汪靈芝，彭建新，陶亮，黃煥森

1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院麻醉科，廣東 廣州 510260；

2.廣東省中醫(yī)院肝膽外科，廣東 廣州 510120；

3 中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)，廣東 廣州 510080

依托泊苷是一種細(xì)胞周期特異性抗腫瘤藥物，主要作用于細(xì)胞的S期和G2期，通過抑制細(xì)胞內(nèi)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的連接修復(fù)功能，使得DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ與已經(jīng)斷裂的DNA單鏈和雙鏈形成具有破壞性的酶-DNA斷裂復(fù)合物，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的凋亡或死亡。依托泊苷是廣泛應(yīng)用于白血病、淋巴瘤、睪丸癌及膀胱癌治療的一線化療藥物［1-2］。腫瘤患者常常需要進(jìn)行長(zhǎng)期的化療，但依托泊苷所帶來的嚴(yán)重的骨髓抑制和消化道等不良反應(yīng)大大限制了其臨床應(yīng)用［3］。因此，尋找能夠增強(qiáng)依托泊苷抗腫瘤作用的方法或者策略將具有重要的意義。

細(xì)胞縫隙連接(gap junction，GJ)是直接溝通相鄰細(xì)胞胞質(zhì)的一種蛋白質(zhì)連接通道。6個(gè)穿越細(xì)胞膜的縫隙連接蛋白(connexin，Cx)環(huán)繞在一起形成半通道，位于相鄰細(xì)胞膜上的2個(gè)半通道對(duì)接形成完整的GJ。相鄰細(xì)胞通過GJ所介導(dǎo)的縫隙連接通訊進(jìn)行能量物質(zhì)以及信號(hào)分子的傳遞，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化。有研究［4-5］表明，GJ可以增強(qiáng)X線照射以及順鉑等化療藥物的細(xì)胞毒性。但人體組織中表達(dá)最豐富的Cx43所組成的GJ是否影響依托泊苷的抗腫瘤作用仍鮮見報(bào)道。因此，本研究擬通過藥物和分子生物學(xué)手段改變睪丸癌細(xì)胞MLTC-1細(xì)胞上Cx43所組成的GJ功能，觀察其對(duì)依托泊苷細(xì)胞毒性的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

本研究所使用的MLTC細(xì)胞和Cx43-siRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株由中山大學(xué)陶亮教授實(shí)驗(yàn)室提供。本研究中的主要試劑：胎牛血清，青-鏈霉素，胰酶和MEM干粉等細(xì)胞培養(yǎng)試劑購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；全反式維甲酸(retinoid acid，RA)和18-α-甘草次酸(glycyrrhetinic acid，18-α-GA)等試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 睪丸癌MLTC細(xì)胞的培養(yǎng)

培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青霉素、鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液，置于37 ℃、飽和濕度、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于培養(yǎng)瓶中，0.25%的胰蛋白酶消化法進(jìn)行傳代，1周傳代2～3次，傳代比例約為1∶3。實(shí)驗(yàn)前將細(xì)胞培養(yǎng)24～48 h，使其表達(dá)形成有效的GJ。

1.2.2 細(xì)胞接種熒光示蹤法［6］檢測(cè)MLTC-1細(xì)胞的GJ熒光傳遞功能

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以1.0×105/mL接種于6孔板。隨機(jī)分為對(duì)照組、50 μmol/L 18-GA處理組、20 μmol/L RA處理組進(jìn)行處理。將表達(dá)有Cx43的細(xì)胞與熒光指示劑calcein-AM和DiI-CM共同溫育，使calcein-AM和DiI-CM進(jìn)入細(xì)胞，該細(xì)胞稱為“供體細(xì)胞”。將“供體細(xì)胞”接種到接受過18-GA(1 h)和RA(24 h)并已生長(zhǎng)融合的睪丸癌細(xì)胞(“接受細(xì)胞”)上，培養(yǎng)4 h。待形成穩(wěn)定的GJ后，用顯微熒光系統(tǒng)觀察，記錄一個(gè)“供體細(xì)胞”周圍含有calcein的“接受細(xì)胞”作為GJ功能指標(biāo)。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞集落形成分析法［7］測(cè)定依托泊苷的細(xì)胞毒性

