彭 浩，陳 宇，李佑鋒，朱 旋，周作瓊，吳秀山，范雄偉，李永青

(湖南師范大學(xué) 心臟發(fā)育研究中心 蛋白質(zhì)化學(xué)及魚類發(fā)育生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410081)

Txt5位于2號(hào)染色體短臂11區(qū)2帶，長(zhǎng)度為3239 bp，編碼蛋白含391個(gè)氨基酸，從N 端開始依次為L(zhǎng)isH、CTLH、CRA 結(jié)構(gòu)域.LisH 結(jié)構(gòu)域被發(fā)現(xiàn)存在于很多病癥相關(guān)基因的產(chǎn)物之中[1-2].已經(jīng)有研究證明，Txt5可能參與了MAPK 途徑對(duì)細(xì)胞生命活動(dòng)的調(diào)控[3].RT-PCR 分析顯示這一基因在人類早期胚胎的多個(gè)組織中有表達(dá)，在心臟、肝和腎中表達(dá)水平較強(qiáng).腺病毒轉(zhuǎn)染能夠使外源基因在原代細(xì)胞中高效表達(dá)[4]，為了進(jìn)一步研究Txt5 基因的功能，本文利用Ad-Easy 腺病毒系統(tǒng)研制了小鼠Txt5 基因的過(guò)表達(dá)腺病毒[5]，為后續(xù)研究Txt5表達(dá)及生物學(xué)功能提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 生物材料

解剖小鼠取心臟提取mRNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNAs.連接載體pMD18-T 購(gòu)買于Takara.穿梭載體pAdTrack-CMV、BJ5183 菌株以及HEK293 A 細(xì)胞均為實(shí)驗(yàn)室所保存.

1.1.2 所用主要試劑

PmeΙ、Pac Ι 內(nèi)切酶均購(gòu)買于NEB公司，T4 DNA連接酶、Sal Ι和Hind III 限制性內(nèi)切酶買于Takara公司;膠回收純化試劑盒購(gòu)買于康維世紀(jì)公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)買于Thermo fisher公司，小量快速質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)買于康維世紀(jì)公司;兔源HA 一抗為美國(guó)圣克魯斯公司生產(chǎn);Lipofectamine 2000 試劑購(gòu)買于英濰捷基公司;高糖DMEM 培養(yǎng)基、F12 培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)買于Hyclone公司.

1.2 方法

1.2.1 穿梭質(zhì)粒pAdTtrack-CMV-Txt5的構(gòu)建

根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)計(jì)特異引物如下:5'-AGATCTATGGATCAGTGCGTGACGGTG-3'和5'-AAGCTTTCAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTA GAAAAATATCTGTTTGGCATCTCCT-3'.

PCR 擴(kuò)增目標(biāo)片段經(jīng)測(cè)序正確后連接至pMD-18 T 載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，卡那霉素篩選陽(yáng)性克隆.

1.2.2 pAd-Txt5的獲得

質(zhì)粒小提試劑盒提取穿梭質(zhì)粒pAdTrackCMV-Txt5，用Pme Ι 酶37℃酶切過(guò)夜線性化，純化回收酶切產(chǎn)物.將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入BJ5183 感受態(tài)，通過(guò)其內(nèi)的重組組件發(fā)生同源重組，涂布于卡那抗性平板上篩選.質(zhì)粒小提試劑盒提取重組質(zhì)粒，37℃Pac Ι 酶切過(guò)夜線性化，2%凝膠電泳觀察是否有兩條帶，利用酚氯仿法抽提DNA，保存于-20℃.

1.2.3 線性化pAd-Txt5 轉(zhuǎn)染HEK 293 A 細(xì)胞

復(fù)蘇凍存于液氮中的HEK 293A 細(xì)胞，培養(yǎng)于10 cm 培養(yǎng)皿中.當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)80%左右后，取線性化的pAd-Txt5 4 μg，通過(guò)Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染HEK 293 A 細(xì)胞.5 h 后換含10%胎牛血清的培養(yǎng)液10 ml，轉(zhuǎn)染12 h 后通過(guò)熒光顯微鏡觀察HEK 293 A 細(xì)胞綠色熒光情況，之后每隔12 或24 h 觀察熒光并拍照.在第10 d 左右，會(huì)有大團(tuán)細(xì)胞漂浮.吸打下細(xì)胞，將細(xì)胞液用液氮反復(fù)凍融2～3次，2 000 r/min，10 min.上清即病毒粗提液，EP 管分裝于-80℃保存.

