代長云吳建英阮 征胡修忠周 華

劉開武2張四化2夏 瑜1華 娟1李 杰1黃海軍1,2 ＊

(1.武漢市畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所,湖北武漢 430208；2.武漢市畜牧獸醫(yī)局,湖北武漢 430023)

豬感染肺炎支原體模型的建立及評估

代長云1,2吳建英2阮 征2胡修忠1周 華1

劉開武2張四化2夏 瑜1華 娟1李 杰1黃海軍1,2 ＊

(1.武漢市畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所,湖北武漢 430208；2.武漢市畜牧獸醫(yī)局,湖北武漢 430023)

為了建立豬肺炎支原體感染的動物模型，選取實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)保存的豬肺炎支原體濟(jì)南株F66株（編號：CVCC354），在不同時間點(diǎn)對12頭實(shí)驗(yàn)豬進(jìn)行人工感染，分別建立早期、中期和晚期豬支原體肺炎動物模型。采用PCR、形態(tài)學(xué)、組織學(xué)等多種方法對模型進(jìn)行評估，證實(shí)早期、中期和晚期豬支原體肺炎動物模型成功建立。

豬 肺炎支原體 動物模型

豬支原體肺炎（Mycop lasma pneumonia of swine）亦稱豬喘氣病或豬流行性肺炎，是由豬肺炎支原體（M ycop lasm a hyopneumonia，MhP）引起的一種慢性呼吸道傳染病。此病具有高發(fā)病率、低死亡率、流行范圍廣的特點(diǎn)，嚴(yán)重影響豬的生長率和飼料轉(zhuǎn)化率，是造成養(yǎng)豬業(yè)經(jīng)濟(jì)損失的重要疾病之一。

MhP是豬呼吸道疾病中最常見的分離病原之一，主要危害除降低日增重和提高料肉比之外，最重要的是它能破壞呼吸道黏膜-纖毛屏障，從而引起多病原的繼發(fā)感染和混合感染，引發(fā)豬支原體肺炎。為了更直觀有效地研究該病的臨床治療方法，我們模擬臨床發(fā)病過程，復(fù)制了肺炎支原體感染的動物模型，為下一步臨床治療研究提供合適的實(shí)驗(yàn)材料。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

PPLO肉湯培養(yǎng)基、酵母粉由BD公司生產(chǎn)，馬血清、MEM培養(yǎng)基由Gibco公司生產(chǎn)，葡萄糖、瓊脂粉、精氨酸、青霉素、1%酚紅均購自武漢眾一生物科技有限公司。

1.2 菌種

菌種及菌液制備；豬肺炎支原體（Mhp）濟(jì)南株F66株（編號：CVCC354）由中國獸藥監(jiān)察所提供。開封后以PPLO培養(yǎng)基原量稀釋、培養(yǎng)、傳代并測其顏色變化單位（ccu/ m l），置-20℃保存，3 d 內(nèi)使用。用前稀釋至104～ 5ccu/ml。

1.3 PPLO培養(yǎng)基配制

葡萄糖2.5g，PPLO 10.5g，酵母粉2.5g，瓊脂粉7.5g（液體培養(yǎng)基中不加），超純水定容至445m l，116℃滅菌20min后，加入馬血清50m l，無菌10%精氨酸5ml，滅菌10×MEM 5ml，無菌8萬單位/m l青霉素溶液5m l，無菌1%酚紅溶液500μL（固體培養(yǎng)基中不加）。

1.4 Mhp的培養(yǎng)及Mhp菌數(shù)的測定（CCU 實(shí)驗(yàn)）

取無菌 PPLO 培養(yǎng)基 100 ml，按 5∶1 比例加入小牛血清 20 m l 混勻，分裝到無菌錐形瓶中，60m l/瓶。培養(yǎng)基中加入 100μl菌液（4℃保存）。蓋硬膠塞后用封口膜封口，靜置培養(yǎng)在 37℃恒溫箱中。每日觀察其顏色變化。我們采用顏色改變單位測定法計(jì)算Mhp 的菌數(shù)，具體如下：

