顏茂華 許斌 趙立來 朱求亮 羅建民 楊正明

1.浙江省安吉縣人民醫(yī)院骨科，浙江安吉313300；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院，浙江杭州310009

微小RNA-144上調(diào)Rb抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡

顏茂華1許斌1趙立來1朱求亮1羅建民1楊正明2

1.浙江省安吉縣人民醫(yī)院骨科，浙江安吉313300；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院，浙江杭州310009

目的探討微小RNA-144（miR-144）對骨肉瘤細(xì)胞增殖、凋亡及相關(guān)蛋白影響。方法運(yùn)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，在骨肉瘤細(xì)胞株MG-63中轉(zhuǎn)染不同濃度miR-144類似物（miR-144組），隨機(jī)miR-144片段作為陰性對照組。實(shí)時(shí)定量PCR檢測miR-144表達(dá)水平。DAPI染色觀察miR-144對細(xì)胞形態(tài)的影響，用MTT檢測細(xì)胞增殖，Annexin/PI雙染確定細(xì)胞凋亡比例。免疫印跡檢測PTEN以及Rb等抑癌基因編碼蛋白和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況。結(jié)果實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，miR-144組miR-144的表達(dá)（1128.54±738.52）明顯高于空白對照組（1.00±0.00）和陰性對照組（2.06±0.73）（P<0.01）。與陰性對照組和空白對照組比較，miR-144組細(xì)胞數(shù)量明顯減少，增殖受抑制，流式細(xì)胞檢測顯示，細(xì)胞凋亡率明顯增加。免疫印跡檢測顯示，Rb和PTEN表達(dá)水平有所增加，而凋亡相關(guān)的Caspase-3活化，線粒體膜上Cyto C釋放。而陰性對照組與空白對照組以上數(shù)值比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論合成的miR-144片段（miR-144 mimic）能順利進(jìn)入細(xì)胞并上調(diào)miR-144的表達(dá)，對骨肉瘤細(xì)胞都有一定程度的抑制作用，并有濃度依賴性，對MG-63的抑制效果最強(qiáng)，并通過活化Caspase-3促進(jìn)凋亡，上調(diào)PTEN和Rb的表達(dá)實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞的抑制作用。未來可以基于miR-144進(jìn)行骨肉瘤治療的短核苷酸類藥物開發(fā)。

骨肉瘤；微小RNA-144；增殖；凋亡

骨肉瘤是好發(fā)于青少年的惡性腫瘤，手術(shù)方法多為廣泛切除或截肢，致殘致畸，患者后續(xù)生活質(zhì)量較差，故而早期預(yù)警、診斷以及治療變得異常重要。近年

來研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA（miRNA）在多重疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演重要作用，miRNA作為一種非編碼單鏈小分子RNA，由21～25個(gè)核苷酸組成，通過與目標(biāo)mRNA3端非編碼區(qū)域序列非完全互補(bǔ)結(jié)合，導(dǎo)致mRNA翻譯的抑制，進(jìn)而降解，由60～110nt的可形成發(fā)夾狀的內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄前體加工而成。miRNA可與靶mRNA分子的3’非編碼區(qū)（3’．UTR）不完全互補(bǔ)序列結(jié)合，通過抑制mRNA的翻譯或直接使mRNA降解，在轉(zhuǎn)錄后水平達(dá)到基因沉默效果。研究發(fā)現(xiàn)，多種miRNA在包括骨肉瘤在內(nèi)的多種腫瘤中扮演癌基因或者抑癌基因的角色，特定的miRNA參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的各個(gè)階段[1，2]。

