劉 芳，宋紀真，范藝寬，牟文君，奚家勤*，胡利偉*

1.中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2號 450001

2.中國煙草總公司河南省公司，鄭州市政七街7號 450008

基于鎖核苷酸（LNA）增敏的植煙土壤中煙草黑脛病菌定量PCR檢測方法

劉 芳1，宋紀真1，范藝寬2，牟文君1，奚家勤*1，胡利偉*1

1.中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2號 450001

2.中國煙草總公司河南省公司，鄭州市政七街7號 450008

為了快速有效地檢測植煙土壤中的煙草黑脛病菌的定殖數(shù)量，以一種鎖核苷酸（LNA）引物為基礎，進行了植煙土壤中煙草黑脛病菌數(shù)量的定量PCR檢測方法研究。結果表明：①與普通DNA引物相比，LNA引物提高了PCR反應的退火溫度，減少了引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成，提高了煙草黑脛病菌分子檢測的靈敏度與特異性；②定量分析檢測出14個煙草-大蒜輪作土樣中煙草黑脛病菌的定殖數(shù)量為2.76×103～5.20×104個/g，且在4～5 h內(nèi)完成檢測，具有較高的靈敏度和檢測效率。

植煙土壤；煙草黑脛病菌；鎖核苷酸（LNA）；熒光定量PCR；分子檢測

煙草黑脛病是一種毀滅性的土傳真菌病害，由寄生疫霉煙草變種（Phytophthora parasitic var.nicotianae）引起，在我國許多產(chǎn)煙區(qū)尤其是北方煙區(qū),如安徽、山東和河南等省發(fā)病較重，給煙葉生產(chǎn)造成嚴重損失［1-3］。由于煙草黑脛病的發(fā)病率高、分布范圍廣、造成的經(jīng)濟損失大，因此對其進行快速有效診斷和檢測一直是病害防治工作的重點和前提［4］。植煙土壤中的黑脛病菌定殖量直接影響煙區(qū)的煙草黑脛病發(fā)病率，所以檢測植煙土壤中的黑脛病菌定殖量對預測煙草黑脛病的發(fā)生具有重要意義。由于土壤微生態(tài)環(huán)境復雜，雜菌種類繁多，給檢測工作帶來了很大的困難，因此需要高靈敏度和高特異性的檢測方法對土壤中煙草黑脛病菌的定殖量進行有效檢測。近年來，PCR技術尤其是熒光定量PCR技術為快速、準確和靈敏地定量檢測微生物數(shù)量提供了有效手段［5］。謝勇等［6］合成了一對17 bp的特異性寡聚核苷酸引物，采用普通PCR可對煙草黑脛病菌進行快速檢測；Ippolito等［7］和Blaya等［8］曾先后采用Real-time PCR對土壤中的煙草黑脛病菌進行了定性或定量分析，并取得了一定效果。隨著分子檢測方法的改進，相應PCR引物的設計也引起了人們的重視。一種被命名為鎖核苷酸（Locked Nucleic Acid，LNA）［9］的新型寡核苷酸衍生物應運而生，其結構中的β-D-呋喃核糖的2’-O、4’-C位點可通過縮水形成環(huán)形結構，如氧亞甲基橋、硫亞甲基橋或胺亞甲基橋等，這種結構能夠鎖定呋喃糖的N構型，一定程度上降低了核糖結構的柔韌性，增加了核酸鏈之間雜交的穩(wěn)定性［9-12］。國外有報道表明，LNA修飾后能夠顯著增強寡核苷酸與DNA模板的結合能力，與普通DNA引物相比，LNA引物能夠提高PCR的特異性和靈敏性［13-14］；并且在相對更寬泛的PCR退火溫度范圍內(nèi)，LNA引物仍可以保持很高的擴增效率［15］。這種LNA引物已經(jīng)應用于許多分子檢測體系中，但在煙草黑脛病菌的檢測和診斷方面則未見報道。為此，通過對比煙草黑脛病菌特異性普通DNA引物及堿基修飾后的LNA引物的反應條件，探討LNA引物對PCR擴增的影響，并采用熒光定量PCR檢測植煙土樣中煙草黑脛病菌的定殖數(shù)量，旨在建立一種鎖核苷酸（LNA）增敏的植煙土壤中煙草黑脛病菌定量PCR檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

