(懷化學(xué)院 化學(xué)與化學(xué)工程系，湖南 懷化 418008)

由于其可逆的相互作用，硼酸基化合物被廣泛地用于化學(xué)/生物傳感的識(shí)別單元，比如對(duì)含鄰位雙羥基的單糖[1-2]、多巴胺[3]、乳酸[4]、糖基化血紅蛋白[5]和糖蛋白識(shí)別[6].而許多糖蛋白包括酶都是含糖基蛋白，如葡萄糖氧化酶的羰基化程度達(dá)到16%～25%.因此，基于硼酸-二醇相互作用用于生物界面的識(shí)別勢(shì)必受到極大的關(guān)注[7-9].通過其單體的電化學(xué)[1，10]或化學(xué)聚合[11]，硼酸-二醇相互作用已經(jīng)被有效地用于聚合自摻雜聚氨基苯硼酸.電化學(xué)聚合一般需在酸性條件下采用恒電位或循環(huán)伏安法來進(jìn)行，但很難制備大量的聚合物.而化學(xué)聚合需采用相對(duì)較強(qiáng)的化學(xué)氧化劑，其氧化產(chǎn)物不能溶解于相應(yīng)的溶劑中[12].因此，酶作為生物催化劑用于聚合物聚合引起了廣泛的關(guān)注[13-18].比如一些氧化還原酶，如HRP[19]、漆酶[20]、葡萄糖氧化酶(GOD)[21]、血紅蛋白[22]等均用于苯胺的水相聚合.

碳納米管(CNTS)由于其高的機(jī)械性能、彈性和獨(dú)特的電子特性而被賦予了廣泛的運(yùn)用，比如基于碳納米管為模板對(duì)聚合物的合成.這些雜化材料表現(xiàn)出來的性質(zhì)往往是不同于任何單一組分所表現(xiàn)出來的性質(zhì).因此，CNTS/聚合物復(fù)合材料在能源器件、微電化學(xué)系統(tǒng)、超級(jí)電容器、太陽能生物傳感器等方面得到改善其性能的作用[23-25].而導(dǎo)電聚合物往往成為了制備碳納米管/聚合物復(fù)合材料的首選，如聚吡咯、聚噻吩和聚苯胺[26-28].聚苯胺不僅能在空氣和許多溶劑中穩(wěn)定存在，還能在質(zhì)子摻雜的條件下表現(xiàn)出獨(dú)特的電子結(jié)構(gòu)和物理性能.

基于PABA 優(yōu)良的生物相容性和特異性識(shí)別及CNTS 優(yōu)良的導(dǎo)電性，以典型糖蛋白酶(HRP)為生物催化試劑，通過一步酶催化作用制備了MWCNTs-HRP-PABA 復(fù)合物材料，并用于過氧化氫的生物傳感的構(gòu)建.過氧化氫的直接電化學(xué)及對(duì)H2O2電化學(xué)催化性能實(shí)驗(yàn)表明，通過酶催化一步制備方法來固定糖蛋白酶能為酶提供了一個(gè)生物相容的微環(huán)境.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

MWCNTs 購自nanoports 有限公司 (中國深圳)，直徑為20～40 nm，長(zhǎng)度5～15 nm.使用前，將用3∶1的濃硝酸和濃硫酸混合配置的溶液處理，80℃反應(yīng)24 h 引入羧酸基團(tuán)，然后分散在水溶液中，用水沖洗到中性pH值，60℃下干燥.

HRP (250 U·mg-1，國藥化學(xué)試劑有限公司)，氨基苯硼酸一水合物(ABA，邵圓化工科技有限公司，上海)，30%的過氧化氫溶液(上海桃浦化工廠)，過氧化氫溶液的制備要現(xiàn)配現(xiàn)用.0.1 M 磷酸鹽緩沖液(PBS)作為支持電解質(zhì).其它試劑均為分析純.所有試劑采用雙蒸餾水制備.實(shí)驗(yàn)均在室溫20℃左右進(jìn)行.

電化學(xué)實(shí)驗(yàn)在CHI660C 電化學(xué)工作站進(jìn)行(CHI儀器有限公司，上海辰華)由CHI660C 軟件控制.電化學(xué)實(shí)驗(yàn)采用玻碳電極為工作電極，飽和甘汞電極(SCE)為參比電極，碳棒為對(duì)電極的三電極系統(tǒng).紫外-可見吸收光譜用UV2450 分光光度計(jì)(島津有限公司，日本).PHS-3C pH 計(jì)(上海雷磁SCI 儀器公司).掃描電化學(xué)顯微鏡SEM (S4800，日本日立).

