范子彥，翟 妞，李中皓，楊 飛，劉珊珊，張洪非，邊照陽，唐綱嶺*

1.國(guó)家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2號(hào) 450001

2.國(guó)家煙草基因研究中心，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2號(hào) 450001

不同抽吸模式下煙氣冷凝物對(duì)人口腔細(xì)胞體外生長(zhǎng)增殖的影響

范子彥1，翟 妞2，李中皓1，楊 飛1，劉珊珊1，張洪非1，邊照陽1，唐綱嶺*1

1.國(guó)家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2號(hào) 450001

2.國(guó)家煙草基因研究中心，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2號(hào) 450001

為考察卷煙煙氣暴露對(duì)人口腔細(xì)胞體外生長(zhǎng)增殖的影響，以肯塔基參比卷煙3R4F為試驗(yàn)卷煙，人口腔表皮樣癌細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，分別在ISO和加拿大深度抽吸（HCI）模式下制備煙氣冷凝物并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染毒暴露，評(píng)估了兩種抽吸模式下煙氣暴露對(duì)人口腔細(xì)胞代謝活性及核酸復(fù)制活性的影響，并結(jié)合主流煙氣總粒相物（TPM）中主要有害成分的釋放水平進(jìn)行了分析。結(jié)果表明：①煙氣冷凝物暴露對(duì)人口腔細(xì)胞體外增殖有抑制作用，對(duì)人口腔細(xì)胞代謝活性以及核酸的復(fù)制活性有一定的毒性作用。②HCI抽吸模式下3R4F卷煙單位TPM和單位煙堿中有害成分的釋放量低于ISO模式，HCI抽吸模式下制備的煙氣冷凝物含水率高于ISO模式，這兩種因素是導(dǎo)致3R4F卷煙HCI模式下煙氣冷凝物細(xì)胞毒性弱于ISO模式的主要原因。

人口腔細(xì)胞;煙氣冷凝物;細(xì)胞增殖毒性;抽吸模式;3R4F

流行病學(xué)研究表明口腔疾病的發(fā)生與吸煙有一定的相關(guān)性，發(fā)病過程涉及基因損傷、蛋白異常表達(dá)、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等多個(gè)生物效應(yīng)的參與，但具體的致病機(jī)制尚未闡明［1-3］。為了闡明致病機(jī)制，基于煙氣冷凝物的體外毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法已被建立并廣泛應(yīng)用于卷煙煙氣介導(dǎo)的口腔毒理學(xué)研究。目前的煙氣冷凝物的制備主要是在國(guó)際標(biāo)準(zhǔn) ISO 4387：2000［4］中所規(guī)定的吸煙機(jī)參數(shù)條件下進(jìn)行。隨著全球控?zé)熯\(yùn)動(dòng)的不斷高漲，特別是在《煙草控制框架公約》［5］正式生效以來，以世界衛(wèi)生組織為代表的控?zé)煓C(jī)構(gòu)對(duì)ISO抽吸模式提出了質(zhì)疑，認(rèn)為ISO抽吸模式下卷煙煙氣釋放量不能真實(shí)反映人體實(shí)際攝取量，并推薦了加拿大深度抽吸（HCI）模式［6］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在這兩種卷煙抽吸模式下，卷煙主流煙氣中的焦油、煙堿、煙草特有亞硝胺等的釋放量存在差異［7-9］，這在一定程度上表明不同抽吸模式下制備的煙氣冷凝物對(duì)口腔細(xì)胞的毒性存在潛在差異。另一方面，開展常規(guī)的煙氣毒理學(xué)測(cè)試研究是使用動(dòng)物細(xì)胞模型，比如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CHO等，獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果能否外推至人體還存在一定的爭(zhēng)議［10-12］。因此，在ISO和HCI抽吸模式下分別制備卷煙主流煙氣冷凝物，采用不同暴露濃度（質(zhì)量濃度）對(duì)人體口腔細(xì)胞進(jìn)行體外染毒暴露，評(píng)估不同抽吸模式對(duì)人口腔細(xì)胞體外生長(zhǎng)增殖的毒性作用，旨在為吸煙與口腔疾病的關(guān)系研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