近年來，國內(nèi)外的一些研究顯示骨肉瘤患者正常組織和腫瘤組織中的miRNA表達(dá)譜不同，魏任雄等[3]研究顯示，其中的miR-144表達(dá)在骨肉瘤表達(dá)中低于正常骨組織39倍。miR-144同時(shí)也在結(jié)腸癌中表達(dá)下調(diào)，并與結(jié)直腸癌的進(jìn)展息息相關(guān)，可以作為結(jié)腸癌的分子診斷標(biāo)志物[4，5]。在一些研究中顯示，miR-144下調(diào)后，可通過EZH2和Wnt信號(hào)通路引起膀胱癌細(xì)胞增殖[6]。其他針對miR-144的功能研究發(fā)現(xiàn)，GATA4可以激活miR-144前體并誘導(dǎo)表達(dá)，而且有研究顯示，當(dāng)miR-144表達(dá)后可引起心肌細(xì)胞凋亡，抑制增殖，并被認(rèn)為是治療缺血性心臟病的潛在靶點(diǎn)[7]。而目前關(guān)于miR-144對骨肉瘤細(xì)胞生物學(xué)功能的影響尚未見有報(bào)道，因此，本研究著重探索miR-144對骨肉瘤細(xì)胞株MG-63的增殖、細(xì)胞周期以及凋亡的影響。探討miR-144在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中的作用和功能。

1 材料與方法

1.1 材料來源

人骨肉瘤細(xì)胞株MG-63、U-2 OS、Saos-2細(xì)胞購自上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，購買后大擴(kuò)并保存一批MTT、DMSO，凋亡檢測試劑盒購自南京凱基公司，DAPI購自Sigma公司，miRNA144類似物購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，序列為FAM-5’-UACAGUAUAGAUGAUGAUGUACU-3’。陰性對照（Control，縮寫為“Con”）miRNA為隨機(jī)合成，序列為FAM-5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’，DEPC水溶解后制備成10 μM儲(chǔ)液用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染?？瞻讓φ战M為不含RNA的轉(zhuǎn)染試劑組。與大鼠基因組各基因均無顯著同源性。臨用時(shí)根據(jù)要求使用完全培養(yǎng)液稀釋為目標(biāo)濃度。RPMI-1640培養(yǎng)液為Gibco公司產(chǎn)品，小牛血清購自杭州四季青生物科技有限公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectmine 2000脂質(zhì)體購自Life Technology公司。其余試劑均為分析純或者分子試劑級(jí)別。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將凍存的骨肉瘤細(xì)胞株從液氮罐取出，細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇及傳代。取對數(shù)生長期細(xì)胞，以0．25%的胰蛋白酶消化后用PBS（pH7．2）洗滌3次，用含體積分?jǐn)?shù)為10%的小牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液將細(xì)胞終濃度調(diào)至8×104細(xì)胞/mL，接種到96孔或6孔板中。細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)，空白對照組：加等量的完全RPMI-1640培養(yǎng)液和轉(zhuǎn)染試劑；miRNA144組：用完全RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋后加入到細(xì)胞中，使得終濃度20nM、40nM和80nM；陰性對照組：轉(zhuǎn)染試劑加隨機(jī)RNA序列組。轉(zhuǎn)染后，置5%CO237℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后，換新鮮培養(yǎng)液，后續(xù)收集細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞凋亡形態(tài)觀察

細(xì)胞爬片后，用不同濃度miR-144處理48 h后，冷甲醇固定細(xì)胞，使用DAPI染色5 min，磷酸緩沖液PBS洗1次，將有細(xì)胞的一面倒扣于事先滴加有熒光防淬滅劑載玻片上，用倒置熒光顯微鏡觀察。

1.4 凋亡細(xì)胞比例檢測

收集48 h經(jīng)過不同濃度miR-144處理的骨肉瘤細(xì)胞，根據(jù)膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明處理，細(xì)胞以PBS洗2次，再用1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×108/mL，分別取100 μL細(xì)胞液至5 mL離心管，加入異硫氰酸熒光素標(biāo)記的5 μL膜聯(lián)蛋白V和5 μL碘化吡啶，輕輕攪拌混勻，置于暗處室溫孵育15 min后，過300目孔徑尼龍膜后轉(zhuǎn)移至流式細(xì)胞樣本管中，然后用流式細(xì)胞儀C6（BD公司）進(jìn)行分析檢測。設(shè)置空白對照和單染組細(xì)胞用于流失細(xì)胞設(shè)“門”，每次分析20 000個(gè)細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.5 免疫印跡

