藺 露 董春霞 孫 燕 徐 璐 王 琴

(1.重慶市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,重慶 401120；2.中國(guó)獸醫(yī)藥監(jiān)察所,北京 100081)

采用不同ELISA試劑盒對(duì)豬瘟抗體水平調(diào)查結(jié)果的影響

藺 露1董春霞1孫 燕1徐 璐2王 琴2

(1.重慶市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,重慶 401120；2.中國(guó)獸醫(yī)藥監(jiān)察所,北京 100081)

本文采用豬瘟抗體間接ELISA和阻斷ELISA檢測(cè)試劑盒對(duì)320份血清樣本進(jìn)行豬瘟抗體檢測(cè)，符合率達(dá)80.63%，對(duì)檢測(cè)結(jié)果不一致的樣品，利用抗體中和試驗(yàn)（FVNT）做定性檢測(cè)，結(jié)果表明，間接ELISA試劑盒的敏感性和特異性均高于阻斷ELISA試劑盒，豬瘟間接ELISA試劑盒更適用于我國(guó)豬瘟抗體檢測(cè)。

豬瘟 抗體中和試驗(yàn) 酶聯(lián)免疫吸附法

豬瘟又稱經(jīng)典豬瘟（Classical Swine Fever，CSF），是由豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的一類高度接觸性傳染病，是世界糧農(nóng)組織和各國(guó)政府密切關(guān)注的主要傳染病之一[1]。國(guó)際獸醫(yī)局（OIE）將其列為必須上報(bào)的傳染病。20世紀(jì)50年代，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所的周泰沖研究員等開(kāi)發(fā)了豬瘟兔化弱毒疫苗株，該疫苗免疫原性好，安全性高，包括中國(guó)在內(nèi)的世界各國(guó)采用該疫苗成功的控制了豬瘟大范圍流行[2]。我國(guó)目前對(duì)豬瘟的防控采取疫苗全群免疫策略，因此，豬瘟抗體水平監(jiān)測(cè)就成為評(píng)價(jià)疫苗免疫效果的主要手段。目前我國(guó)用于豬瘟抗體水平檢測(cè)的主要有抗體中和試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）和正向間接血凝方法等。而國(guó)際上推薦的方法主要為抗體中和試驗(yàn)和ELISA方法[3]。本研究對(duì)采集的320份血清樣本用兩種不同的ELISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，然后對(duì)兩種試劑盒檢測(cè)結(jié)果有差異的血清用抗體中和試驗(yàn)進(jìn)行定性檢測(cè)，比較兩種試劑盒的檢測(cè)結(jié)果，為最終篩選適合我國(guó)田間大范圍推廣應(yīng)用的試劑盒提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 材料

（1）豬瘟病毒Thiveral株、豬瘟病毒熒光抗體、PK15傳代細(xì)胞系：由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定，保存并提供。

（2）豬瘟病毒間接E L ISA抗體檢測(cè)試劑盒（簡(jiǎn)稱“I-ELISA”）：由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供，批號(hào)為20121115。

（3）豬瘟抗體檢測(cè)試劑盒（簡(jiǎn)稱“B-ELISA”）：購(gòu)自美國(guó)IDEXX公司。

（4）血清：采自重慶市境內(nèi)5個(gè)區(qū)縣的規(guī)模場(chǎng)、種豬場(chǎng)及散養(yǎng)戶，共計(jì)320頭份。其中，免疫血清250頭份，非免疫仔豬血清70頭份。

1.2 方法

1.2.1 ELISA試劑盒檢測(cè) 將上述320頭份血清用I-ELISA和B-ELISA試劑盒進(jìn)行同步檢測(cè)，每份血清檢測(cè)2個(gè)重復(fù)。操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.2 抗體中和試驗(yàn)檢測(cè) 本研究中采用豬瘟病毒的單克隆熒光抗體進(jìn)行中和試驗(yàn)（Fluorescent antibody virus neutralization test，F(xiàn)VNT）。

2 結(jié)果

2.1 臨床血清樣本的I-ELISA和B-ELISA檢測(cè)結(jié)果及比較（見(jiàn)表1）

表1 兩種試劑盒對(duì)臨床血清的檢測(cè)結(jié)果

2.2 不同ELISA試劑盒對(duì)不同免疫背景血清的檢測(cè)結(jié)果（見(jiàn)表2）

表2 兩種試劑盒對(duì)不同背景血清的檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

2.3 FVNT對(duì)兩種試劑盒檢測(cè)結(jié)果

不一致的有62份（除1份血清的余量不足外）均進(jìn)行了FVNT檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表3和表4。