供試感病煙株采集于洛陽煙區(qū)；供試土樣采集于駐馬店煙區(qū)的煙草-大蒜輪作的田塊。

燕麥培養(yǎng)基［16］、含氨芐的LB培養(yǎng)基均在實驗室內(nèi)現(xiàn)用現(xiàn)配；土壤病原菌DNA提取試劑盒購自美國MOBIO公司，PCR試劑購自德國QIAGEN公司；pMD18-T載體、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、DH5α感受態(tài)大腸桿菌、質(zhì)粒小量提取試劑盒、SYBR Green I均購自日本TaKaRa公司；引物合成和測序由美國Invitrogen公司和生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 試驗設計

1.2.1 病原菌的分離及培養(yǎng)

將感黑脛病煙株的莖部沖洗干凈，用滅菌刀將莖部剖開，從病健交界處取大約3 mm×3 mm的碟片狀髓部組織，依次通過NaClO、75%乙醇進行表面消毒，經(jīng)無菌水漂洗2～3次。將漂洗過的組織用無菌濾紙吸干后接種到燕麥培養(yǎng)基上，放入恒溫箱中28℃下對菌落進行純化培養(yǎng)，并將純化后的菌株保藏到4℃冰箱中。

1.2.2 菌株和土壤病原菌DNA的提取

采用POWERSOIL DNA提取試劑盒進行土壤黑脛病菌DNA的提取，具體操作參照試劑盒說明書進行。采用CTAB（十三烷基三乙基溴化銨）法提取煙草黑脛病菌菌絲DNA［17］。

1.2.3 引物的設計與篩選

通過查閱文獻［18］和相關生物信息學分析［19］，獲得煙草黑脛病菌獨特的5.8S核糖體RNA及其相鄰的ITS區(qū)域，采用Primer Express 2軟件設計引物,見表1。運用常規(guī)PCR進行引物特異性檢測，總反應體系 25 μL，包括 10×PCR buffer 2.5 μL ；1 U Taq酶、0.2 mmol/L dNTP 混合液；0.2 μmol/L引物；25 ng DNA模板，最后加ddH2O補至25 μL。陰性對照為ddH2O。PCR反應條件：95℃預變性3 min；94 ℃變性 30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，40個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

LNA引物的設計：引物的LNA修飾對PCR反應的影響主要取決于LNA修飾的位置、數(shù)量和引物本身的序列長度，其中以在引物序列中間位置相距大約4～6個堿基的兩個堿基位點進行修飾的效果較好［20］。綜合考慮引物的設計原則及其特異性，對引物Pn3R/Pn3F兩個位置的堿基進行修飾。正向引物：5'-TGAACGCATATTGCACTTCC-3'，反向引物：5'-GACAAACCAGTCGCCAATTT-3'（下劃線字母為LNA堿基）。

表1 煙草黑脛病檢測的相關引物

1.2.4 LNA引物PCR反應體系和條件優(yōu)化

總反應體系 25 μL：10×buffer 2.5 μL；1 U Taq酶、0.2 mmol/L dNTP混合液；0.2 μmol/L的LNA引物；25 ng黑脛病菌DNA模板，加ddH2O補至25 μL，陰性對照為ddH2O。

反應條件：95℃預變性 3 min；94℃變性 30 s，分別以55.0、55.8、57.4、59.7、62.6、65.0和66.3 ℃的退火溫度退火30 s，72℃延伸30 s，40個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5 標準曲線的建立及土壤樣品中煙草黑脛病菌定殖數(shù)量的檢測

煙草黑脛病菌5.8S核糖體RNA及其相鄰的ITS區(qū)域克?。菏褂肞CR產(chǎn)物純化試劑盒對1.2.3節(jié)中采用Pn3R/Pn3F進行PCR擴增獲得的產(chǎn)物進行純化，具體操作按照試劑盒說明書進行。然后將4 μL純化產(chǎn)物與1 μL pMD18-T載體混合，加入5 μL連接溶液I（日本TaKaRa公司），連接體系為10 μL，16 ℃保溫12 h。取連接產(chǎn)物10μL與100 μL DH5α感受態(tài)大腸桿菌菌液混合均勻，冰浴25 min，42℃熱激45 s。接著將菌液涂布到含氨芐青霉素、IPTG和X-gal的 LB平板上，37℃過夜培養(yǎng)，挑取白斑進行PCR鑒定，然后挑取陽性克隆置于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，并于37℃振蕩培養(yǎng)箱中200 r/min振蕩16 h后，取1.5 mL菌液進行質(zhì)粒提取。