采用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞集落形成分析法，以細(xì)胞集落形成率的降低作為依托泊苷的細(xì)胞毒性指標(biāo)，測(cè)定依托泊苷對(duì)天然表達(dá)Cx43的睪丸癌MLTC-1細(xì)胞集落形成的影響。在表達(dá)Cx43且有GJ形成的細(xì)胞加入6 μmol/L依托泊苷，作用1 h后，PBS清洗細(xì)胞，每組取500個(gè)細(xì)胞重新接種于培養(yǎng)板7 d后測(cè)定細(xì)胞集落形成率，通過計(jì)數(shù)細(xì)胞集落形成率比較依托泊苷毒性大小。細(xì)胞集落形成率=依托泊苷處理組的細(xì)胞集落數(shù)/未用依托泊苷的細(xì)胞集落數(shù)。在上述GJ形成細(xì)胞，分別加入18-GA和RA提前預(yù)處理細(xì)胞1 h和24 h，再聯(lián)合依托泊苷處理細(xì)胞1 h，同樣的方法計(jì)數(shù)細(xì)胞集落形成率以此觀察藥物改變Cx43組成的GJ功能對(duì)依托泊苷細(xì)胞毒性的影響。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。2組間計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，多組間計(jì)量資料比較采用ANOVA分析，組間比較采用LSD法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，統(tǒng)計(jì)圖表采用Sigma Plot 10.0 繪制。

2 結(jié) 果

2.1 18-GA、維甲酸和Cx43干擾RNA對(duì)睪丸癌細(xì)胞熒光傳遞功能的影響

細(xì)胞接種熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，50 μmol/L 18-GA作用MLTC-1細(xì)胞后，供體細(xì)胞周圍的接受細(xì)胞數(shù)明顯<對(duì)照組，熒光傳遞功能約為對(duì)照組的(24±3)%(t=23.04，P<0.01)；而與之相對(duì)應(yīng)的是，20 μmol/L維甲酸處理細(xì)胞24 h后，供體細(xì)胞周圍的接受細(xì)胞數(shù)明顯多于對(duì)照組，熒光傳遞功能約為對(duì)照組的(143±8)%(t=-4.74，P<0.01)。Cx43 siRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞與正常對(duì)照組細(xì)胞相比，供體細(xì)胞周圍的接受細(xì)胞數(shù)明顯減少，熒光傳遞功能為對(duì)照組的(15±2)%(t=42.15，P<0.01)。結(jié)果證明，18-GA和Cx43 siRNA可以降低由Cx43所組成的GJ熒光傳遞功能，而維甲酸能夠增強(qiáng)Cx43組成的GJ功能(圖1)。

圖1 不同藥物和Cx43干擾RNA對(duì)睪丸癌細(xì)胞縫隙連接熒光傳遞功能的影響 Fig. 1 The effect of chemicals and siRNA on the dye spread of MLTC-1 cells assayed by parachute assay

2.2 18-GA和維甲酸對(duì)依托泊苷細(xì)胞毒性的影響

細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在表達(dá)Cx且形成GJ的MLTC-1細(xì)胞中，18-GA與依托泊苷聯(lián)合應(yīng)用組的細(xì)胞集落形成率高于單用6 μmol/L依托泊苷組(t=-4.88，P<0.01)。這表明，18-GA抑制GJ后，依托泊苷的細(xì)胞毒性明顯降低。同時(shí)我們的結(jié)果還顯示，維甲酸與依托泊苷聯(lián)合應(yīng)用組的細(xì)胞集落形成率低于單用依托泊苷組(t=7.14，P<0.01)，表明維甲酸增強(qiáng)GJ功能可增加依托泊苷的細(xì)胞毒性(圖2) 。

2.3 Cx43干擾RNA對(duì)依托泊苷細(xì)胞毒性的影響

細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Cx43 siRNA的細(xì)胞中，加入6 μmol/L依托泊苷后，細(xì)胞集落形成率明顯高于正常對(duì)照組細(xì)胞(t=-3.22，P<0.05)。結(jié)果證明Cx43 siRNA降低Cx43組成的GJ功能后依托泊苷的細(xì)胞毒性明顯降低(圖3)。

圖2 18-GA和RA對(duì)依托泊苷抑制睪丸癌細(xì)胞增殖的影響Fig. 2 The effect of 18-GA and RA on etoposide cytotoxicity in MLTC-1 cells expressing Cx43

圖3 轉(zhuǎn)染或者未轉(zhuǎn)染Cx43-siRNA對(duì)依托泊苷抑制睪丸癌細(xì)胞增殖的影響Fig. 3 Etoposide cytotoxicity in MLTC-1 cells transfected with or without Cx43-siRNA

3 討 論

本研究通過應(yīng)用藥物和分子生物學(xué)手段改變睪丸癌細(xì)胞GJ功能系統(tǒng)研究了依托泊苷抗腫瘤作用與Cx43所組成的GJ的關(guān)系，首次證實(shí)了Cx43組成的GJ介導(dǎo)了依托泊苷對(duì)睪丸MLTC-1癌細(xì)胞增殖的抑制作用。細(xì)胞集落結(jié)果顯示，18-GA抑制Cx43組成的GJ功能，降低了依托泊苷細(xì)胞毒性；而維甲酸增強(qiáng)Cx43組成的GJ功能，增加依托泊苷細(xì)胞毒性。由此可見，調(diào)控GJ的功能，能夠改變依托泊苷的抗腫瘤作用。本研究結(jié)果提示，利用分子生物學(xué)和化學(xué)藥物提高細(xì)胞間間隙連接通訊功能能夠顯著提高睪丸癌細(xì)胞對(duì)依托泊苷的敏感性，并有望降低其耐藥性的產(chǎn)生。因此，睪丸癌細(xì)胞上針對(duì)Cx43為靶點(diǎn)的藥物開發(fā)和治療策略將對(duì)改善化療療效和安全性具有重要的意義。