肯塔基參比卷煙3R4F（美國(guó)肯塔基大學(xué)）；人口腔表皮樣癌KB細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心）。α-MEM培養(yǎng)基、滅菌PBS（美國(guó)Gibco公司）；胎牛血清（北京四季青公司）；胰酶、二甲基亞砜（生物純，DMSO，美國(guó)Amresco公司）；3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（噻唑藍(lán)，MTT）染色試劑（美國(guó)Introvigen公司）；5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-Bromo-2-deoxyuridine，BrdU）摻入實(shí)驗(yàn)試劑盒（美國(guó)Roche公司）。

CP2245電子分析天平（感量：0.000 1 g，德國(guó)Satorious公司）；Thermo Scientific Series 8000型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、Forma 900超低溫冰箱、超凈工作臺(tái)（美國(guó)Thermo公司）；細(xì)胞培養(yǎng)瓶、96微孔板（美國(guó)Corning Costar公司）；DMI 4000B倒置熒光顯微鏡（德國(guó)Leica公司）；Spextra Max M5酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices公司）；RM20H轉(zhuǎn)盤型吸煙機(jī)（德國(guó)Borgwaldt KC公司）；空氣浴搖床（上海智城公司）；Milli-Q超純水純化系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)

將卷煙樣品于（22±1）℃和相對(duì)濕度（60±3）%條件下平衡48 h。用RM20H轉(zhuǎn)盤型吸煙機(jī)在ISO和HCI兩種抽吸模式下分別抽吸卷煙并制備煙氣冷凝物。設(shè)計(jì)不同的煙氣冷凝物濃度對(duì)口腔細(xì)胞進(jìn)行24 h染毒實(shí)驗(yàn)，用MTT和BrdU核酸摻入試驗(yàn)分別對(duì)細(xì)胞中線粒體的代謝活性和核酸復(fù)制活性進(jìn)行考察，評(píng)估煙氣冷凝物對(duì)人口腔細(xì)胞體外生長(zhǎng)增殖的影響，實(shí)驗(yàn)方案如圖1所示。

1.2.2 不同抽吸模式下煙氣冷凝物的制備

按照 GB/T 5606.1—2004［13］抽取卷煙樣品，并用RM20H轉(zhuǎn)盤型吸煙機(jī)在ISO和HCI兩種抽吸條件下分別抽吸，用92 mm劍橋?yàn)V片收集煙氣總粒相物TPM，根據(jù)TPM的質(zhì)量加入相應(yīng)體積的DMSO，制得最終濃度為10 mg/mL的TPM儲(chǔ)備液［14］。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

將人口腔表皮樣癌KB細(xì)胞置于含10%胎牛血清的a-MEM完全培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞匯合率為70%～80%時(shí)，用胰酶消解，培養(yǎng)基重懸制成單細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至4×104個(gè)/mL，按每孔100μL接種到96孔板，過夜培養(yǎng)。當(dāng)傳代細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，棄去培養(yǎng)基，加入100μL不同濃度梯度的煙氣冷凝物對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染毒，同時(shí)根據(jù)不同濃度梯度煙氣冷凝物中DMSO的體積分?jǐn)?shù)設(shè)計(jì)空白對(duì)照組。

1.2.4 MTT試驗(yàn)

稱取0.5 g MTT，溶于100 mL 50 mmol/L的磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）中，用0.22μm水相濾膜過濾除去溶液中的細(xì)菌，制成5 mg/mL MTT溶液。細(xì)胞染毒24 h后，每孔加入20μL MTT溶液，在37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)基。每孔加入150μL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解，在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)量每孔吸光值。1.2.5 BrdU摻入試驗(yàn)

圖1 實(shí)驗(yàn)方案

細(xì)胞染毒24 h后，每孔添加BrdU標(biāo)記溶液10 μL，在37 ℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)2 h，棄去培養(yǎng)基。用甲醇/醋酸固定細(xì)胞10 min，再用甲酰胺處理細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)的核酸變性。用200μL PBS清洗細(xì)胞3次，每孔加入100μL辣根過氧化物酶標(biāo)記的BrdU抗體。用PBS清洗細(xì)胞后，每孔加入100μL底物，在370 nm波長(zhǎng)下測(cè)量每孔的吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同抽吸模式下煙氣冷凝物對(duì)人口腔細(xì)胞的增殖活性的影響