標準樣品的制備：按照試劑盒說明書，使用質(zhì)粒小量提取試劑盒從過夜培養(yǎng)的菌液中提取質(zhì)粒，采用紫外分光光度計法測定濃度，然后進行拷貝數(shù)換算。將質(zhì)粒溶液用ddH2O稀釋，分別稀釋成1×102～1×106個/μL 5個梯度作為模板（稀釋時用移液槍吹打15次，振蕩10 s，保證溶液充分混勻）。

同時對提取的14個土壤黑脛病菌DNA和不同濃度的質(zhì)粒標準品一起進行熒光定量PCR反應。熒光定量PCR反應于瑞士羅氏公司的LightCycler?480 Instrument II上進行。熒光定量PCR 反應總體系為 25 μL：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，引物各0.3 μmol/L，模板1 μL，加ddH2O補到25 μL。每個樣品重復3次。PCR反應條件為：95℃預變性3 min；95℃變性10 s，60℃退火15 s，72℃延伸15 s，50個循環(huán)；72℃延伸10 min。

2 結果與分析

2.1 引物設計與篩選

對提取的4個不同的土壤黑脛病菌DNA進行擴增反應的結果（圖1）表明：3對引物均可以擴增出長度大小不同的特異性條帶，但是靈敏度存在差異，引物Pn3R/Pn3F的靈敏度最高，Pn2R/Pn2F次之，Pn1R/Pn1F的靈敏度相對較弱。對擴增效果最好的一對引物Pn3R/Pn3F的PCR產(chǎn)物純化后進行測序，測序結果見圖2。通過NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，結果表明Pn3R/Pn3F的PCR擴增產(chǎn)物來自黑脛病菌，擴增的煙草黑脛病菌特異性目的條帶大小為251 bp。

圖1 3對引物對黑脛病菌DNA的PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

圖2 引物Pn3R/Pn3F的PCR擴增產(chǎn)物測序序列

2.2 LNA引物的PCR反應體系和條件的優(yōu)化

在相同的PCR反應體系及退火溫度下對黑脛病菌菌絲DNA進行擴增，并將DNA引物與LNA引物的擴增結果進行比對，結果見圖3。從電泳結果可以看出，在55～57℃的退火溫度條件下LNA引物的擴增效率稍高，但不顯著。當退火溫度提高到60℃以上時，普通DNA引物的擴增效率急劇下降且不穩(wěn)定，甚至在66℃的退火溫度下沒有特異性條帶產(chǎn)生。而在相同的PCR反應條件下，LNA引物的適宜退火溫度范圍更廣，在55～66℃均可以擴增出目的條帶，而普通DNA引物的適宜退火溫度范圍相對較窄。較高的退火溫度能夠減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成，與DNA引物相比，LNA引物不僅提高了煙草黑脛病菌分子檢測的靈敏度，還提高了檢測的特異性。

圖3 不同退火溫度下LNA引物與DNA引物的PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖

2.3 標準曲線的建立

將提取的含有目的片段的原始質(zhì)粒懸液的濃度單位換算成個數(shù)單位，進行稀釋后得到1.0×102～1.0×106個/μL的標準質(zhì)粒濃度梯度，并以其為模板進行實時熒光定量PCR反應，利用質(zhì)粒的濃度對數(shù)和對應的循環(huán)閾值（Ct）生成擴增反應標準曲線和直線回歸方程，擴增結果見圖4。圖4A表明煙草黑脛病菌DNA的10倍稀釋液均有明顯的擴增產(chǎn)物生成；圖4B的熔解曲線只在83～84℃之間出現(xiàn)了一個峰值，驗證了本試驗中設計的LNA引物具有高度特異性；圖4C為本試驗中建立的標準曲線，標準曲線的線性方程Y=-3.675 0X+40.876，R2=0.999 6，相關性較好，表明所建立的標準曲線具有可靠性和合理性，反應效率為1.831，可滿足定量PCR分析的要求。這些數(shù)據(jù)表明試驗中建立的標準曲線適用于植煙土壤中煙草黑脛病菌定殖數(shù)量的分析。

