梁高峰，李俊生，何向峰，陳寶安#

1)東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬中大醫(yī)院血液科 南京210009 2)河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院 洛陽471003 3)東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬中大醫(yī)院普外科 南京210009

微小RNA(microRNA，簡稱miRNA)是真核生物內(nèi)源性的小分子非編碼RNA，能夠通過轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。人miRNA 總數(shù)可能占總基因數(shù)的1%，人類全部基因的1/3 可能受miRNA 的調(diào)控［1］。研究證實，miRNA 與多種疾病有關(guān)，如糖尿病［2］、心臟?。?］、癌癥［4］、神經(jīng)系統(tǒng)疾?。?］等。該研究采用SOLiD 高通量測序技術(shù)分析了10 對癌組織和癌旁正常組織miRNA 表達(dá)譜，篩選出兩者間的差異miRNA，利用數(shù)學(xué)模型來綜合分析這些差異表達(dá)的miRNA 對其靶mRNA 的調(diào)控作用及結(jié)直腸癌組織中受miRNA 調(diào)控的KEGG 通路和GO 生物過程，為進(jìn)一步研究結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 標(biāo)本來源 收集東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院組織庫2010年至2011年存檔的冰凍組織標(biāo)本20例，包括結(jié)直腸癌組織10例、癌旁正常組織10例，均參照文獻(xiàn)［6］標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷和分類。

1．1．2 主要試劑 Trizol(Qiagen，德國)，mirVanaTMmiRNA 提取分離試劑盒(Ambion，美國)，SOLiDTM小RNA 表達(dá)檢測試劑盒(Ambion，美國)。

1．2 總RNA 提取及質(zhì)量鑒定 將每個冰凍組織標(biāo)本切5～6 片，片厚8 μm，用Trizol 提取總RNA，然后用mirVanaTMmiRNA 提取分離試劑盒分離小RNA，總RNA 完整性采用10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1．3 SOLiD 測序及分析 使用SOLiDTM小RNA 表達(dá)檢測試劑盒將樣品中的小RNA 轉(zhuǎn)換成雙鏈的cDNA。為避免小RNA 樣品提取過程中產(chǎn)生的miRNA前體斷裂片段的影響，將這些比對上的片段再與miRbase 數(shù)據(jù)庫中的成熟miRNA 序列進(jìn)行最后的比對，從中篩選出miRNA 及其SOLiD 測序片段數(shù)。

1．4 基于測序數(shù)據(jù)的數(shù)學(xué)模型的構(gòu)建 借助miRNA 靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫PicTar(http://pictar．bio．nyu．edu)，獲得結(jié)直腸癌組織中所檢測到的miRNA的所有靶基因，使用公式［1］計算所有測序得到的miRNA 對mRNA 的抑制率。

其中，RmRNAk表示miRNA 對靶mRNAk的抑制率;CountmiRNAi表示所有測序miRNA 中第i個miRNA 的數(shù)量;i，調(diào)控mRNAk的miRNA 數(shù)量，i=1，2，3，……，l;nij，miRNAi的靶mRNA 的數(shù)量;weight，PicTar 得分;Ntotal，小RNA 樣品中所檢測到的總miRNA 數(shù)量。

結(jié)直腸癌組織中，所有miRNA 集合對靶mRNA抑制率差異的比較采用Z-test 方法［7-8］。P0假設(shè)使用如下公式計算:

當(dāng)Z ＞1．96 或＜－1．96，拒絕P0假設(shè)，則結(jié)直腸癌組織中miRNA 對mRNA 的抑制率與癌旁正常組織比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1．5 DAVID 分析 根據(jù)所有miRNA 集合對mRNA 的整體抑制情況，獲得表達(dá)水平受miRNA 影響的蛋白。采用DAVID 分析這些蛋白對KEGG 通路和GO 生物過程的影響。

2 結(jié)果

2．1 SOLiD 測序結(jié)果 結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織中小RNA 片段占1．13%和1．14%。比對結(jié)果表明，每個樣本所比對上的片段數(shù)都達(dá)107以上，長度為21～24 nt，尤以22 nt 的片段最多(圖1)。結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織所得測序片段的分布具有明顯的相似性，而成熟miRNA 的序列長度集中分布在18～24 nt。結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織中分別檢出627 和451個miRNA(表1)。