2.1.1 對(duì)細(xì)胞代謝活性的影響

煙氣毒理學(xué)評(píng)估中常用的細(xì)胞有中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CHO細(xì)胞），小鼠肺泡巨噬細(xì)胞（AM細(xì)胞）等［15］，由于將動(dòng)物細(xì)胞研究結(jié)果外推至人體存在一定的爭(zhēng)議，因而人支氣管上皮細(xì)胞（BEP2D細(xì)胞）被引入煙氣毒理學(xué)測(cè)試［16］。但人支氣管上皮細(xì)胞是肺部細(xì)胞，在功能上與口腔細(xì)胞存在一定的差異。因此，在本研究中，以人口腔表皮樣癌KB細(xì)胞為模型細(xì)胞［17］，分別用ISO和HCI抽吸模式下制備的煙氣冷凝物對(duì)人口腔細(xì)胞進(jìn)行染毒，并使用MTT觀察煙氣冷凝物對(duì)細(xì)胞代謝活性的影響。MTT是一種熒光染料，它在活細(xì)胞線粒體中琥珀酸脫氫酶的作用下，還原成水不溶的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan），并沉積在細(xì)胞中，它能夠準(zhǔn)確反映細(xì)胞中線粒體的代謝活性。MTT試驗(yàn)結(jié)果（圖2）顯示，細(xì)胞用ISO和HCI模式下制備的煙氣冷凝物分別染毒后，甲瓚的熒光強(qiáng)度隨著煙氣冷凝物濃度的升高而逐漸降低，表明口腔細(xì)胞內(nèi)線粒體的代謝活性受到了抑制，不能將MTT染料還原成甲瓚。對(duì)比圖2中人口腔細(xì)胞的代謝活性抑制曲線還可以發(fā)現(xiàn)，ISO模式下細(xì)胞的代謝活性降低速率大于HCI模式。采用t檢驗(yàn)對(duì)圖2中ISO和HCI模式下各暴露濃度點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果表明，空白實(shí)驗(yàn)以及40和300 mg/L煙氣冷凝物暴露濃度下，兩種抽吸模式下的MTT試驗(yàn)結(jié)果沒有顯著性差異，其他暴露濃度下均存在顯著性差異。以80和160 mg/L為例，p值分別為0.002和0.03，其他系列濃度下的p值也均小于0.05?？梢?，在單位TPM濃度下，ISO模式的口腔細(xì)胞代謝毒性要大于HCI模式。

圖2 煙氣冷凝物對(duì)口腔細(xì)胞代謝活性的影響（n=3）

2.1.2 對(duì)核酸復(fù)制活性的影響

傳統(tǒng)的遺傳毒性評(píng)估主要是采用細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)、小鼠微核試驗(yàn)、人細(xì)胞程序外DNA合成試驗(yàn)等，前兩種方法中分別使用細(xì)菌和動(dòng)物細(xì)胞模型進(jìn)行評(píng)估，人細(xì)胞程序外DNA合成試驗(yàn)則直接反映外源物刺激對(duì)人細(xì)胞核酸復(fù)制的影響［18］。因此，為了直接評(píng)估煙氣冷凝物對(duì)人口腔細(xì)胞核酸復(fù)制的影響，同時(shí)為后續(xù)的口腔細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組實(shí)驗(yàn)尋找合適的暴露濃度［19］，采用BrdU核酸摻入試驗(yàn)考察了煙氣冷凝物的口腔細(xì)胞遺傳毒性。BrdU是DNA前體胸腺嘧啶核苷類似物，通過競(jìng)爭(zhēng)摻入S期細(xì)胞單鏈DNA核苷酸序列替代胸腺嘧啶和檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)核酸的BrdU摻入情況，可以直接評(píng)估細(xì)胞內(nèi)的核酸復(fù)制活性，也能間接反映煙氣冷凝物對(duì)人口腔細(xì)胞的遺傳毒性。從圖3中可以看出，與MTT試驗(yàn)結(jié)果類似，ISO抽吸模式下制備的煙氣冷凝物對(duì)人口腔細(xì)胞核酸復(fù)制活性的抑制作用要大于HCI模式，表明ISO模式下的煙氣冷凝物對(duì)人口腔細(xì)胞有較高的潛在遺傳毒性。對(duì)圖3中各暴露濃度點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果表明，在空白實(shí)驗(yàn)和最大暴露濃度下，兩種抽吸模式煙氣冷凝物的BrdU試驗(yàn)結(jié)果沒有顯著性差異，其他暴露濃度下均存在顯著性差異。以80和160 mg/L為例，p值分別是0.004和0.02，其他系列濃度下的p值也均小于0.05。