表3 I-ELISA與FVNT的檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

表4 I-ELISA與FVNT的檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

3 討論

3.1 豬瘟抗體檢測(cè)方法的選擇

在進(jìn)行豬瘟抗體檢測(cè)時(shí)，OIE推薦的方法為抗體中和試驗(yàn)和ELISA方法?？贵w中和試驗(yàn)根據(jù)抗體標(biāo)記物的不同又可分為過(guò)氧化物酶中和試驗(yàn)（Neutralising peroxidase-linked assay，NPLA）和熒光抗體病毒中和試驗(yàn)（Fluorescent antibody virus neutralization test，F(xiàn)VNT）。抗體中和試驗(yàn)的原理是將待檢血清與一定量的豬瘟病毒混合孵育后接種敏感細(xì)胞，根據(jù)病毒對(duì)細(xì)胞的感染情況對(duì)待檢血清抗體效價(jià)進(jìn)行測(cè)定。該方法主要檢測(cè)中和抗體，但操作復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)（大于3d），且實(shí)驗(yàn)條件要求高，檢測(cè)通量小，并不適合在基層使用。而臨床上常見(jiàn)的是采用ELISA血清學(xué)的檢測(cè)方法對(duì)豬瘟抗體進(jìn)行檢測(cè)。

3.2 不同種類ELISA試劑盒的選擇

檢測(cè)豬瘟抗體的ELISA試劑盒中，主要分為兩類：間接ELISA和阻斷ELISA。間接ELISA是將純化的豬瘟病毒結(jié)構(gòu)蛋白包被在反應(yīng)板中，加入待檢血清后，血清中的特異性抗體會(huì)與包被抗原發(fā)生結(jié)合，通過(guò)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗進(jìn)行顯色，反應(yīng)孔的顏色反應(yīng)強(qiáng)度與特異性抗體的量成正比。阻斷ELISA也是包被豬瘟病毒結(jié)構(gòu)蛋白，加入待檢血清后，陽(yáng)性抗體會(huì)與包被蛋白上的特定表位結(jié)合并封閉，使之后加入的酶標(biāo)單抗無(wú)法結(jié)合到該表位上，從而起到了阻斷作用，反應(yīng)孔的顏色反應(yīng)強(qiáng)度與特異性抗體含量成反比[4]。本研究中選擇的豬瘟病毒間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒（即I-ELISA）采用的是間接ELISA 原理，而進(jìn)口的豬瘟抗體檢測(cè)試劑盒（即“B-ELISA”）采用的是阻斷ELISA原理，通過(guò)對(duì)這兩種試劑盒的檢測(cè)效果進(jìn)行比較，結(jié)果證明，在對(duì)田間樣本進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，豬瘟病毒間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒的敏感性和特異性均高于豬瘟抗體檢測(cè)試劑盒。

3.3 不同免疫豬群的免疫效果存在差異

對(duì)不同地區(qū)、不同來(lái)源的豬血清樣本進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，I-ELISA檢測(cè)種豬場(chǎng)免疫血清的陽(yáng)性率最高，分別為100%和97.5%，而規(guī)?；i場(chǎng)的陽(yáng)性率在不同地區(qū)呈現(xiàn)不同的水平；B-ELISA檢測(cè)種豬場(chǎng)免疫血清的陽(yáng)性率偏低，分別為70%和92.5%，而規(guī)模化豬場(chǎng)的陽(yáng)性率也有很大差異。通過(guò)兩種試劑盒的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)的豬群免疫水平存在差異，而且選擇不同試劑盒對(duì)抗體水平檢測(cè)結(jié)果也有很大影響。將檢測(cè)結(jié)果存在差異的血清進(jìn)行FVNT定性檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，I-ELISA與FVNT的符合率為70.49%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高出B-ELISA。其他研究也證明[5]，I-ELISA試劑盒的準(zhǔn)確性更高。

[1] 殷震.動(dòng)物病毒學(xué)[M].中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1996.

[2] 涂長(zhǎng)春.豬瘟國(guó)際流行態(tài)勢(shì)、我國(guó)現(xiàn)狀及防制對(duì)策[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003，36（8）：955-960.

[3] 世界動(dòng)物衛(wèi)生組織.陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)和疫苗手冊(cè)（哺乳動(dòng)物、禽鳥與蜜蜂）[M].農(nóng)業(yè)部畜牧獸醫(yī)局/中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，2004.

[4] John R. Crowther，the ELISA guide book[M].2001，Humana Press.

[5] 徐璐，范學(xué)政，徐和敏，等.豬瘟抗體間接ELISA檢測(cè)試劑盒的研制和應(yīng)用[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2012，48（9）：21-24.

藺露（1983-），女，獸醫(yī)師，碩士，主要從事動(dòng)物疫病實(shí)驗(yàn)室診斷及研究。

藺露