2．2 結(jié)直腸癌組織中差異表達(dá)的miRNA 結(jié)果見圖2。結(jié)直腸癌組織中表達(dá)上調(diào)的miRNA 中，46個miRNA 的表達(dá)高于2 倍;表達(dá)下調(diào)的miRNA 中，84個miRNA 的表達(dá)低于1/2。

Z-test 結(jié)果(圖3、表2)表明，結(jié)直腸癌組織中較多的miRNA 表達(dá)水平受到影響。超過1/2(194/313)的miRNA 表達(dá)差異明顯，其中80個miRNA 表達(dá)水平明顯上升，114個明顯下降。

基于Z-test 方法所篩選的miRNA 不僅包括了倍數(shù)分析所篩選的miRNA，如miR-101、miR-135b、miR-222、miR-451、miR-4315 等，而且還包括部分表達(dá)量變化不明顯但測序結(jié)果中讀長很大的miRNA，如let-7b、let-7i、miR-125b、miR-126 等。

圖1 與前體序列一致的SOLiD 測序序列的長度分布

表1 SOLiD 測序結(jié)果

圖2 結(jié)直腸癌組織中miRNA 表達(dá)差異的倍數(shù)分析

圖3 結(jié)直腸癌組織中miRNA 表達(dá)差異的Z-test 分析

2．3 miRNA 在染色體上的分布 結(jié)果見圖4。

2．4 miRNA 對其靶基因的調(diào)節(jié) 在結(jié)直腸癌組織中有7 273個mRNA 受到miRNA 的調(diào)控。在受調(diào)控的mRNA 中，865種顯著上調(diào)，占11．9%;973種顯著下調(diào)，占13．4%。見圖5。

2．5 結(jié)直腸癌組織中KEGG 通路和GO 生物過程的系統(tǒng)性調(diào)節(jié) DAVID 分析結(jié)果表明:在結(jié)直腸癌組織中，眾多KEGG 通路受到調(diào)控，而只有部分受到顯著調(diào)控(圖6)。顯著調(diào)控的KEGG 通路主要涉及代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理和細(xì)胞過程四大分支，但其中一些KEGG 通路歸根于環(huán)境信息處理中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，減弱或增強(qiáng)外界環(huán)境對細(xì)胞的刺激作用;在顯著調(diào)控的環(huán)境信息處理途徑中，WNT信號通路和MAPK 信號通路均受到顯著的影響，而這兩者又是結(jié)直腸癌發(fā)展過程中經(jīng)常發(fā)生異常的信號通路。

而GO 分析［9］的結(jié)果表明，在這些變化的miRNA 中，顯著調(diào)控的GO 過程包括:細(xì)胞內(nèi)的生物合成、細(xì)胞代謝、主動的細(xì)胞內(nèi)加工、細(xì)胞周期調(diào)控、程序性細(xì)胞凋亡、細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運等，可大致分為代謝過程、細(xì)胞增殖與細(xì)胞周期、細(xì)胞死亡、細(xì)胞通訊、物質(zhì)運輸五大類(圖7)，大多數(shù)顯著調(diào)控的GO 過程歸根于調(diào)控過程;進(jìn)一步結(jié)合KEGG 公共數(shù)據(jù)庫的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，一些與結(jié)直腸腸癌相關(guān)的信號通路，例如Wnt 信號通路、MAPK 信號通路和TGF-β 信號通路，均受到miRNA 的調(diào)節(jié)。