1.2 MWCNTs-HRP-PABA 復(fù)合材料的制備

MWCNTs-HRP-PABA 復(fù)合材料合成如下:1 mg純化的MWCNTs 超聲分散于10 mL 0.1 M PBS 溶液，然后加入10mg ABA 充分溶解.加入2 mg HRP，不斷攪拌1 h.為了避免由于過量的過氧化物酶的抑制，用0.3%的H2O2溶液逐滴加入，混合物反應(yīng)攪拌1 h 后，直到一種黑色的MWCNTs-HRP-PABA 復(fù)合物從溶液中沉淀出來.未反應(yīng)的單體經(jīng)透析分離12 h 從溶液中除去.

1.3 MWCNTs-HRP-PABA 修飾電極的制備

將玻璃碳電極(GCE，直徑3 mm)清洗干凈.將5 μL 1 mg/mL MWCNTs-HRP-PABA 溶液滴于GCE表面.放入冰箱中自然干燥得到所需電極.

2 結(jié)果與討論

2.1 聚氨基苯硼酸的酶促聚合

用HRP作為生物催化劑，當(dāng)H2O2作為溫和的氧化劑加入到單體溶液，溶液的顏色沒有改變，表明ABA的氧化和聚合發(fā)生的很緩慢.而在HRP 添加后顏色很快變成墨綠色，隨著時(shí)間的推移顏色完全變黑，離心得到復(fù)合物材料.

ABA 氧化聚合的紫外可見光譜如圖1所示.吸光度與酶促聚合在450 nm 附近極化子吸收帶隨H2O2的加入顯著增加，這可能是由于低聚物的合成伴隨醌和苯環(huán)之間轉(zhuǎn)換誘導(dǎo).在292 nm 處有一個(gè)明顯的吸收峰，且曲線1～11的紫外吸收峰值迅速增大，這是由于ABA 單體發(fā)生了快速的氧化還原反應(yīng)，ABA 聚合生成PABA，紫外光譜的峰值明顯增大.

圖1 ABA，PABA-HRP 復(fù)合物的紫外-可見吸收光譜圖

曲線1為ABA，曲線2～11為不同反應(yīng)時(shí)間的PABA/HRP 復(fù)合物

2.2 掃描電子顯微鏡(SEM)

利用SEM技術(shù)表征了MWCNTs 及MWCNTs-PABA 修飾電極的表面形貌.圖 (2A)為單一MWCNTs，其形狀為彎曲帶狀并相互交錯(cuò)盤結(jié).聚合物修飾后，帶狀直徑明顯增大，表明PABA 完全覆蓋到了MWCNTs 上，如圖(2B)所示.

圖2 MWCNTs 及MWCNTs-PABA的SEM 圖

2.3 MWCNTs-PABA的電化學(xué)表征

圖3是MWCNTs和MWCNTs-PABA 修飾電極在0.2 M H2SO4溶液中的循環(huán)伏安曲線.MWCNTs-PABA修飾的電極 (曲線b)含有兩對(duì)氧化還原峰，而MWCNTs 修飾電極沒有明顯的氧化還原峰(曲線a)，這是典型的聚苯胺的氧化還原峰，這表明ABA 已被成功固定在MWCNTs 上.

圖3 MWCNTs (a)和MWCNTs-PABA (b)修飾電極在0.2 M H2SO4 中的循環(huán)伏安曲線圖

2.4 修飾電極的電化學(xué)特性

圖4 MWCNTs (a)與MWCNTs-HRP-PABA (b)修飾電極在0.1 M PBS (N2 氛)中的循環(huán)伏安圖

修飾電極在0.1 M PBS 溶液中-0.6～0 V的電位范圍內(nèi)掃描得到的CVs (圖4).與MWCNTs 修飾電極相比，MWCNTs-HRP-PABA 修飾電極在-0.35 V 處出現(xiàn)了一對(duì)氧化還原峰(b)，這是HRP和底層電極之間發(fā)生直接電子轉(zhuǎn)移的結(jié)果.結(jié)果表明，HRP 已被成功地固定在納米復(fù)合材料上且電化學(xué)活性保存良好.