取 11 支無菌小試管，按①～⑩編號，取 1.8 m l已添加小牛血清的PPLO培養(yǎng)基溶液（5∶1 比例）分別加入試管中。取 200μl已傳代培養(yǎng) 7d的處于對數(shù)生長期的菌種加入①號試管中，依次1∶10 遞減稀釋，即①號為Mhp原液，②號管為 10-1，③號管為10-2，依次類推，⑩號管為 10-9，第 11 號試管作為陰性對照管不加Mhp菌液。將各組試管加蓋硬膠塞并用封口膜封口后，靜置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)，每日觀察顏色變化以及液體有無渾濁改變。發(fā)生顏色改變的最高稀釋度為顏色改變單位。

1.5 試驗(yàn)動物

12頭健康杜洛克長白雜交豬，公母兼有，購自武漢市畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所試驗(yàn)豬場。在豬場實(shí)驗(yàn)豬舍觀察兩周，無咳嗽、氣喘等癥狀后進(jìn)入試驗(yàn)環(huán)節(jié)。隨機(jī)分為4組，試驗(yàn)1組（早期）3頭（24.4±1.6kg），試驗(yàn)2組（中期）3頭（24.2±1.7kg），試驗(yàn)3組（晚期）3頭（24.6±1.4kg），對照組3頭（24.5±1.2kg）。飼養(yǎng)管理按照《武漢市畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所試驗(yàn)豬場飼養(yǎng)管理規(guī)定》進(jìn)行。

1.6 動物感染 MhP

1.6.1 接種批次與劑量

試驗(yàn)組（早、中、晚期）每頭動物第 0 天接種含 1×107ccu/ ml的MhP液各10ml；對照組動物第 0 天接種無菌 0.9%生理鹽水各10m l。

1.6.2 接種方法

用加樣器吸入處于對數(shù)生長期的Mhp 菌液，緩滴入試驗(yàn)豬鼻腔使其進(jìn)入氣管支氣管[5]。

1.7 動物模型的評估

1.7.1 樣品收集

試驗(yàn)1組（早期）、試驗(yàn)2組（中期）、試驗(yàn)3組（晚期）分別于接種后12d、16d、21d后采集樣品。收集鼻腔及咽喉處分泌物，放入加有1 m l 生理鹽水的滅菌試管中。

1.7.2 模型建立標(biāo)準(zhǔn)

（1）外觀表現(xiàn)觀察

接種后，每間隔6h 觀察1 次，分別記錄試驗(yàn)豬和對照豬的精神狀態(tài)及臨床表現(xiàn)。每天記錄日增重、體溫。

（2）剖檢及組織病理切片檢測

剖檢時主要觀察肺部、淋巴等組織器官病變情況。按常規(guī)程序制備肺臟和淋巴組織切片，行HE染色，在顯微鏡下觀察病變情況。

（3）PCR檢測

將收集的樣品高速離心，棄上清后加入20μl STET 細(xì)胞裂解液，煮沸10 m in，離心后取上清用于PCR 檢測。PCR反應(yīng)體系25μl：10×PCR Buffer 2.5μl，dNTP（2.5mM/L）2μl，陽性引物5’-ACACCATGGGAGCTGGTAA-3’和5’-CATCGACTTTCAGACCCAAGGCAT-3’（10μl/L）各0.5μl，陽性模板1μl，Taq DNA polymerase（2.5U/μl）0.25μl，加ddH2O至25μl。同時設(shè)立ddH2O陰性對照。反應(yīng)條件為：94℃5min，94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，35個循環(huán)，72℃ 10min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取1μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 MhP的培養(yǎng)

