韓志平，張海霞，趙智靈，杜清潔

（1.大同大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/高寒區(qū)作物研究所，山西，037009；2.大同大學(xué)后勤管理處）

近年來，我國工業(yè)化水平迅速提高，采礦、冶煉、印染、化工等重金屬污染型企業(yè)遍布城鄉(xiāng)，工業(yè)“三廢”、城市垃圾的大量排放，高銅畜肥、殺菌劑、殺蟲劑等的不合理施用，使土壤銅污染日益嚴(yán)重[1～3]。蔬菜對(duì)土壤銅污染十分敏感，加上蔬菜需肥水量大，吸收能力強(qiáng)、產(chǎn)品采收期長，使得其銅中毒的幾率大大增加。土壤銅污染不僅降低了蔬菜作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，而且還可能通過食物鏈的傳遞為害動(dòng)物和人類的健康[4，5]。

銅是植物必需的一種微量元素，也是細(xì)胞色素氧化酶、多酚氧化酶、抗壞血酸氧化酶及超氧化物歧化酶等多種酶類的組分，參與植物的許多生理代謝過程，對(duì)作物的生長、發(fā)育、產(chǎn)量和品質(zhì)等有重要的影響[6，7]。但是銅具有累積性，過量的Cu2+對(duì)植物細(xì)胞具有破壞作用，可引起水分代謝、光合作用、呼吸作用、營養(yǎng)吸收等各種生理代謝過程的紊亂[8～10]，最終抑制植株生長，導(dǎo)致作物減產(chǎn)[11，12]。

小白菜[Brassica campestrisssp.chinenses（L.）Makino]又名不結(jié)球白菜、青菜、油菜，屬十字花科蕓薹屬草本植物。由于其莖葉可食用，營養(yǎng)豐富、適應(yīng)性廣、高產(chǎn)省工，可周年生產(chǎn)和供應(yīng)，在我國栽培十分廣泛。但土壤銅污染已對(duì)小白菜栽培造成了極大的威脅。為此，研究了銅脅迫對(duì)小白菜生長和膜脂過氧化的影響，為深入研究銅脅迫下小白菜的生理和分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2013年5～6月在大同大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心進(jìn)行。供試材料為北京新一號(hào)四季小白菜，種子由河北恒通種業(yè)有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)方法

種子用55℃溫水燙種15 min后，清水浸泡5 h，而后在25℃培養(yǎng)箱中避光催芽。5月15日種子發(fā)芽后，播于裝有石英砂∶蛭石=2∶1（體積比）混合基質(zhì)的塑料盤中育苗，白天溫度18～22℃，夜間10～15℃。播種后每天上午澆1次1/2 Hoagland營養(yǎng)液（開始每盤澆0.75 L，處理15 d后每盤澆1 L），下午葉面噴施含有相應(yīng)濃度CuSO4的1/2 Hoagland營養(yǎng)液（開始每盤噴100 mL，處理15 d后每盤噴150 mL）。共設(shè)8個(gè)處理：①CK：噴施正常營養(yǎng)液，含0.16 μmol/L CuSO4；②T1：噴 施含 20 μmol/L CuSO4的營養(yǎng)液；③T2：噴施含 40 μmol/L CuSO4的營養(yǎng)液；④T3：噴施含80 μmol/L CuSO4的營養(yǎng)液；⑤T4：噴施含120 μmol/L CuSO4的營養(yǎng)液；⑥T5：噴施含 180 μmol/L CuSO4的營養(yǎng)液；⑦T6：噴施含 240 μmol/L CuSO4的營養(yǎng)液；⑧T7：噴施含 300 μmol/L CuSO4的營養(yǎng)液。完全隨機(jī)排列，3次重復(fù)，每重復(fù)21株。

處理后15、20、25 d取葉片測(cè)定相關(guān)生理指標(biāo)，處理后25 d測(cè)定相關(guān)生長指標(biāo)。240 μmol/L濃度（T6處理）以上的CuSO4脅迫的幼苗生長緩慢，植株矮小，處理后18 d即開始死苗，到25 d時(shí)死苗率 47.06%；300 μmol/L CuSO4（T7處理）脅迫死苗63.64%，故未測(cè)定T6、T7處理的生理指標(biāo)。

1.3 指標(biāo)測(cè)定方法

①生長指標(biāo) 測(cè)量基質(zhì)表面到植株最大葉尖端的高度為株高，從根莖結(jié)合處到整株最長根根尖的長度為根長；以完全展開葉為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)葉片數(shù)，并測(cè)量植株最大葉的長度和寬度。植株用蒸餾水洗凈后吸干水分，從根莖相連處剪斷，分為地上部和根系，分別稱量鮮質(zhì)量；在通風(fēng)烘箱中105℃下殺青15 min后降溫到75℃下烘干到恒重，稱量干質(zhì)量。