表2 2種分析方法所得結(jié)直腸癌miRNA 表達(dá)譜的比較

圖4 癌旁正常組織(左)和結(jié)直腸癌組織(右)中miRNA 的染色體分布差異

圖5 結(jié)直腸癌組織中miRNA 對靶基因的抑制率

圖6 結(jié)直腸癌組織中miRNA 對KEGG 通路的調(diào)控

圖7 結(jié)直腸癌組織中miRNA 對GO 生物過程的調(diào)控

3 討論

結(jié)直腸癌的發(fā)生涉及多個癌基因、抑癌基因和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的改變［10］。作者采用SOLiD 技術(shù)對10 對結(jié)直腸癌和癌旁正常組織進(jìn)行高通量測序，得到了一批顯著差異表達(dá)的miRNA。另外，作者比較了倍數(shù)分析法和Z-test 2種方法，發(fā)現(xiàn)miRNA 的倍數(shù)分析法存在著不容忽視的缺點:例如，倍數(shù)分析未能引入統(tǒng)計量，不能反映倍數(shù)變化的統(tǒng)計學(xué)水平。為了全面理解miRNA 在細(xì)胞中的調(diào)控作用，作者根據(jù)高通量測序數(shù)據(jù)將Z-test 引入到表達(dá)譜差異的分析中，借助數(shù)學(xué)模型綜合分析miRNA 的調(diào)控作用，該模型包含樣品中所有檢測到的miRNA。結(jié)果表明，miRNA 對部分mRNA 的抑制率達(dá)到顯著水平。miRNA 抑制的靶mRNA 中，少部分mRNA 的miRNA 抑制率發(fā)生顯著變化。該方法比常規(guī)倍數(shù)分析法更能真實反映miRNA 的表達(dá)變化。

應(yīng)用不同的miRNA 表達(dá)譜篩選方法所得到的篩選結(jié)果亦存在區(qū)別。通過比較倍數(shù)分析法和Ztest 的結(jié)果，作者發(fā)現(xiàn)2種方法用于鑒別miRNA 表達(dá)水平增減趨勢時，所得結(jié)果一致。但在篩選表達(dá)量變化明顯的miRNA 時，基于Z-test 方法所篩選的miRNA 不僅包括了倍數(shù)分析所篩選的miRNA，而且還包括部分表達(dá)量變化不明顯但測序結(jié)果中拷貝數(shù)卻很大的miRNA。這說明在篩選miRNA 時，使用倍數(shù)分析法會遺漏部分倍數(shù)變化不大但覆蓋度較高的miRNA。這也說明了Z-test 用于miRNA 表達(dá)譜分析的優(yōu)勢:不但考慮miRNA 倍數(shù)變化，更考慮其在miRNA 群體中的覆蓋度，最為重要的是具有統(tǒng)計學(xué)意義，避免了篩選miRNA 時主觀因素的影響。

結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中，miRNA 染色體分布的變化可反映結(jié)直腸癌發(fā)病過程中對miRNA 轉(zhuǎn)錄的差異調(diào)控。同樣，miRNA 的表達(dá)差異會對細(xì)胞內(nèi)KEGG 通路和GO 生物過程產(chǎn)生重要影響，進(jìn)而影響細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，如MAPK、WNT、TGF-β 信號通路等［11］。細(xì)胞調(diào)控miRNA 的差異表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞過程。對細(xì)胞內(nèi)GO 調(diào)控過程的調(diào)節(jié)可事半功倍地調(diào)控細(xì)胞效應(yīng)，是miRNA 調(diào)控基因表達(dá)的經(jīng)濟(jì)之體現(xiàn)，是對細(xì)胞信號通路的主動調(diào)節(jié)、自適應(yīng)調(diào)節(jié)的過程。而受調(diào)控的KEGG 通路間的差異，反映了不同病理、生理狀態(tài)細(xì)胞間的差異。這說明miRNA 表達(dá)譜的異常變化對結(jié)直腸癌的發(fā)生起到重要的調(diào)節(jié)作用;同時，也說明這些異常表達(dá)的miRNA也可能參與其他相關(guān)癌癥的生物過程，也就是說，其中的一部分miRNA 是不同癌癥發(fā)生過程中都發(fā)生變化的［12］。

綜上，作者建立了基于miRNA 表達(dá)譜的結(jié)直腸癌基因調(diào)控系統(tǒng)分析體系，miRNA 表達(dá)譜變化是細(xì)胞對長期外部刺激的自適應(yīng)調(diào)節(jié)過程，結(jié)合miRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)，借助生物信息學(xué)工具研究miRNA 對KEGG 通路和GO 生物過程的調(diào)控，并可據(jù)此系統(tǒng)地分析不同疾病過程中miRNA 表達(dá)譜的變化。

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