人體組織中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有21種Cx，其中Cx43在人體多種組織細(xì)胞中都有表達(dá)，是分布最廣泛的一種GJ蛋白。在培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞，Cx43組成的GJ能夠顯著增強(qiáng)多種化療藥物的細(xì)胞毒性。研究者發(fā)現(xiàn)，由Cx43所組成的GJ能夠顯著增強(qiáng)順鉑對(duì)小鼠永生型成纖維干細(xì)胞(MEFs)的毒性，而細(xì)胞轉(zhuǎn)染Cx43 RNAi后順鉑毒性明顯下降［7］。轉(zhuǎn)染Cx43可以增強(qiáng)前列腺癌細(xì)胞的縫隙連接通訊，提高其對(duì)TNF-α的敏感性［8］。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)依托泊苷對(duì)睪丸癌細(xì)胞增殖的抑制作用在Cx43組成的GJ存在的情況下明顯增高，與前述的研究結(jié)果相吻合［7］。

GJ增強(qiáng)化療藥物細(xì)胞毒性的機(jī)制與“旁觀者效應(yīng)”有關(guān)。旁觀者效應(yīng)最早是在自殺基因治療腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)，研究人員發(fā)現(xiàn)，有部分腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染自殺基因后，可引起強(qiáng)大的抑制腫瘤生長(zhǎng)的效應(yīng)，包括被轉(zhuǎn)染細(xì)胞以及周圍未被轉(zhuǎn)染細(xì)胞均被殺滅。轉(zhuǎn)染Cx基因的腫瘤靶細(xì)胞中的HSV-TK/GCV的治療要比未轉(zhuǎn)染Cx基因的作用要強(qiáng)，這說明GJ提高了HSV-TK/GCV基因治療的旁觀者效應(yīng)，實(shí)驗(yàn)者認(rèn)為鳥嘌呤的三磷酸代謝物通過由于Cx43構(gòu)成的GJ從有自殺基因的細(xì)胞擴(kuò)散到周圍無自殺基因的細(xì)胞，引起細(xì)胞死亡［9］。同樣地，類似的旁觀者效應(yīng)也出現(xiàn)在腫瘤的放療和化療領(lǐng)域［10］。Jensen等［7］研究人員發(fā)現(xiàn)順鉑在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的同時(shí)也很可能產(chǎn)生了一種“死亡信號(hào)”，死亡信號(hào)通過相鄰細(xì)胞間的GJ傳遞，導(dǎo)致單個(gè)細(xì)胞內(nèi)死亡信號(hào)的放大從而增強(qiáng)了順鉑的細(xì)胞毒性。

與順鉑相似，依托泊苷也是通過干擾DNA的復(fù)制抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖。依托泊苷抑制細(xì)胞內(nèi)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的連接修復(fù)功能，使得DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ與已經(jīng)斷裂的DNA單鏈和雙鏈形成具有破壞性的酶-DNA斷裂復(fù)合物，復(fù)合物激活細(xì)胞內(nèi)包括ATM、ATR分子參與的修復(fù)系統(tǒng)及細(xì)胞周期調(diào)控系統(tǒng)，一旦損傷未修復(fù)或者錯(cuò)誤修復(fù)，將會(huì)介導(dǎo)染色體的重排和周期停滯，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或者死亡。因此，我們推測(cè)，順鉑和依托泊苷這2種針對(duì)DNA復(fù)制的化療藥物在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中所激活的修復(fù)或者損傷通路有著某些相似之處。研究中依托泊苷作用細(xì)胞1 h，極有可能會(huì)引起一些類似的細(xì)胞周期蛋白，凋亡相關(guān)蛋白及其DNA損傷相關(guān)的蛋白或者死亡信號(hào)發(fā)生改變，有研究認(rèn)為可能是能通過GJ擴(kuò)散的小分子細(xì)胞內(nèi)信使物質(zhì)如IP3、Ca2＋等［11-12］。我們前期針對(duì)MLTC-1細(xì)胞的相關(guān)研究也證實(shí)，DNA交聯(lián)物在縫隙連接所介導(dǎo)的順鉑毒性中具有重要的作用［13］，但其是否介導(dǎo)依托泊苷所誘導(dǎo)的死亡信號(hào)的傳遞還有待證實(shí)。

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