1.2.4 Ad-Txt5 病毒顆粒的擴(kuò)增

10 cm 皿中293 A 細(xì)胞密度約達(dá)80%的時(shí)候，開始轉(zhuǎn)染:取0.4 ml 病毒粗提液溶液加到皿中，在第3 d左右，會(huì)有大團(tuán)細(xì)胞漂浮.將細(xì)胞吸打下來(lái)，將細(xì)胞液用液氮反復(fù)凍融2～3次，2 000 r/min，10 min.上清即病毒粗提液，EP 管分裝于-80℃保存.

1.2.5 分離和培養(yǎng)原代心肌細(xì)胞

解剖出生一或兩天SD 大鼠，冰上剪取心臟的心室心尖，PBS 中洗去血液.接著剪碎組織，先后于0.06%胰酶中和II 型膠原酶中進(jìn)行消化.然后將消化完全后的液體加入10 mL 含10% FBS 培養(yǎng)基中終止消化，混勻，2 000 r/min，10 min，倒去上清.加5 mL含10% FBS的培養(yǎng)基再洗一次，2 000 r/min，5 min.倒去上清，用20 mL 含10% FBS和0.067 mg/mL 濃度Brdu的DMEM-F12 培養(yǎng)液混勻細(xì)胞，200 目篩過(guò)濾細(xì)胞液至兩個(gè)10 cm 皿中.差速貼壁2 h 后，將懸浮細(xì)胞液體吸取到10 cm 皿中，2 d 后更換培養(yǎng)基.

1.2.6 免疫印跡鑒定

將Ad-Txt5 重組腺病毒和Ad-GFP 空載腺病毒感染心肌細(xì)胞，72 h 之后可見到綠色熒光，收取心肌細(xì)胞，提RNA 及蛋白.將蛋白進(jìn)行電泳:配置電泳膠，加入等體積的蛋白樣品40 μg，120 V 電泳20 min;濕轉(zhuǎn):100 V，90 min 將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF 膜上，15 V，1 h.加封閉液(TBST 加5%脫脂奶粉)，37℃封閉1～2 h;用TBST 洗去牛奶的顏色;兔源HA 一抗孵育，4℃過(guò)夜;TBST 溶液洗膜，3次，每次5 min，然后進(jìn)行二抗的孵育，加入二抗，室溫1 h;TBST 溶液再次洗膜3次，每次10 min;加入ECL 系統(tǒng)顯色，壓片，洗膜，觀察結(jié)果.

1.2.7 RT-PCR

按mRNA Selective PCR Kit 試劑盒說(shuō)明書取適量的RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄.利用cDNA為模板，進(jìn)行一般的PCR實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)程序:95℃，預(yù)變性2 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán);72℃延伸8 min.4℃保存，通過(guò)凝膠電泳來(lái)分析PCR 結(jié)果.

RT-GAPDH-S:5'AGCCCAGAACATCATCCCT3'

RT-GAPDH-A:5'GGTCCTCAGTGTAGCCCAAG3'

2 結(jié)果分析

2.1 pAd-Txt5 質(zhì)粒的獲得與鑒定

將pMD18-T-Txt5 利用Sal Ι和Hind III 限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，純化回收目的片段連接于同樣雙酶切后的穿梭載體pAdtrack-CMV 上，接著進(jìn)行轉(zhuǎn)化，提取出穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV-Txt5.再次Sal Ι和Hind III 限制性內(nèi)切酶雙酶切穿梭質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，1.8%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果有2條帶，上方條帶約為9 200 bp，下方條帶約為1 000 bp，證明穿梭質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖1A).將重組完成后的腺病毒質(zhì)粒用Pac Ι 酶切后進(jìn)行1.8%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果有2條帶，上方條帶約為34 kb，下方條帶約為4 kb 亮帶，說(shuō)明腺病毒質(zhì)粒pAd-Txt5 成功獲得(圖1B).

2.2 腺病毒顆粒的獲得

腺病毒質(zhì)粒pAd-Txt5 線性化之后轉(zhuǎn)染HEK 293A細(xì)胞，24 h 后可見到綠色熒光(GFP)，之后熒光逐漸增多，48 h 時(shí)熒光大量出現(xiàn)(圖2)，12 d 左右，細(xì)胞大團(tuán)飄起，移液器將細(xì)胞吸打下來(lái)，反復(fù)凍融獲得病毒溶液，過(guò)濾后再次感染293 A 細(xì)胞，12 h 后依然可以看到綠色熒光.