MhP在含有 20%胎牛血清的 PPLO 培養(yǎng)基中生長時能夠分解葡萄糖產(chǎn)酸但不產(chǎn)氣，使培養(yǎng)液的 pH 值降低，酚紅指示劑由紅色變?yōu)殚冱S色，隨著MhP的生長，pH 值進(jìn)一步降低，黃色逐漸加深，到 3 周末時已全部變成黃色。

于 37℃恒溫箱內(nèi)靜置培養(yǎng) 1 個月后，各試管中培養(yǎng)液顏色改變在⑧號管（10-7）處停止，表明其 CCU 值為 107，即被測菌液稀釋到 10-7仍有MhP生長，每支試管中液體均無沉淀渾濁。

2.2 感染豬外觀表現(xiàn)

感染豬表現(xiàn)明顯的精神沉郁，靠墻角呆立或臥倒，活動減少，被毛粗糙，肺部出現(xiàn)明顯的肺濕呼吸音（圖1a）。感染12 d以后模型組各種癥狀逐漸加重（圖1b），尤其是鼻部出現(xiàn)膿性分泌物，個別者帶有少量血絲，呼吸時可聽到鼻塞聲和喘鳴聲。體重下降，體溫升高。

圖1 感染豬精神沉郁、呆立或臥倒

2.3 組織病理變化

剖檢顯示對照組3頭豬的肺組織及其他臟器無明顯炎癥反應(yīng)。試驗(yàn)組肺組織、淋巴組織多呈中度或重度炎癥改變（圖 2），肺部病變明顯，外觀充血、水腫，嚴(yán)重者肺葉分布散在大小不等的壞死灶。其中試驗(yàn)1組有2頭豬肝臟呈輕度炎癥改變，試驗(yàn)1組有2頭豬的腎臟呈輕度炎癥改變。

組織切片結(jié)果顯示了早期、中期、晚期3組試驗(yàn)豬的肺臟、淋巴等病理變化特征，與其對應(yīng)分為輕度感染、中度感染、重度感染3個過程，具體如下：

輕度（早期）：病變范圍比較局限，肺泡間隔輕度增寬，間隔內(nèi)有少量淋巴細(xì)胞浸潤，細(xì)支氣管上皮排列尚規(guī)則，管腔的周圍有少量炎癥細(xì)胞浸潤。

中度（中期）：病變范圍比較廣泛，肺泡間隔增寬較明顯，間隔內(nèi)有較多淋巴細(xì)胞浸潤，肺泡結(jié)構(gòu)部分破壞，細(xì)支氣管上皮增生、破壞，小血管周圍淋巴細(xì)胞浸潤。

重度（晚期）：病變范圍廣泛，肺泡間隔明顯增寬，間隔內(nèi)有大量淋巴細(xì)胞浸潤，細(xì)支氣管上皮破壞、脫落，管腔內(nèi)有明顯滲出，肺間質(zhì)毛細(xì)血管、支氣管旁小靜脈瘀血。

圖2 感染豬肺臟、淋巴病變

圖3 豬肺臟、淋巴病理切片

2.4 PCR檢測結(jié)果

PCR檢測結(jié)果表明，收集的試驗(yàn)組9頭豬樣品中均檢測到豬肺炎支原體陽性，且在一定程度上感染時間延長呈陽性增強(qiáng)趨勢，對照組3頭豬均為陰性（圖4）。證實(shí)豬肺炎支原體模型構(gòu)建成功。

圖4 PCR檢測結(jié)果

3 討論

豬支原體肺炎對各種豬均易感，在新引進(jìn)豬群多呈急性暴發(fā)，其發(fā)病率和死亡率常在20%以上，最急性型的死亡率可高達(dá)80%～100%。本病發(fā)病率高，流行快，除引起死亡外還導(dǎo)致病豬長時間帶菌，大量消耗機(jī)體組織，嚴(yán)重影響豬的生產(chǎn)性能和商品性能，大大增加養(yǎng)殖成本。而且，支原體可通過空氣傳播，很難隔離阻斷傳播途徑，極易引起全群發(fā)病，是公認(rèn)的最難凈化的豬病，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大損失。本病在我國的流行十分廣泛，呈逐年上升趨勢，已成為危害養(yǎng)豬業(yè)最嚴(yán)重的疾病之一，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