圖4 不同濃度梯度的標準質(zhì)粒懸液的熒光定量PCR擴增結果

2.4 土壤DNA的熒光定量PCR反應

將提取的土壤病原菌DNA同時與不同濃度梯度的質(zhì)粒懸液同時進行熒光定量PCR分析，待測土樣的黑脛病菌定殖數(shù)量可以根據(jù)其所測得的Ct值從直線回歸方程中計算得到。擴增結果（圖5）表明：圖5A中樣本的熒光強度隨著PCR循環(huán)次數(shù)的增加而增加，可以看出所有的土樣DNA均有明顯的擴增產(chǎn)物生成，不同的土樣中黑脛病菌的定殖量存在差異；圖5B表明該引物對提取的土壤DNA擴增反應的特異性高，證明了擴增結果的重復性和可靠性。本試驗中采用試劑盒對0.25 g土壤進行病原菌DNA提取，獲得100 μL DNA溶液，取1 μL進行定量PCR反應，將得到的Ct值代入標準曲線，得到1μL模板中煙草黑脛病菌的數(shù)量，計算得出采集的供試土樣1g土壤中的煙草黑脛病菌的定殖數(shù)量為2.76×103～5.20×104個，見表2。

圖5 14個植煙土壤黑脛病菌DNA樣品的熒光定量PCR擴增結果

表2 供試土壤中煙草黑脛病菌的定殖數(shù)量

3 結論與討論

將LNA引物運用于煙草黑脛病菌數(shù)量的定量PCR檢測中，建立了一種LNA增敏的檢測植煙土壤中黑脛病菌數(shù)量的定量PCR檢測方法。該方法以煙草黑脛病菌（Phytophthora parasitica var.nicotianae）中的5.8S核糖體RNA及其相鄰的ITS區(qū)域片段設計多對DNA引物，選擇擴增效率較好的一對引物（Pn3R/Pn3F）對其堿基修飾得到LNA引物，提高了引物的特異性和靈敏度。本試驗中的供試土壤為煙草-大蒜輪作地塊的土壤，利用設計的LNA引物對14個植煙土樣進行熒光定量PCR反應，可以檢測到土壤中黑脛病菌的定殖數(shù)量，證明在復雜的土壤環(huán)境中也可以有效地進行檢測，成功構建了一種基于LNA增敏的植煙土壤中黑脛病菌數(shù)量的定量PCR檢測方法。

該方法適用于復雜土壤中煙草黑脛病菌定殖數(shù)量的檢測，但本試驗中所選擇的材料僅來自河南省部分煙區(qū)，試驗材料尚不充分，而且LNA增敏的熒光定量PCR方法目前只針對植煙土壤中黑脛病菌定殖數(shù)量的檢測進行了試驗。從理論上分析，該方法同樣適用于煙草植株、病株殘體中黑脛病菌定殖數(shù)量的檢測，但尚有待進一步試驗驗證，另外在擴大試驗材料范圍如供試樣品的采集地和病原菌的寄主范圍方面也有待進一步研究。

［1］ Hickman C J.Presidential address：Phytophthora—plant destroyer［J］.Transactions of the British Mycological Society，1958，41（1）：2-13.

［2］ 馬國勝，陳娟.煙草黑脛病研究進展［J］.煙草科技，2001（9）：44-48.

［3］ 王靜，孔凡玉.煙草黑脛病綜合防治技術［J］.煙草科技，2002（8）：45-47.

［4］ 趙振山.中國煙葉生產(chǎn)實用技術指南［G］.中國煙葉生產(chǎn)購銷公司，2005.

［5］ Hagn A，Wallisch S，Radl V，et al.A new cultivation independent approach to detect and monitor common Trichoderma species in soil［J］. Journal of Microbiological Methods，2007，69（1）：86-92.

［6］ 謝勇，王云月，陳建斌，等.煙草黑脛病菌分子檢測［J］.云南農(nóng)業(yè)大學學報，2000，15（2）：176.

［7］ Ippolito A，Schena L，Nigro F，et al.Real-time detection of Phytophthora nicotianae and P.citrophthorain citrus roots and soil［J］.European Journal of Plant Pathology，2004，110（8）：833-843.

［8］ Blaya J，Lacasa C，Lacasa A，et al.Characterization of Phytophthora nicotianae isolates in southeast Spain and their detection and quantification through a real-time TaqMan PCR［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，2015，95（6）：1243-1251.

［9］ Koshkin A A，Nielsen P，Meldgaard M，et al.LNA（locked nucleic acid）：an RNA mimic forming exceedingly stable LNA：LNA duplexes［J］.Journal of the American Chemical Society，1998，120（50）：13252-13253.

