胡朝暾，肖 震，黃 艷，劉中華

(1.懷化學(xué)院 生命科學(xué)系，湖南 懷化 418008;2.湖南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖南 長沙 410081)

天然生物毒素研究對神經(jīng)生物學(xué)和藥理學(xué)研究與發(fā)展具有重要的意義.許多天然神經(jīng)毒素已成為研究離子通道、神經(jīng)遞質(zhì)、受體、神經(jīng)突觸傳遞等神經(jīng)生物學(xué)和神經(jīng)藥理學(xué)基礎(chǔ)理論問題不可替代的工具試劑.蜘蛛毒素是這類天然毒素一個(gè)新的重要的來源.蜘蛛毒素是離子通道工具試劑、特定藥理學(xué)活性新型化合物和生物殺蟲劑來源物質(zhì)日益受到人們關(guān)注和廣泛重視[1-7].

家福捕鳥蛛是一種生活在中國廣西、云南邊遠(yuǎn)山區(qū)的中等大小，全身長滿絨毛的有毒蜘蛛(圖1).作為蜘蛛新種，家福捕鳥蛛第一次于2008年在云南被發(fā)現(xiàn)并進(jìn)行了分類方面的研究[8].筆者于2012年4月在廣西寧明縣中越邊境山區(qū)采集了該種蜘蛛，并開展了其毒素研究.前期研究表明蜘蛛毒素具有異質(zhì)性，不同種類的蜘蛛其毒腺分泌的毒素分子具有不同的結(jié)構(gòu)與功能特性.作為最近才發(fā)現(xiàn)和鑒定的新種蜘蛛——家福捕鳥蛛包含了許多具有特定藥理學(xué)活性和生物殺蟲劑的毒素分子.因此，本文開展家福捕鳥蛛粗毒對美洲蜚蠊和小鼠的急性毒性實(shí)驗(yàn)的測定，來判斷粗毒的毒性大小以及粗毒對物種的選擇性，可為家福捕鳥蛛毒素的后續(xù)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

圖1 家福捕鳥蛛

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與家福捕鳥蛛

家福捕鳥蛛采于廣西寧明的山區(qū);昆明種小鼠購自中南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物房;美洲蜚鐮從網(wǎng)上購買后放置在實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng).

1.1.2 試劑與溶液的配制

昆蟲生理鹽水:稱取7.6 g NaCl、0.3725 g KCl、0.111 g CaCl2，溶解在少量的超純水中，定容到100 ml.

哺乳動(dòng)物生理鹽水:稱取0.9 g NaCl，溶解在少量超純水中，定容到100 ml.

1.1.3 儀器設(shè)備

采毒器 (中國南方蜘蛛養(yǎng)殖所專用);離心機(jī)(德國Eppendorf 5424 型).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 家福捕鳥蛛毒液

采用電刺激方法采集家福捕鳥蛛毒液.具體過程如下:將一個(gè)內(nèi)徑2 cm，高5 cm的塑料杯固定在鐵架臺(tái)上作為毒液接收皿，用紗布包好的大鑷子從側(cè)面夾住蜘蛛胸部，讓蜘蛛張開螯爪并深入杯內(nèi)，然后用5～10 V、15～40 Hz的脈沖電流刺激螯爪基部1～3 s，蜘蛛馬上將觸肢緊緊抱住杯壁，螯爪用力刺向杯壁并射出白色透明的液體.用移液器吸取并計(jì)量每只蜘蛛射出毒液的體積，然后將毒液收集轉(zhuǎn)移至進(jìn)口EP 管里，8 000 rpm 4℃離心20 min，收集上清液，上清液即為家福捕鳥蛛毒液.毒液經(jīng)真空冷凍干燥后所得粉末即為家福捕鳥蛛粗毒.

1.2.2 LD50測定預(yù)實(shí)驗(yàn)[9]

選取美洲蜚蠊12只隨機(jī)分成6組，每組2只用昆蟲生理鹽水配制一系列濃度的蜘蛛毒液，將20 μl 毒液從蜚蠊第四、五腹板交接處注入，觀察蜚蠊的死亡情況.選取昆明小鼠4只，用生理鹽水配制一系列的蜘蛛毒液，將100 μl 毒液注射到小鼠的腹腔.觀察小鼠的死亡情況.通過蜚蠊和小鼠的死亡情況來確定毒素的大致注射劑量.