目前，已有多種動物成功建立了支原體肺炎的模型，但是對豬支原體肺炎模型的建立及相關(guān)研究非常有限。本研究建立豬肺炎支原體感染模型，旨在為有針對性地治療豬支原體肺炎疾病提供理想的動物模型。

本研究中采用的 PPLO 培養(yǎng)基成分和常用于 MhP 分離培養(yǎng)的Hayflick 培養(yǎng)基基本相同。此外 SP-4 培養(yǎng)基、馬丁氏肉湯培養(yǎng)基等也用于 MhP 分離培養(yǎng)，其基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分基本相同[10]。MhP的培養(yǎng)要求比普通細(xì)菌高，除了一般基礎(chǔ)營養(yǎng)物質(zhì)外，還需添加10%～20%的動物血清提供膽固醇、脂肪酸和蛋白質(zhì)及 10%的新鮮酵母浸液以提供核苷酸前體、維生素及刺激生長因子等。接種前應(yīng)將培養(yǎng)基的 pH 值調(diào)至 7.8，因 MhP 生長的最佳 pH 值范圍是7.6～7.8。MhP 分解葡萄糖產(chǎn)酸后使培養(yǎng)基的 pH 值下降，故添加 0.002%的酚紅可作為觀察培養(yǎng)基顏色變化的指示劑。MhP 在固體或液體培養(yǎng)基中生長繁殖達(dá)高峰后，若繼續(xù)培養(yǎng)則由于培養(yǎng)基pH 值的變化而很快死亡。雖然有資料顯示死的 MhP 也能引起實(shí)驗(yàn)動物肺部炎癥改變，但卻不如活菌明顯，因此本研究使用的是107ccu/ml 的MhP 菌液，以保證其中 MhP 的活力。

本實(shí)驗(yàn)接種結(jié)果顯示，試驗(yàn)組接種后第5d即出現(xiàn)了精神狀態(tài)略差，進(jìn)食及活動減少等表現(xiàn)，以后逐漸恢復(fù)，第10d鼻部出現(xiàn)分泌物，伴隨氣喘、豎毛、寒戰(zhàn)等癥狀。在感染晚期，口、鼻分泌物較前明顯增多，提示其氣道反應(yīng)性增加。實(shí)驗(yàn)組動物肺組織病理切片提示不同程度的炎癥改變，如：肺泡間隔增寬，間隔內(nèi)、支氣管旁、血管周圍以淋巴細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤，支氣管上皮細(xì)胞增生、壞死、脫落，肺泡結(jié)構(gòu)破壞等。試驗(yàn)1組多呈輕度改變或無炎癥；試驗(yàn)2組動物多呈中重度改變；試驗(yàn)3組多呈重度改變。所有實(shí)驗(yàn)組動物的鼻腔分泌物的 MhP 培養(yǎng)均為陽性結(jié)果，對照組為陰性。綜上所述：本研究成功建立豬支原體肺炎感染模型，為進(jìn)一步研究 MhP 感染的發(fā)病機(jī)制和 MhP 感染后機(jī)體免疫狀態(tài)及對癥治療奠定了基礎(chǔ)。

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國家自然科學(xué)基金（31201938）、武漢市晨光計(jì)劃（201150431078）、武漢市農(nóng)科院英才計(jì)劃（YC201101）項(xiàng)目資助。

代長云，男，高級獸醫(yī)師，學(xué)士，研究方向?yàn)樾竽莲F醫(yī)研究與技術(shù)推廣。

黃海軍，男，副研究員，博士，研究方向?yàn)閯游锷锛夹g(shù)與疫病防控。