2.3 Txt5 過(guò)表達(dá)腺病毒在心肌細(xì)胞中的表達(dá)

圖1 穿梭質(zhì)粒pAdTrack－CMV－Txt5和腺病毒質(zhì)粒pAd－Txt5酶切后電泳圖

圖2 線性化pAd－Txt5轉(zhuǎn)染48 h后觀察結(jié)果(×20)

Txt5 基因通過(guò)IRES 序列與腺病毒載體基本骨架中的GFP 序列共表達(dá)，感染了腺病毒的心肌細(xì)胞就會(huì)出現(xiàn)綠色熒光.Txt5 過(guò)表達(dá)腺病毒感染SD 大鼠原代心肌細(xì)胞，48 h 后出現(xiàn)比較強(qiáng)的綠色熒光.病毒沒(méi)有使心肌細(xì)胞出現(xiàn)明顯的死亡現(xiàn)象且形態(tài)完整，可見毒性還算安全(圖4).

為檢測(cè)腺病毒是否能發(fā)揮應(yīng)有的作用，將過(guò)濾后的病毒粗提液感染SD 大鼠原代心肌細(xì)胞.提取RNA和蛋白，然后進(jìn)行RT-PCR，另外用兔HA 一抗和羊抗兔二抗做Western blot 檢測(cè).RT-PCR 顯示，Txt5表達(dá)上調(diào);Western blot的結(jié)果顯示，感染Txt5 過(guò)表達(dá)腺病毒的心肌細(xì)胞中檢測(cè)到與Txt5 融合表達(dá)的HA，而感染空載腺病毒Ad-GFP的對(duì)照組中未檢測(cè)到該條帶(圖4)，說(shuō)明該腺病毒成功介導(dǎo)Txt5 在SD 大鼠原代心肌細(xì)胞中的表達(dá).

圖3 Txt5過(guò)表達(dá)腺病毒感染原代心肌細(xì)胞觀察結(jié)果

圖4 RT－RCR與免疫印跡法檢測(cè)腺病毒效果

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)基因的產(chǎn)物都具有LisH 結(jié)構(gòu)域[6].這一結(jié)構(gòu)域可能參與調(diào)節(jié)微管的動(dòng)力，參與二聚化或與微管胞質(zhì)動(dòng)力蛋白重鏈相結(jié)合.Txt5 蛋白包含有LisH 結(jié)構(gòu)域，這給我們啟示，是否Txt5和MAPK 信號(hào)通路有關(guān)[7].MAPK是一類重要的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激酶，調(diào)節(jié)多種激素、神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子對(duì)細(xì)胞生理活動(dòng)的作用，該激酶作用底物多為例如Elk21、AP21[8]等的轉(zhuǎn)錄因子.

腺病毒在研究基因功能和治療方面的應(yīng)用具有以下優(yōu)勢(shì):1)比較廣的宿主范圍，可以感染原代心肌細(xì)胞;2)能有效進(jìn)行增殖，滴度較高，易于培養(yǎng);3)基本上不插入宿主的基因組，不造突變[9-10].本文所用的腺病毒載體基本骨架中便含有GFP 序列，通過(guò)IRES 序列Txt5 基因與GFP 共表達(dá)，綠色熒光就會(huì)出現(xiàn)在感染了腺病毒的心肌細(xì)胞，視覺上就能判定感染效率.而RT-PCR 證明mTxt5 水平的上調(diào)，western blot發(fā)現(xiàn)HA表達(dá)，說(shuō)明腺病毒效果良好，符合實(shí)驗(yàn)要求.

本文研制小鼠Txt5 過(guò)表達(dá)腺病毒的操作簡(jiǎn)單，周期較短，并且獲得的腺病毒滴度較高，毒性不強(qiáng)，能滿足體外實(shí)驗(yàn)的要求.而現(xiàn)今市面上檢測(cè)Txt5的抗體比較少，本文研究設(shè)計(jì)中將Txt5 與HA 標(biāo)簽融合表達(dá)，從而可以通過(guò)常用的HA 對(duì)應(yīng)抗體檢測(cè)Txt5表達(dá)，給Txt5表達(dá)水平和位置的研究帶來(lái)了極大的幫助.

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