圖3 煙氣冷凝物對(duì)口腔細(xì)胞核酸復(fù)制活性的影響（n=3）

2.1.3DMSO對(duì)MTT和BrdU試驗(yàn)的影響

在煙氣冷凝物制備過程中，以DMSO為TPM的萃取溶劑。為了評(píng)估DMSO在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中的毒理效應(yīng)貢獻(xiàn)，根據(jù)煙氣冷凝物的用量，計(jì)算出細(xì)胞染毒時(shí)DMSO的量，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行單獨(dú)的DMSO暴露。結(jié)果（圖4）顯示，當(dāng)DMSO的體積分?jǐn)?shù)低于2%時(shí)，不會(huì)對(duì)人口腔細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)毒性作用?？梢姡琈TT和BrdU試驗(yàn)中細(xì)胞毒性主要是由煙氣冷凝物暴露所致。

圖4 DMSO暴露對(duì)口腔細(xì)胞毒性的影響（n=3）

2.2 不同抽吸模式下煙氣中有害成分釋放量的差異分析

煙氣冷凝物的細(xì)胞毒性主要由煙氣中的有害成分導(dǎo)致，據(jù)文獻(xiàn)［8,20-21］報(bào)道，不同抽吸模式下，煙氣中有害成分的釋放量存在差異，這些差異可能是對(duì)口腔細(xì)胞的毒性造成差異的原因。因此，對(duì)肯塔基參比卷煙3R4F煙氣中主要有害成分的釋放量進(jìn)行了定量分析，得到了單位TPM和單位煙堿有害成分釋放量（表1）。將表1中幾種有害成分的單位TPM和煙堿釋放量進(jìn)行歸一化處理，得到兩種抽吸模式下3R4F煙氣中粒相物主要有害成分的釋放量比值（圖5）。由圖5可知，幾種有害成分的HCI/ISO比值均小于1，說明盡管HCI模式下每支卷煙煙氣粒相物中主要有害成分的釋放量大于ISO模式，但是單位TPM或單位煙堿有害成分釋放量則相反，從而導(dǎo)致MTT和BrdU試驗(yàn)中HCI模式下煙氣冷凝物的細(xì)胞毒性弱于ISO模式。

表1 3R4F煙氣粒相物中主要有害成分釋放量①

圖5 兩種抽吸模式下3R4F煙氣中粒相物主要有害成分的釋放量比值（HCI/ISO）

2.3 不同抽吸模式下煙氣含水率差異分析

采用CORESTA推薦的方法檢測(cè)了兩種抽吸模式下3R4F卷煙主流煙氣水分，其中ISO模式下煙氣水分為134μg/mg TPM，而HCI模式下的煙氣水分為425μg/mg TPM，表明在HCI抽吸模式下，煙氣含水率大幅升高，稀釋了煙氣中的有害成分。另一方面，煙氣中單位煙堿有害成分釋放量扣除了水分的影響。圖5表明，在HCI模式下，單位煙堿有害成分釋放量較ISO模式下也有所降低，這可能是因?yàn)镠CI模式下卷煙得到了充分燃燒所致。可見，對(duì)于肯塔基參比卷煙3R4F，HCI模式下煙氣冷凝物的細(xì)胞毒性低于ISO模式是由水分釋放量增加以及單位TPM、單位煙堿有害成分釋放量降低共同導(dǎo)致。

3 結(jié)論與討論

以3R4F為試驗(yàn)卷煙，分別在ISO和HCI抽吸模式下制備煙氣冷凝物，以人口腔表皮樣癌細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停褂脽煔饫淠飳?duì)細(xì)胞進(jìn)行染毒暴露，評(píng)估了不同抽吸模式下煙氣冷凝物對(duì)人口腔細(xì)胞體外生長(zhǎng)增殖的毒性作用。煙氣冷凝物暴露對(duì)人口腔細(xì)胞體外生長(zhǎng)增殖具有抑制作用，對(duì)人口腔細(xì)胞的線粒體的代謝活性以及核酸的復(fù)制活性具有一定的毒性作用。煙氣冷凝物對(duì)細(xì)胞代謝活性和核酸復(fù)制活性的影響可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)疾病相關(guān)基因的差異表達(dá)，而相關(guān)的調(diào)控通路上關(guān)鍵蛋白因子受基因調(diào)控也會(huì)差異表達(dá)，并最終產(chǎn)生一定的生理效應(yīng)，這將為后續(xù)的基因和蛋白水平的研究提供線索。

