顏群芳，陳依楚，黃蘇萍*，衡先培，陳 燕，李 亮，王思梅，康文倩，陳超云，葉夢(mèng)捷，鄭滬琳

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福州350122;2.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院，福州350004;3.杭州市余杭區(qū)第一人民醫(yī)院，浙江杭州311100)

糖尿病腦病(diabetic encephalopathy，DE)是糖尿病慢性并發(fā)癥之一，主要表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙、癡呆、精神性疾患等慢性腦病癥狀。胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)是一類結(jié)構(gòu)上與胰島素部分同源的多肽，能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)并具有胰島素樣代謝效應(yīng)。有研究顯示，IGF-1可能參與了糖尿病腦病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程［1-4］。既往研究表明，丹瓜方能改善糖尿病模型大鼠胸主動(dòng)脈超微形態(tài)學(xué)變化、保護(hù)血管［5］;拮抗高糖的細(xì)胞毒性［6］;消除高糖對(duì)細(xì)胞正常生長(zhǎng)周期的不良影響［7］;并能顯著降低血糖、血脂，下調(diào)氧化應(yīng)激［8］。本研究將探討丹瓜方對(duì)糖尿病模型小鼠腦組織IGF-1表達(dá)的影響，初步揭示丹瓜方防治糖尿病腦病的部分機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

載脂蛋白E(Apo E)基因敲除小鼠(Apo E^-/-)，雄性，8周齡，SPF 級(jí)，60 只，體質(zhì)量(21 ±2)g，購(gòu)買于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部，系美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)。并同時(shí)購(gòu)入與上述小鼠同品系的同齡、同性別C57小鼠15只，體質(zhì)量(22±2)g。許可證編號(hào):SCXK(京)2011-0012。分籠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)。環(huán)境溫度:(22±1)℃;濕度:50% ±5%;12 h/12 h明暗周期。動(dòng)物食用標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，自由飲水和攝食。飲用水為清潔自來(lái)水，飼料由福建省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供并經(jīng)高溫消毒與輻射照射處理。丹瓜方(由丹參、瓜蔞、川芎、郁金、薤白、赤芍藥、白僵蠶等組成)由福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院藥劑科生產(chǎn)，原生藥2 g/mL藥液，批號(hào):120928。鹽酸吡格列酮由日本武田藥品工業(yè)株式會(huì)社生產(chǎn)、天津武田藥品有限公司分裝，產(chǎn)品批號(hào):153B。鏈脲佐菌素(STZ)，Simga公司，批號(hào):S8050。IGF-1酶聯(lián)免疫法試劑盒，上海西唐生物科技有限公司。LMQ.C80E全自動(dòng)高壓滅菌鍋，山東新華醫(yī)療器械股份有限公司。LX-200離心機(jī)，海門市其林貝爾儀器。DK600S三用水浴恒溫箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。ELX800全自動(dòng)酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTek公司。

2 造模方法

連續(xù)稱取小鼠空腹?fàn)顟B(tài)下的體質(zhì)量3 d，以第3天體質(zhì)量為準(zhǔn)，40 mg/kg鏈脲佐菌素(STZ)，于清晨空腹腹部皮下注射，連續(xù)3 d。最后1次注射后48、72 h分別測(cè)定空腹血糖(FBG)，選出2次血糖值都≥11.1 mmol/L者，余下鼠再同法注射STZ2 d，并測(cè)定血糖，選出全部2次FBG≥11.1 mmol/L的Apo E^-/-小鼠視為糖尿病成模鼠。為了減少分組后灌胃失敗所導(dǎo)致的動(dòng)物減員，將成模鼠適應(yīng)性灌胃觀察1周。期間有2只鼠因灌胃失敗死亡。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 分組及干預(yù)方法 在測(cè)定基礎(chǔ)血糖次日測(cè)定糖尿病成模鼠空腹?fàn)顟B(tài)下的體質(zhì)量，按體質(zhì)量分層，再按血糖水平由高至低，按隨機(jī)數(shù)字表法，隨機(jī)分為模型組［無(wú)菌水，15 mL/(kg·d)］、丹瓜方組［丹瓜方15 mL/(kg·d)］、吡格列酮組［4.3 mg/(kg·d)］、聯(lián)合用藥組［吡格列酮4.3 mg/(kg·d)+丹瓜方15 mL/(kg·d)］，每組8只。以上用藥量都由60 kg成人每日常規(guī)用藥量按照小鼠用藥量公式［(動(dòng)物體質(zhì)量/人的體質(zhì)量)×人的劑量×8.65］計(jì)算而來(lái)。15只C 57小鼠連續(xù)測(cè)定FBG 2 d，計(jì)算2次血糖的平均值。選出血糖值正常的8只鼠作為對(duì)照。均以常規(guī)飼料喂養(yǎng)。根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)干預(yù)12周后，禁食但不禁水12 h取標(biāo)本。

