水解液中的氨基氮，計(jì)算水解度，結(jié)果如圖2所示。
圖2可見，隨著加酶量的增大，反應(yīng)體系水解度逐漸上升，而加酶量在0.6 %-1%之間時(shí)，水解度增加并不顯著，綜合考慮水解度和酶的用量，為了節(jié)約成本，故本試驗(yàn)加酶量取0.6%。
圖2 加酶量與水解度的關(guān)系
2.4 酶解溫度對(duì)水解度的影響
當(dāng)采用高溫預(yù)處理，固液比為0.6時(shí)， 加酶量0.6%，酶解時(shí)間為8h的條件下，測定不同酶解溫度的水解液中的氨基氮，計(jì)算水解度，結(jié)果如圖3所示。
圖3 酶解溫度對(duì)水解度的影響
由圖3可見，當(dāng)隨著酶解溫度的增加，反應(yīng)體系水解度逐漸上升，而當(dāng)酶解溫度達(dá)到55-60℃時(shí)，水解度達(dá)到最大；同時(shí)隨著酶解溫度增加，酶解的水解度逐漸下降，故本試驗(yàn)選擇最佳的酶解溫度為55℃。
2.5 酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響
當(dāng)采用高溫預(yù)處理，固液比為0.6時(shí)， 加酶量0.6%，酶解溫度為55℃的條件下，測定不同酶解時(shí)間時(shí)水解液中的氨基氮，計(jì)算水解度，結(jié)果如圖4所示。
圖4 酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響
由圖4可見，隨著酶解時(shí)間的增加，反應(yīng)體系水解度逐漸上升，而當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到8h以后，水解度增加并不明顯；同時(shí)隨著酶解時(shí)間的延長，木瓜蛋白酶的活性大大下降，且胰渣的酶解液有變質(zhì)并產(chǎn)生異味的現(xiàn)象，故本試驗(yàn)選擇最佳的酶解時(shí)間為8h。
2.6 固液比對(duì)水解度的影響
當(dāng)采用高溫預(yù)處理，加酶量0.6%，酶解時(shí)間8h，酶解溫度為55℃的條件下，測定不同固液比水解液中的氨基氮，計(jì)算水解度，結(jié)果如圖5所示。
圖5 固液比對(duì)水解度的影響
由圖5可見，隨著固液比的增大，反應(yīng)體系水解度逐漸下降，當(dāng)固液比高于0.6以后，產(chǎn)品的水解度下降非常明顯，這可能與胰渣蛋白質(zhì)的濃度太高對(duì)木瓜蛋白酶有一定的吸附和抑制作用，降低了木瓜蛋白酶對(duì)胰渣蛋白質(zhì)的水解作用，考慮到酶解效果，本試驗(yàn)加酶量取0.6%較為適宜。
3 結(jié)語
從豬胰臟中提取胰島素后剩余的胰臟殘?jiān)Y源豐富, 價(jià)格低廉, 蛋白含量高，極具開發(fā)價(jià)值。經(jīng)過初步的樣品分析，該殘?jiān)写种举|(zhì)量含量為7.15%；水分含量為32.20%；蛋白質(zhì)含量為50.49%；灰分含量為5.58%。采用木瓜蛋白酶，胰渣樣品經(jīng)過高溫處理20min，固液比為0.6，加酶量為0.6%，酶解時(shí)間8h，酶解溫度為55℃時(shí)，胰渣的水解度可以達(dá)到41.25%以上。該方法為提高胰島素提取后胰臟殘?jiān)Y源的綜合利用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
[1] Tsuge, N., Eikawa, Y., Nomura, Y., Yamamoto, M.,& Sugisawa, K. (1991). Antioxidative activity of peptides prepared by enzymatic hydrolysis of egg-white albumin.Nippon Nogei Kagaku Kaishi, 65, 1635-1641 (in Japanese).
[2] Kim, S. K., Kim, Y. T., Byun, H. G., Nam, K. S., Joo, D.S., & Shahidi, F.(2001). Isolation and characterization of antioxidative peptides from gelatin hydrolysate of Alaska pollack skin. Journal of Agriculture Food Chemistry, 49,1984-1989.
[3] 張芝芬，楊文鴿.木瓜蛋白酶對(duì)蚌肉蛋白質(zhì)的水解［D］.無錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào).2002,21(3):299-301.
[4] 大連輕工業(yè)學(xué)院等八大院校.水分、灰分、脂肪、甲醛滴定法.食品分析［J］.北京:中國輕工業(yè)出版社.1994（6）：75-235.
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Xuzhou Jiangsu, Jiangsu, is located in the Asia's largest production base of raw material medicine, from the pig pancreas to extract the remaining residue (hereinafter referred to as "pancreatic residue") is rich in resources, low price, high protein content, great development value. In this paper,the research on the hydrolysis of pancreatic residue by using the papaya protease, the basic components of pancreatic residue, the protein content is high, and the optimum hydrolysis conditions are 50.49%.
Insulin; Pancreatic residue; Papaya protease; Hydrolysis
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