對(duì)主流煙氣粒相物有害成分釋放水平的進(jìn)一步研究表明，HCI模式下3R4F卷煙單位TPM和單位煙堿有害成分釋放量低于ISO模式，這與Roemer等［22］的研究結(jié)果相一致。另一方面，HCI抽吸模式制備的煙氣冷凝物含水率高于ISO模式。因此，上述兩個(gè)因素是導(dǎo)致3R4F卷煙煙氣冷凝物HCI模式下煙氣冷凝物細(xì)胞毒性弱于ISO模式的主要原因。值得注意的是，在HCI模式下，單支卷煙的有害成分釋放量大于ISO模式，對(duì)生物體存在較高的安全風(fēng)險(xiǎn)。然而，目前的體外毒理學(xué)評(píng)價(jià)是基于單位TPM的方式，這不能有效反映單支卷煙不同抽吸模式下有害成分釋放物對(duì)生物體的影響，因此，為了更有效、真實(shí)地反映煙氣暴露的生物效應(yīng)，基于卷煙全煙氣暴露的煙氣毒理學(xué)評(píng)估方法今后將得到更多的關(guān)注。

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Effects of Cigarette Smoke Condensate Collected Under Different Smoking Regimes on in vitro Proliferation of Human Oral Cell

FAN Ziyan1,ZHAI Niu2,LI Zhonghao1,YANG Fei1,LIU Shanshan1,ZHANG Hongfei1,BIAN Zhaoyang1,and TANG Gangling*1
1.China National Tobacco Quality Supervision and Test Center,Zhengzhou 450001,China
2.China National Tobacco Gene Research Center,Zhengzhou 450001,China

In order to investigate the effects of exposure to cigarette smoke on the in vitro proliferation of human oral cell,Kentucky 3R4F reference cigarette was used as experimental cigarette and human oral epidermoid carcinoma cell line KB as experimental model.Cigarette smoke condensates(CSCs)were collected under ISO and Health Canada Intense(HCI)smoking regimes for the exposure assessment of human oral cells,the effects of CSCs on the metabolic activity and nucleic acid replication activity of the cells were assessed,and further analyzed versus the release levels of main harmful components in total particulate matter(TPM)of mainstream cigarette smoke.The results indicated that:1）CSCs exposure inhibited the in vitro proliferation of oral cells and imparted certain toxicity to their metabolic activity andnucleic acid replication activity.2）Under HCI smoking regime,the release of harmful components per unit TPM and per unit nicotine in mainstream smoke of 3R4F reference cigarette was lower and the moisture content in CSCs was higher than those under ISO regime;these two factors explained the lower cytotoxicity of HCI regime CSCs.

Human oral cell;Cigarette smoke condensate;Cell proliferation toxicity;Smoking regime;3R4F

TS416

A

1002-0861（2015）12-0048-06

10.16135/j.issn1002-0861.20151208

2014-12-24

2015-08-12

中國(guó)煙草總公司科技重點(diǎn)項(xiàng)目“國(guó)內(nèi)外卷煙主要有害成分釋放量中位值及其影響因素研究”（562014AA0020）；中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院院長(zhǎng)基金項(xiàng)目“煙氣暴露介導(dǎo)的口腔原代細(xì)胞miRNA表達(dá)譜及其靶基因的篩選與鑒定”（512013CA0120）。

范子彥（1983—），博士，工程師，主要從事煙草化學(xué)檢驗(yàn)和煙氣毒理學(xué)研究。E-mail:fanzy@ztri.com.cn；*

唐綱嶺，E-mail:tglcttc@163.com

范子彥，翟妞，李中皓，等.不同抽吸模式下煙氣冷凝物對(duì)人口腔細(xì)胞體外生長(zhǎng)增殖的影響［J］.煙草科技，2015，48（12）：48-53.FAN Ziyan,ZHAI Niu,LI Zhonghao,et al.Effects of cigarette smoke condensate collected under different smoking regimes on in vitro proliferation of human oral cell［J］.Tobacco Science&Technology,2015,48（12）：48-53.

責(zé)任編輯 洪廣峰