3.2 檢測(cè)指標(biāo)及方法 觀察小鼠活動(dòng)情況、精神狀態(tài)及皮毛光澤度。每2周稱取小鼠空腹體質(zhì)量。12周后禁食12 h，摘除右眼球取血，小鼠取血后迅速拉尾斷頸，置于冰上操作，迅速開(kāi)顱取腦組織，盛于1.5 mL離心管并放入液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)法檢測(cè)IGF-1的表達(dá)，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS 20.0軟件，計(jì)量資料屬正態(tài)分布者用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(珋±s)表示，多樣本均數(shù)兩兩比較采用單因素方差分析，方差齊采用LSD法。方差不齊者經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，方差齊后再用LSD比較。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

見(jiàn)表1。

表15 組小鼠干預(yù)12周后IGF-1比較(珋±s，n=6)

表15 組小鼠干預(yù)12周后IGF-1比較(珋±s，n=6)

注:與C57比較:ΔP ＜0.05，ΔΔP ＜0.01;與模型組比較:□□P ＜0.01;與丹瓜方組比較:##P ＜0.01

組 別 IGF-1(ng/mL)C57 組 19.89 ±0.95模型組 7.25 ±0.42ΔΔ丹瓜方組 14.31 ±0.99ΔΔ□□聯(lián)合用藥組 11.58 ±0.92ΔΔ□□##吡格列酮組 8.38 ±0.90ΔΔ

5 討論

糖尿病腦病(DE)是糖尿病慢性并發(fā)癥之一，以獲得性認(rèn)知和行為缺陷為特點(diǎn)［9-10］。糖尿病的高血糖狀態(tài)或內(nèi)在的代謝紊亂介導(dǎo)氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡［11-12］。已有前瞻性臨床研究表明［13］，IGF軸可能對(duì)糖尿病風(fēng)險(xiǎn)產(chǎn)生影響。其中IGF-1是重要因素。IGF-1能刺激肌肉組織中蛋白質(zhì)合成;促進(jìn)游離脂肪酸的利用;改善糖尿病病人胰島素抵抗;生理劑量間接抑制生長(zhǎng)激素的分泌，超過(guò)生理劑量抑制胰島素分泌;并聯(lián)合胰島素、生長(zhǎng)激素對(duì)糖、脂肪、蛋白質(zhì)代謝中間環(huán)節(jié)產(chǎn)生直接影響。但在糖尿病患者中，IGF-1活性明顯異常［14-18］。

糖尿病屬中醫(yī)氣血津液病證，為慢性疾患。病久入絡(luò)，血脈瘀滯，且陰虛內(nèi)熱，耗傷津液，痰濁內(nèi)生，痰瘀互結(jié)。糖尿病的防治向來(lái)著手于血糖、血脂的調(diào)控。ACCORD等詢證醫(yī)學(xué)證據(jù)表明，嚴(yán)格的強(qiáng)化降糖、降脂無(wú)益于降低糖尿病心血管風(fēng)險(xiǎn)［19］。丹瓜方由丹參、瓜蔞、赤芍、郁金、川芎、白僵蠶、薤白等組成，全方清潤(rùn)通絡(luò)、痰瘀同治。本研究揭示，IGF-1在糖尿病小鼠腦組織中表達(dá)降低，丹瓜方能適度上調(diào)腦組織中IGF-1的表達(dá)水平，其作用亦較吡格列酮顯著。

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