1.2.3 家福捕鳥蛛粗毒對美洲蜚蠊LD50的測定[10]

選取體重為1 g 左右的美洲蜚蠊42只，粗毒用昆蟲生理鹽水溶解.將蜚蠊共分7組，每組6只，按照蜚蠊每克體重0、25.45、38.17、57.26、85.89、128.84、193.25 μg 劑量從第四、五腹板交接處注射毒液20 μl，觀察24 h，統(tǒng)計(jì)蜚蠊的死亡情況.

1.2.4 LD50的計(jì)算公式

測定完成后，統(tǒng)計(jì)美洲蜚蠊的死亡數(shù)目，計(jì)算死亡率(P)，LD50的計(jì)算按改良寇式法的公式:

式中Xm為最大劑量的對數(shù)值，p為各組動(dòng)物死亡率，∑p為各組死亡率的總和，i為相鄰兩組劑量之比的對數(shù).

2 結(jié)果

2.1 家福捕鳥蛛毒液

本實(shí)驗(yàn)采用電刺激方法采集家福捕鳥蛛毒液，毒液為無色透明的液體，毒液易溶于水.我們對每只蜘蛛每次射毒量、鮮毒液的重量，毒液凍干后的重量，毒液的蛋白質(zhì)含量等性質(zhì)進(jìn)行了初步測定，其結(jié)果見表1.

表1 家福捕鳥蛛毒液的部分性質(zhì)

2.2 家福捕鳥蛛粗毒對美洲蜚蠊LD50的測定

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，確定家福捕鳥蛛粗毒對美洲蜚蠊急性毒性實(shí)驗(yàn)各組劑量為:0、25.45、38.17、57.26、85.89、128.84、193.25 μg/g.粗毒注射后觀察各組蜚蠊的中毒癥狀，24 h 后統(tǒng)計(jì)蜚蠊死亡情況.結(jié)果見表2.對照組注射等體積的昆蟲生理鹽水時(shí)，蜚蠊沒有出現(xiàn)明顯的異常情況，說明注射昆蟲生理鹽水對蜚蠊沒有明顯的影響.實(shí)驗(yàn)組粗毒劑量為25.45 μg/g 時(shí)，蜚蠊出現(xiàn)輕微的行動(dòng)遲緩的中毒癥狀，癥狀在幾分鐘內(nèi)很快消失，24 h 內(nèi)蜚蠊無死亡，當(dāng)粗毒劑量為38.17 μg/g 時(shí)，蜚蠊出現(xiàn)后肢麻痹、行動(dòng)遲緩等較明顯的中毒癥狀，24 h 內(nèi)統(tǒng)計(jì)有1只蜚蠊死亡.隨著粗毒劑量的加大，蜚蠊中毒癥狀加重，死亡數(shù)目增加.當(dāng)粗毒劑量為193.25 μg/g 時(shí)，蜚蠊剛開始表現(xiàn)為到處亂串，異常興奮和全身抖動(dòng)，然后活動(dòng)減弱，直至死亡，大部分蜚蠊死亡時(shí)腹部朝上.蜚蠊在幾分鐘內(nèi)全部死亡.經(jīng)測定得到家福捕鳥蛛粗毒對美洲蜚蠊LD50為85.90 μg/g.

表2 家福捕鳥蛛粗毒對美洲蜚蠊LD50統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.3 家福捕鳥蛛粗毒對小鼠急性毒性預(yù)實(shí)驗(yàn)