②生理指標(biāo) 參照沈偉其[13]的方法提取光合色素，用打孔器在葉片上取圓片，置于乙醇丙酮混合液中暗提取 24 h，而后測(cè)定 OD440nm、OD645nm、OD663nm，根據(jù)王素平等[14]的方法計(jì)算葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量。質(zhì)膜透性用電導(dǎo)率儀測(cè)定，用相對(duì)電導(dǎo)率表示[15]；抗壞血酸含量按照趙會(huì)杰[16]的方法測(cè)定。

數(shù)據(jù)用DPS軟件進(jìn)行方差分析，Duncan's新復(fù)極差法進(jìn)行平均數(shù)間的多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 CuSO4脅迫對(duì)小白菜幼苗生長的影響

①對(duì)形態(tài)指標(biāo)的影響 由表1數(shù)據(jù)表明，小白菜株高、最大葉長、最大葉寬在20 μmol/L CuSO4脅迫下均顯著增大，40、80 μmol/L CuSO4處理與 CK無顯著差異，120 μmol/L濃度以上則隨CuSO4濃度提高而顯著減小；除20、40 μmol/L CuSO4處理與CK無顯著差異外，葉片數(shù)隨CuSO4濃度的增加顯著減少；根長隨CuSO4濃度提高呈先增加后減少的趨勢(shì)，在 40 μmol/L CuSO4下達(dá)最大值，120 μmol/L 濃度以下均大于CK，180 μmol/L濃度以上則小于CK。

②對(duì)生物量積累的影響 由表2可知，小白菜地上部和根系的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量均隨CuSO4濃度提高呈先增加后降低的趨勢(shì)，地上部鮮質(zhì)量在40 μmol/L CuSO4處理下達(dá)到最大值，地上部干質(zhì)量、根系鮮質(zhì)量和干質(zhì)量均在20 μmol/L CuSO4下達(dá)到最大值，但80 μmol/L CuSO4濃度以下各生物量積累均大于CK，120 μmol/L濃度以上則均小于CK，180 μmol/L濃度以上CuSO4處理各生物量與CK間差異達(dá)到顯著水平。結(jié)合形態(tài)指標(biāo)數(shù)據(jù)可看出，較低濃度CuSO4處理有利于促進(jìn)小白菜植株的生長，較高濃度CuSO4脅迫則會(huì)顯著抑制小白菜的生長。

表1 不同濃度CuSO4脅迫對(duì)小白菜形態(tài)指標(biāo)的影響

表2 不同濃度CuSO4脅迫對(duì)小白菜生物量積累的影響

2.2 CuSO4脅迫對(duì)小白菜葉片光合色素含量的影響

圖1顯示，小白菜葉片各光合色素含量均隨CuSO4濃度提高呈先增加后降低的趨勢(shì)，處理后15 d，各光合色素含量在40 μmol/L CuSO4處理下達(dá)到最大值，在180 μmol/L CuSO4處理下與CK無顯著差異；處理后20 d和25 d，各光合色素含量均在20 μmol/L CuSO4處理下達(dá)到最大值，40、80 μmol/L CuSO4處理下與 CK 無顯著差異，120、180 μmol/L CuSO4處理下均顯著低于CK。結(jié)果說明，較低濃度CuSO4處理對(duì)小白菜光合色素合成有一定的促進(jìn)作用，但隨處理時(shí)間延長這種促進(jìn)作用減弱，高濃度CuSO4脅迫則會(huì)抑制光合色素的合成，加快其降解。

2.3 CuSO4脅迫對(duì)小白菜葉片質(zhì)膜透性和抗壞血酸含量的影響

由圖2可以看出，隨CuSO4濃度提高，小白菜葉片相對(duì)電導(dǎo)率均較CK增加，抗壞血酸含量呈先增加后降低的規(guī)律，處理后15 d和20 d時(shí)抗壞血酸含量在120 μmol/L CuSO4處理下達(dá)到最大值，處理后25 d時(shí)在80 μmol/L CuSO4處理下達(dá)到最大值。小白菜抗壞血酸含量除25 d時(shí)180 μmol/L CuSO4處理下與CK間無差異外，其他濃度CuSO4處理下均顯著高于CK，且隨處理時(shí)間延長，不同處理間抗壞血酸含量的變化幅度減小。說明CuSO4脅迫嚴(yán)重破壞小白菜葉片細(xì)胞膜，使其葉片電解質(zhì)滲透率顯著增加，且脅迫程度越大，質(zhì)膜傷害越重；同時(shí)CuSO4脅迫誘導(dǎo)抗壞血酸合成以抵抗質(zhì)膜的過氧化傷害，但CuSO4濃度超過120 μmol/L，抗壞血酸的合成速度慢于自由基產(chǎn)生的速度。