使用冷的PBS淋洗2遍，在RIPA裂解液中冰上裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞蛋白后在10%的SDS-PAGE膠上電泳。蛋白分離后經(jīng)恒流1．5 h電轉(zhuǎn)移到PVDF膜后，使用含5%脫脂牛奶的封閉液封閉1 h，與凋亡相關(guān)以及周期相關(guān)的特異性抗體室溫孵育1 h或者4℃過夜后，次日加入含二抗室溫作用1 h后，TBST洗膜3次，取出膜后加入ECL發(fā)光液，暗室中壓片顯影。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

正態(tài)分布的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（x±s）表示，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，利用SPSS12．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，凋亡miRNA不同處理組用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 miR-144對骨肉瘤細(xì)胞增殖的影響

miR-144轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞48 h后，可引起3種骨肉瘤細(xì)胞株生長的抑制，在濃度為40 nM和80 nM時(shí)，對MG-63的抑制最強(qiáng)，達(dá)到（50±6）%抑制率，且抑制效果有濃度依賴性，隨著miR-144類似物（mimic）濃度增加抑制率增加，Con為陰性的類似物，也有一定的抑制率，說明脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染對細(xì)胞本身有一定的毒性，見封三圖4A。3種骨肉瘤細(xì)胞中，MG-63對miR-144最為敏感。此外我們對miR-144轉(zhuǎn)染后表達(dá)情況熒光顯微鏡檢測FAM紅色熒光強(qiáng)度，見封三圖4B，隨著miR-144終濃度的增加，熒光的分布和強(qiáng)度增加，對照組中（Con）熒光強(qiáng)度類似20 nM miR-144的作用強(qiáng)度。

2.2 miR-144對骨肉瘤MG-63細(xì)胞凋亡的影響

設(shè)置對照組，miR-144 0～80 nM組作用MG-63骨肉瘤細(xì)胞，48 h后，用冷乙醇固定細(xì)胞，使用DAPI甲醇溶液對細(xì)胞染色（圖1），隨著miR-144濃度的增加，細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，說明對MG-63細(xì)胞增殖有較為顯著的抑制作用。

圖1 miR-144不同濃度作用MG-63細(xì)胞48 h后DAPI染色結(jié)果，Con為陰性對照，所有照片在200倍熒光顯微鏡下獲得

miR-144處理48 h后，胰酶消化收集骨肉瘤細(xì)胞，利用AnnexinV/PI雙染檢測凋亡，如表1所示，miR-144處理的3個(gè)不同濃度組中，正常細(xì)胞比例均有一定程度的下降，與陰性對照組和空白對照組比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；早期凋亡細(xì)胞比例在miR-144不同濃度組中均有顯著上升（P＜0．05），并以40 nM組中比例最高，與陰性對照組和空白對照組比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；miR-144處理后，晚期凋亡比例亦上升，與陰性對照組和空白對照組比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；此外，miR-144處理后，還引起一定比例壞死細(xì)胞的產(chǎn)生，其中以80 nM處理組比例最高，與陰性對照組和空白對照組比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。以上結(jié)果證明miR-144進(jìn)入骨肉瘤細(xì)胞48 h后可引起細(xì)胞凋亡和壞死，且效應(yīng)呈濃度依賴性。單因素方差分析表明，miR-144不同濃度組對骨肉瘤細(xì)胞凋亡不同分期比例有顯著影響，見表1。