［10］ Nielsen C B，Singh S K，Wengel J，et al.The solution structure of a locked nucleic acid（LNA）hybridized to DNA［J］. Journal of Biomolecular Structure and Dynamics，1999，17（2）：175-191.

［11］Braasch D A，Corey D R.Locked nucleic acid（LNA）：fine-tuning therecognition ofDNA and RNA［J］.Chemistry&Biology，2001，8（1）：1-7.

［12］S?rensen M D， Kv?rn? L， Bryld T， et al.α-L-ribo-configured locked nucleic acid（α-L-LNA）：synthesis and properties［J］.Journal of the American Chemical Society，2002，124（10）：2164-2176.

［13］Latorra D，Campbell K，Wolter A，et al.Enhanced allele-specific PCR discrimination in SNP genotyping using 3'locked nucleic acid（LNA）primers［J］.Human Mutation，2003，22（1）：79-85.

［14］ Latorra D，Hopkins D，Campbell K，et al.Multiplex allele-specific PCR with optimized locked nucleic acid primers［J］.Biotechniques，2003，34（6）：1150-1152.

［15］Crinelli R，Bianchi M，Gentilini L，et al.Design and characterization of decoy oligonucleotides containing locked nucleic acids［J］.Nucleic Acids Research，2002，30（11）：2435-2443.

［16］李錫坤.湖北省煙草黑脛病病原生理分化研究［D］.北京：中國農(nóng)業(yè)科學院，2011.

［17］吳發(fā)紅，黃東益，黃小龍，等.幾種真菌 DNA提取方法的比較［J］.中國農(nóng)學通報，2009，25（8）：62-64.

［18］劉冰，褚小靜，焦嬌，等.皖南煙田三種土傳病原物分子檢測［J］.中國煙草科學，2013，34（5）：100-103.

［19］胡德華，張潔，方平.生物信息學數(shù)據(jù)庫調(diào)查分析及其利用研究［J］.生物信息學，2005，3（1）：22-25.

［20］ Latorra D，Arar K，Hurley J M.Design considerations and effects of LNA in PCR primers［J］.Molecular and Cellular Probes，2003，17（5）：253-259.

A Quantitative PCR Method for Detecting Phytophthora parasitica var.nicotianae in Tobacco Planting Soil Based on LNA Sensitization

LIU Fang1,SONG Jizhen1,FAN Yikuan2,MOU Wenjun1,XI Jiaqin*1,and HU Liwei*1
1.Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC,Zhengzhou 450001,China
2.Henan Province Company of CNTC,Zhengzhou 450008,China

In order to efficiently detect the colonization of Phytophthora parasitica var.nicotianae in tobacco planting soil,a quantitative PCR method was researched based on locked nucleic acid（LNA）primer.The results showed that:1）Comparing with conventional DNA primers,the LNA primer raised PCR reaction annealing temperature,reduced the formation of primer dimers and non-specific products,and improved the sensitivity and specificity of detection.2）LNA quantitative PCR analysis revealed that the concentration of Phytophthora parasitica var.nicotianae in 14 soil samples of tobacco/garlic rotation fields ranged from 2.76×103to 5.20×104per gram.This method is sensitive and efficient,the detection can be completed within 4-5 hours.

Tobacco planting soil;Phytophthora parasitica var.nicotianae;Locked nucleic acid（LNA）;Fluorescence quantitative PCR;Molecular detection

S43

A

1002-0861（2015）12-0014-06

10.16135/j.issn1002-0861.20151203

2015-01-19

2015-05-06

中國煙草總公司河南省公司科技項目“煙草黑脛病防控關鍵技術研發(fā)與應用”（122013DS0320）。

劉芳（1992—），女，在讀碩士研究生，研究方向：煙草農(nóng)業(yè)。E-mail：qqfliu@163.com；*

奚家勤，E-mail：xijq@ztri.com.cn；胡利偉，E-mail：lwhu2003@hotmail.com

劉芳，宋紀真，范藝寬，等.基于鎖核苷酸（LNA）增敏的植煙土壤中煙草黑脛病菌定量PCR檢測方法［J］.煙草科技，2015，48（12）：14-19.LIU Fang,SONG Jizhen,FAN Yikuan,et al.A quantitative PCR method for detecting Phytophthora parasitica var.nicotianae in tobacco planting soil based on LNA sensitization［J］.Tobacco Science&Technology,2015,48（12）：14-19.

責任編輯 董志堅