修飾電極電流響應(yīng)隨掃描速率的增大而迅速增大，但峰電位基本保持不變(圖5).峰電流Ipa和Ipc與掃速速率的平方根成線性關(guān)系，其回歸方程是:Ipc(μA)=3.0440+0.3773 v (mV·s-1) (R2=0.9983)和Ipc(μA) =-11.043-0.4252 v (mV·s-1) (R2=0.9985)，這表明電極表面發(fā)生的電化學(xué)反應(yīng)是受擴(kuò)散控制的可逆電化學(xué)過程.

圖5 MWCNTs-HRP-PABA 修飾電極在PBS 中在不同掃描速率時(shí)的循環(huán)伏安圖

圖6 MWCNTs-HRP-PABA 修飾電極在加入0 mM H2O2(曲線a)和0.5 mM H2O2 (曲線b)的循環(huán)伏安圖

過氧化氫生物傳感器在空白和含過氧化氫的PBS(pH 7.0)溶液中的循環(huán)伏安曲線如圖6.在空白的PBS 溶液中，在-0.25 V/-0.35 V 出現(xiàn)一對(duì)氧化還原峰，這歸屬于聚苯胺的氧化還原峰.加入過氧化氫后，這對(duì)氧化還原峰發(fā)生了明顯的變化，氧化峰明顯減小，而還原峰明顯增大，這是典型的催化行為.

2.5 實(shí)驗(yàn)參數(shù)優(yōu)化

pH條件優(yōu)化表明在pH 7條件下傳感器的響應(yīng)最大(如圖7A)，因此我們實(shí)驗(yàn)的條件選擇在pH 7的條件下進(jìn)行.另外我們也考察了電位對(duì)傳感器的響應(yīng)的影響，結(jié)果表明在-0.25 V 時(shí)可以得到最高的靈敏度(如圖7B).

圖7 pH值對(duì)H2O2 傳感器的影響(A)及響應(yīng)電流與外加電壓的關(guān)系(B)

2.6 過氧化氫生物傳感器的電流響應(yīng)

如圖8所示，在施加電壓為-0.25 V時(shí)，MWCNTs-HRP-PABA 修飾玻碳電極在加入不同濃度的過氧化氫時(shí)發(fā)生典型的安培電流響應(yīng).結(jié)果表明:過氧化氫在20 μM～1.21 mM之間生物傳感器的電流響應(yīng)與過氧化氫的濃度成線性關(guān)系，線性方程為:ΔI(μA) =-5.390 ×10-3+5.405 c(R2=0.9973)，檢測(cè)限為5 μM (S/N=3).隨著過氧化氫濃度的增加，通過電流逐漸增大，結(jié)果表明修飾電極上固定的酶保持了良好的生物活性.

圖8 MWCNTs－HRP－PABA 修飾電極對(duì)H2O2 響應(yīng)的I － t 曲線圖

2.7 重復(fù)性，穩(wěn)定性的干擾測(cè)定

為了考查傳感器的穩(wěn)定性，使用同批次購置的9支酶電極響應(yīng)相同量的H2O2，其響應(yīng)電流幾乎不變，展現(xiàn)了良好的制備和檢測(cè)重復(fù)性，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.8%.生物傳感器的長(zhǎng)期穩(wěn)定性是評(píng)價(jià)性能的重要參數(shù)，該修飾電極對(duì)H2O2的催化氧化穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，被保存在4℃環(huán)境2 周后，電流信號(hào)下降小于5.1%，表明該修飾電極具有良好的穩(wěn)定性.

3 結(jié)論

基于酶催化和硼酸特異性識(shí)別成功地制備了MWCNTs-HRP-PABA 復(fù)合材料，并建立了一種新穎的過氧化氫生物傳感器.相比已報(bào)道的過氧化氫生物傳感器而言，該傳感器表現(xiàn)出響應(yīng)快，靈敏度高，其檢測(cè)下限為5 M.筆者認(rèn)為主要有兩個(gè)原因所引起:第一，該復(fù)合物提高了酶的活性中心到電極表面更加便利的傳導(dǎo)路徑和提供了保持酶活性理想的微環(huán)境，特別是硼酸能可逆地與1，2-或1，3 鄰二醇化合物成鍵更是有利于保持酶的活性;第二，這種酶催化苯胺聚合的方法更有利于對(duì)H2O2催化，提高靈敏度.總之，這種酶催化合成的生物膜為發(fā)展一種高靈敏的電化學(xué)生物傳感器提供了一種可能.

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