2.3 miR-144對凋亡相關(guān)信號(hào)通路的影響

為了解miR-144誘導(dǎo)MG-63骨肉瘤凋亡的具體機(jī)制，收集miR-144處理后細(xì)胞并獲取蛋白，用免疫印跡檢測凋亡標(biāo)志性分子信號(hào)Caspase-3和內(nèi)源性凋亡標(biāo)志物——細(xì)胞色素C（Cyto C）。與2．1結(jié)果趨勢相類似的是，隨著miR-144作用濃度的增加，Cyto C的表達(dá)逐漸增加，說明原先定位在線粒體中的蛋白因線粒體膜通透性改變而釋放出來。而Caspase-3活化形式表達(dá)逐漸增加，而其前體水平表達(dá)下調(diào)（圖2A），提示發(fā)生典型凋亡。結(jié)果顯示miR-144作用下，可能引起細(xì)胞內(nèi)源性凋亡途徑激活。有研究顯示，miR-144作用后還可引起Rb及PTEN的表達(dá)變化，因此我們進(jìn)一步對PTEN表達(dá)及Rb的活化情況進(jìn)行檢測（圖2B），結(jié)果顯示PTEN在80 nM時(shí)有比較顯著的上調(diào)，而Rb的磷酸化在20 nM時(shí)就出現(xiàn)明顯的變化，提示Rb的上調(diào)在miR-144所誘導(dǎo)的增殖和凋亡中起著重要作用。以上結(jié)果說明，miR-144可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生，其作用具有濃度依賴性，主要形式可能為內(nèi)源性途徑。

圖2 miR-144免疫印跡檢測凋亡蛋白表達(dá)，miR-144作用MG-63細(xì)胞48 h后，免疫印跡檢測凋亡相關(guān)的以及抑癌基因PTEN和Rb及其磷酸化狀態(tài)（p-Rb）的情況

表1miR-144作用后對骨肉瘤細(xì)胞凋亡不同期比例的影響（x±s，%，n=3）

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，miRNA主要在基因轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮作用，與靶mRNA可以發(fā)生特異性非完全互補(bǔ)結(jié)合，引起基因表達(dá)下調(diào)。在不同物種間，miRNA序列具有高度的保守性、組織特異性和時(shí)序性。文獻(xiàn)報(bào)道顯示，miRNA的異常表達(dá)與特定腫瘤的發(fā)生具有一定的相關(guān)性，對miR-144的研究顯示，其下游細(xì)胞增殖有關(guān)靶基因主要包括LGR4、MAP3K4等，除此之外miR-144以Caspase-3為直接靶目標(biāo)而發(fā)揮抗凋亡的作用。而Caspase-3的活化也是凋亡的經(jīng)典途徑之一。本研究中的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，提示miR-144可直接誘導(dǎo)Caspase-3活化，通過內(nèi)源性途徑啟動(dòng)凋亡發(fā)生。

miRNA可以在腫瘤發(fā)生、進(jìn)展及轉(zhuǎn)移過程中起到重要作用，miR-144在多種疾病中均發(fā)生了顯著變化，但是主要研究集中在血液系統(tǒng)，對于腫瘤方面的研究較少。Wang等[8]通過薈萃分析發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤組織中存在差異表達(dá)的miRs，其中包括miR-144在結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、甲狀腺癌、喉癌、惡性間皮瘤的組織中均存在異常表達(dá)，miR-144在喉癌[9]、宮頸癌[10]、甲狀腺濾泡癌[11]以及惡性間皮瘤[12]中下調(diào)。體外構(gòu)建miRNA-144表達(dá)載體以后并轉(zhuǎn)染細(xì)胞，可引起細(xì)胞生長阻滯，并出現(xiàn)死亡，主要原因是引起凋亡，我們的研究結(jié)果與在肝癌及非小細(xì)胞肺癌中[13]的研究結(jié)果相一致，普遍認(rèn)為miR-144可作為一個(gè)腫瘤增殖的抑制基因存在并影響骨肉瘤患者預(yù)后。有研究顯示miR-144主要通過調(diào)節(jié)PTEN及Rb1等抑癌基因的翻譯發(fā)揮抑癌作用，本研究結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)，同時(shí)可能Rb的活化程度要強(qiáng)于PTEN的表達(dá)。