選取4只小鼠按照10、16.67、19.38和46.30 mg/kg 小鼠體重進(jìn)行家福捕鳥蛛粗毒對小鼠急性毒性預(yù)實(shí)驗(yàn)，小鼠經(jīng)腹腔注射粗毒后的中毒癥狀如表3.從表中結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)家福捕鳥蛛粗毒對小鼠毒性較弱，當(dāng)粗毒注射劑量為10 mg/kg 體重時(shí)，小鼠未出現(xiàn)明顯的中毒癥狀，說明此劑量粗毒對小鼠無明顯影響.當(dāng)粗毒注射劑量為16.67 mg/kg 體重時(shí)，小鼠出現(xiàn)較明顯的中毒癥狀，但癥狀在一小時(shí)內(nèi)消失.當(dāng)劑量達(dá)到19.38 mg/kg 時(shí)，小鼠出現(xiàn)行動(dòng)遲緩、腹部劇烈抽搐等明顯的中毒癥狀，癥狀也能在一小時(shí)內(nèi)消失;當(dāng)劑量達(dá)到46.30 mg/kg 時(shí)，小鼠出現(xiàn)非常明顯的中毒癥狀，24 min 時(shí)中毒死亡.根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測家福捕鳥蛛粗毒對小鼠的LD50在19.38～46.30 mg/kg之間，其數(shù)值遠(yuǎn)大于以前公布的幾種蜘蛛粗毒的數(shù)值.因此，從節(jié)約毒素的角度和實(shí)際意義出發(fā)，沒有進(jìn)行粗毒對小鼠LD50實(shí)際值的測定.

表3 家福捕鳥蛛粗毒對昆明小鼠急性毒性預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

3.1 電刺激采毒法

電刺激采毒法是筆者在實(shí)驗(yàn)室原有塑料軟管采毒法基礎(chǔ)上探索出來的一種新的蜘蛛毒液采集方法.電刺激采毒法具有很多優(yōu)點(diǎn):單蛛毒液采集量多;能夠讓蜘蛛快速射出全部毒液;所采集的毒液純度較高;采毒技術(shù)簡單，易于操作;適合較大規(guī)模的毒液采集.不足之處是電刺激采集時(shí)容易對蜘蛛造成損傷，如果刺激強(qiáng)度(刺激電流和頻率)及刺激時(shí)間控制不好蜘蛛很容易被電暈甚至電死(刺激強(qiáng)度大、刺激時(shí)間長或者兩者兼有不僅直接對蜘蛛機(jī)體造成損傷，而且還會(huì)造成蜘蛛體液的大量流失，最終影響蜘蛛正常的生理活動(dòng)甚至導(dǎo)致蜘蛛的死亡).因此，應(yīng)根據(jù)蜘蛛個(gè)體的大小嚴(yán)格控制刺激強(qiáng)度和刺激時(shí)間，一般以蜘蛛電刺激后不產(chǎn)生明顯異常癥狀為準(zhǔn).

3.2 家福捕鳥蛛粗毒對美洲蜚蠊和小鼠LD50的測定

在早期的藥學(xué)、毒理學(xué)領(lǐng)域研究中，往往需要一個(gè)量化指標(biāo)直觀地表述某種藥物的毒性.1927年，英國生物學(xué)家Trevn 建議用導(dǎo)致一半動(dòng)物死亡的劑量來表示藥物的毒性大小，并發(fā)表于皇家學(xué)會(huì)雜志，由此確立了半數(shù)致死量的基本概念.如今在動(dòng)物急性毒性試驗(yàn)中，使受試的動(dòng)物半數(shù)死亡所需化學(xué)藥劑的劑量(Median Lethal Dosage)，通常稱為半數(shù)致死量，簡稱LD50.它是一個(gè)經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)算得到的數(shù)值，通常以有毒物質(zhì)質(zhì)量與實(shí)驗(yàn)生物體質(zhì)量之比來表示，如mg/kg[11].