3 討論與結(jié)論

重金屬脅迫會(huì)導(dǎo)致植物生長發(fā)育受阻、產(chǎn)量下降，甚至物種消失[17，18]。不同植物對(duì)銅的需求量存在差異，在銅脅迫下生長發(fā)育受到抑制的程度也不相同[3，4，17，19，20]。一些研究表明，葉菜類蔬菜對(duì)銅的吸收富集一般大于果菜類和根菜類蔬菜，而小白菜又是葉菜類當(dāng)中對(duì)銅的吸收富集較強(qiáng)的一種蔬菜[3，20～22]。本研究中，低濃度CuSO4處理明顯促進(jìn)了小白菜幼苗的生長，高濃度CuSO4脅迫則顯著抑制了小白菜的生長，也證明了小白菜對(duì)銅脅迫的耐受性較強(qiáng)。

研究表明，銅脅迫使植物葉綠素酶活性提高，加快葉綠素分解，使葉綠素合成受到抑制，導(dǎo)致光合色素含量降低[23，24]。光合色素含量的降低使得光合作用無法達(dá)到正常水平，有機(jī)物質(zhì)合成受阻，植株生長發(fā)育受到很大影響[25，26]。本研究中，小白菜葉片光合色素含量在較低濃度CuSO4處理下增加，可能是低濃度CuSO4處理促進(jìn)了光合色素的合成，這與王友保等[27]的研究結(jié)果一致；較高濃度CuSO4脅迫使葉片光合色素含量顯著降低，且隨脅迫時(shí)間的延長降低幅度增大，這可能是由于CuSO4脅迫使葉綠素酶活性提高，加快葉綠素分解而使其合成受阻，且這種效應(yīng)隨脅迫時(shí)間延長而逐漸顯現(xiàn)。

圖1 不同濃度CuSO4脅迫對(duì)小白菜葉片光合色素含量的影響

圖2 不同濃度CuSO4脅迫對(duì)小白菜質(zhì)膜透性和抗壞血酸含量的影響

膜系統(tǒng)是保護(hù)細(xì)胞抵御重金屬脅迫傷害的關(guān)鍵部位，高濃度銅會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)自由基大量產(chǎn)生，造成質(zhì)膜的過氧化傷害，膜蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，選擇透性增大，使生物體內(nèi)各種物質(zhì)的運(yùn)輸和許多生理代謝過程受到影響[3，28，29]。植物可通過酶促和非酶促的抗氧化系統(tǒng)清除體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧，降低活性氧大量積累對(duì)膜脂的過氧化傷害，抗壞血酸就是細(xì)胞內(nèi)一種有效的非酶抗氧化物質(zhì)[24，28，30，31]。本研究中，CuSO4脅迫使小白菜葉片質(zhì)膜透性和抗壞血酸含量顯著增加，說明CuSO4脅迫造成小白菜體內(nèi)活性氧大量產(chǎn)生，使膜脂過氧化加劇、電解質(zhì)大量滲漏，同時(shí)誘發(fā)抗壞血酸大量合成，以消除活性氧，抵制膜脂過氧化對(duì)細(xì)胞的傷害，但超過一定程度后，小白菜的抗氧化能力就難以抵抗脅迫造成的過氧化傷害。

總之，低濃度CuSO4處理有助于促進(jìn)小白菜葉片光合色素的合成，使光合作用加強(qiáng)，從而在一定程度上促進(jìn)小白菜的生長。高濃度CuSO4脅迫則使小白菜光合色素合成受阻而分解加速，且活性氧大量產(chǎn)生，膜脂過氧化加劇，同時(shí)大量合成抗壞血酸以清除活性氧，但細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生-清除的平衡失調(diào)，使小白菜的生理代謝受到抑制，進(jìn)而抑制小白菜的生長。本研究中，180 μmol/L CuSO4脅迫使小白菜生物量降低將近一半，但小白菜仍能維持其生長發(fā)育，240 μmol/L濃度以上CuSO4脅迫則使葉片枯黃、植株萎蔫，并有植株死亡，說明180 μmol/L是CuSO4脅迫抑制小白菜生長的閾值濃度。

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