miR-144不僅影響細(xì)胞增殖，而且誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，有研究報(bào)道，過表達(dá)miR-144的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細(xì)胞后促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14]，通過影響E2F3表達(dá)還可以抑制肝癌轉(zhuǎn)移的發(fā)生[15]。根據(jù)凋亡啟動(dòng)分子的差異，可將凋亡類型分為內(nèi)源性途徑和外源性途徑，前者又稱為線粒體途徑，主要表現(xiàn)為線粒體內(nèi)特異性蛋白如細(xì)胞色素C（Cyto C）因?yàn)槟ねㄍ感缘淖兓尫诺郊?xì)胞漿內(nèi)，再有如Bax表達(dá)以及線粒體膜電位變化等。而外源性途徑后者則主要以Fas/FasL為代表，體現(xiàn)為下游Caspase-8的活化。進(jìn)一步對Caspase-3的檢測不僅驗(yàn)證前面的DAPI染色的現(xiàn)象，而且在分子水平證明存在比較明確的凋亡現(xiàn)象。在Caspase家族中，Caspase-3是Caspase級(jí)聯(lián)“瀑布”下游最關(guān)鍵的凋亡蛋白酶。通過上調(diào)Caspase-3活化形式的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，miR-144不僅能激活反映DNA損傷程度的PARP，而且上調(diào)Caspase-3活化形式表達(dá)，最終引起細(xì)胞凋亡。本研究顯示miR-144誘導(dǎo)的凋亡主要可能為線粒體途徑，表現(xiàn)miR-144作用后細(xì)胞色素C的大量釋放進(jìn)入胞漿。針對Rb和PTEN的檢測也提示有一定程度的活化，但是程度不如細(xì)胞色素C明顯，提示細(xì)胞中的信號(hào)通路往往不是非此即彼的關(guān)系，可能還存在較多的Crosstalk。此外在最近的一項(xiàng)研究中表明miR-144通過影響ADAMTS5和ADAM10抑制頭頸部腫瘤轉(zhuǎn)移[3]。骨肉瘤患者在確診前有80～90%發(fā)生全身的微病灶轉(zhuǎn)移[16]，因此，在未來研究中我們還可以探討miR-144對骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響。

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（收稿日期：2014-10-23）

miR-144 supresses proliferation and induces apoptosis of osteosarcoma cells by upregulating Rb

YAN Maohua1XU Bin1ZHAO Lilai1ZHU Qiuliang1LUO Jianmin1YANG Zhengming2
1.Department of Orthopaedics，the People's Hospital of Anji County in Zhejiang Province，Anji313300，China；2.The Second Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medicine，Hangzhou310009，China

Objective To study the influences of microRNA-144 on osteosarcoma cells from proliferation，apoptosis and the expression of related protein.Methods Different concentration of miR-144 was transfected into osteosarcoma MG-63 cell lines by the method of lipofectmine.The cell lines were divided into 3 groups：normal group，miR-144 transfected group，and negative group which was transfected with random miR-144 fragment.The proliferation of cells was detected by the MTT assay.The expression of miR-144 was detected by Real-Time PCR.DAPI staining was carried to study the influence of miR-144 on the morphology of MG-63.And the percentage of apoptosis was observed by flow cytometry with the Annexin/PI staining.Expression of tumor suppressor such as PTEN and Rb and the protein related with apoptosis were evaluated by western blotting.Results RT-PCR indicated a higher expression of miR-144 in transfected group（1128.54±738.52）compared with the normal group（1.00±0.00）and negative group（2.06±0.73）（P＜0.01）.The proliferation of miR-144 transfected cells was significantly lower than that in normal group and negative group.Further，a higher apoptosis rate was detected by flow cytometry with a statistically significant upregulation of PTEN，Rb，Caspase-3 and Cyto C in transfected group，indicating an internal apoptosis pathway was involved in this process.Moreover，no significant changes were found in the normal group and negative group（P>0.05）.Conclusion miR-144 could transfectd into cells by the method of liposomal transfection and in turn upregulate the expression of miR-144 mimic，with an inhibition on the proliferation of MG-63.The underlying mechanisms may relate to the upregulation of tumor suppressor and activation of protein associated with caspase-3 signaling pathway，with providing a novel horizon in short nucleotide drugs on the management of osteosarcoma.

Osteosarcoma;Micro RNA-144;Proliferation;Apoptosis

R738.1

A

1673-9701（2015）06-0006-04

2014-12-15）

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（2010KYB052）