家福捕鳥蛛粗毒對美洲蜚蠊LD50結(jié)果表明家福捕鳥蛛粗毒對美洲蜚蠊具有較強(qiáng)的毒性，不同劑量的粗毒注入后，美洲蜚蠊都表現(xiàn)出程度不同的中毒癥狀.測得家福捕鳥蛛粗毒對美洲蜚蠊LD50為85.90 μg/g.家福捕鳥蛛粗毒對美洲蜚蠊的毒性要強(qiáng)于虎紋捕鳥蛛粗毒(其LD50為300 μg/g)[10]，但弱于間斑寇蛛粗毒(其LD50為1.87 μg/g)[12]和大腹園蛛粗毒(其LD50為30.73 μg/g)[13].因此，家福捕鳥蛛粗毒是一種中等毒性的昆蟲蜘蛛毒素.家福捕鳥蛛粗毒對小鼠LD50在19.38～46.30 mg/kg之間，該數(shù)值遠(yuǎn)大于虎紋捕鳥蛛粗毒對小鼠的LD50(其LD50為1.16 mg/kg)[10]、海南捕鳥蛛粗毒對小鼠的LD50(其LD50為1.25 mg/kg)[14]、雷氏大疣蛛粗毒對小鼠的LD50(其LD50為2.852 mg/kg)[15]、間斑寇蛛粗毒對小鼠的LD50(其LD50為0.16 mg/kg)[12].因此，家福捕鳥蛛粗毒對小鼠的毒性較弱.家福捕鳥蛛粗毒可能主要是一種選擇性作用于昆蟲的蜘蛛毒素.據(jù)調(diào)查，在家福捕鳥蛛棲息地，家福捕鳥蛛主要以直翅目的蟋蟀、蚱蜢、蝗蟲，蜚蠊目的蜚蠊等中小型昆蟲為主.筆者認(rèn)為經(jīng)過億萬年的進(jìn)化，家福捕鳥蛛粗毒進(jìn)化為一種麻痹和殺死昆蟲高效的毒素.有關(guān)家福捕鳥蛛毒素的作用機(jī)理有待深入研究.

[1]Saez N J，Senff S，Jensen J E，et al.Spider-venom peptides as therapeutics[J].Toxins (Basel)，2010，2(12):2851-2871.

[2]Klint J K，Senff S，Rupasinghe D B，et al.Spider-venom peptides that target voltage-gated sodium channels:pharmacological tools and potential therapeutic leads[J].Toxicon，2012，60 (4):478-491.

[3]Windley M J，Herzig V，Dziemborowicz S A，et al.Spider-venom peptides as bioinsecticides[J].Toxins，2012，4 (3):191-227.

[4]Bende N S，Dziemborowicz S，Herzig V，et al.The insecticidal spider toxin SFI1 is a knottin peptide that blocks the pore of insect voltage-gated sodium channels via a large β-hairpin loop[J].FEBS J，2015，282 (5):904-920.

[5]Sachkova M Y，Slavokhotova A A，Grishin EV，et al.Structure of the yellow sac spider Cheiracanthium punctorium genes provides clues to evolution of insecticidal two-domain knottin toxins[J].Insect Mol Biol，2014，23 (4):527-538.

[6]Smith J J，Herzig V，King G F，et al.The insecticidal potential of venom peptides[J].2013，70 (19):3665-3693.

[7]King G F，Hardy M C.Spider-venom peptides:structure，pharmacology，and potential for control of insect pests[J].Annu Rev Entomol，2013，58:475-496

[8]Zhu M S，Zhang R.Revision of the theraphosid spiders from China (Araneae:Mygalomorphae)[J].J Arachnol，2008，36:425-447.

[9]常征.阿霉素對昆明種小白鼠腹腔給藥的半致死劑量研究[J].文山師范高等?？茖W(xué)校學(xué)報(bào)，2009，22 (2):110-113.

[10]梁宋平，覃于賓，張東裔，等.虎紋捕鳥蛛毒的生物學(xué)活性鑒定[J].動(dòng)物學(xué)研究，1993，14 (1):60-65.

[11]楊海智，馬海霞，楊信東.國內(nèi)關(guān)于半數(shù)致死量及類似生物效應(yīng)指標(biāo)測算方法研究進(jìn)展[J].國外醫(yī)藥抗生素分冊，2012，33 (2):62-66.

[12]楊靜.間斑寇蛛粗毒的生物學(xué)活性分析[D].長沙:湖南師范大學(xué)，2007.

[13]段志貴.大腹園蛛粗毒的理化性質(zhì)及毒素組學(xué)研究[D].長沙:湖南師范大學(xué)，2012.

[14]肖玉成.蜘蛛鈉離子通道抑制神經(jīng)毒素的結(jié)構(gòu)與功能研究[D].長沙:湖南師范大學(xué)，2002.

[15]肖橋斌.雷氏大疣蛛毒素的結(jié)構(gòu)與功能研究[D].長沙:湖南師范大學(xué)，2001.