文 婷，阮 潔，皮建輝，3，譚 娟，3

(1.懷化學院 生命科學系，湖南 懷化 418008;2.貴州師范大學 生命科學學院，貴州 貴陽 550001;3.懷化學院 民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點實驗室，湖南 懷化 418008)

活性氧(ROS)自由基是機體正常代謝過程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物，在生物體衰老與疾病以及正常的免疫、代謝與細胞信號傳導等過程中都有著重要的生理作用[1].當機體內(nèi)自由基過多時會造成DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)膜的破壞[2]，從而導致癌癥、動脈硬化、衰老和多種疾病[3，4]的發(fā)生，因此尋找能夠清除自由基的抗氧化劑，研究其抗氧化活性與機理顯得十分重要.鴨兒芹(Cryptotaenia japonica Hassk)別名三葉芹、鴨腳板，屬傘形科鴨兒芹屬多年生的藥食兩用草本植物，富含多種維生素、礦物質(zhì)及生物活性成分，通常生于海拔200～2 400 m的山地、山溝及林下較陰濕的地區(qū)，研究發(fā)現(xiàn)鴨兒芹具有抗氧化、抗癌癥、保肝護肝、降血脂等作用[5]，本項目通過筋骨草體外抗氧化作用研究，進一步探討筋骨草的保健功能.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

采集新鮮的鴨兒芹清洗干凈并放在陰涼處使其風干.將干燥的鴨兒芹植株粉碎過100目篩，取粉末40 g 用80℃蒸餾水800 mL 浸提3小時，重復三次.將浸提液過濾后旋轉蒸發(fā)濃縮，將濃縮液真空干燥得鴨兒芹水提取物粉末，密封于-20℃冰箱備用.

試驗動物為三月齡KM 小鼠，購自中南大學實驗動物中心，許可證號:SCXK (湘)2010-0001.小鼠禁食過夜后脫頸椎處死，迅速取出肝臟，置于預冷生理鹽水中沖洗后，冰上研磨制成5%組織勻漿.

DPPH (北京中生瑞泰);鄰二氮菲(天津恒興);自由基測試盒(南京建成);三氯乙酸、硫代巴比妥酸(上海宏瑞);其他試劑均為湖南化工研究所產(chǎn)品.

主要儀器:DU800 紫外P可見分光光度計(美國Beckman公司)、OSB-2000、DTC-21旋轉蒸發(fā)儀(美國)、FD-1C 冷凍真空干燥機 (北京德天佑公司)、FW177 材料粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)、恒溫水浴鍋(武漢琴臺醫(yī)療器械廠).

1.2 方法

1.2.1 鴨兒芹對DPPH 自由基的清除

分別配制濃度為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 mg/mL的鴨兒芹提取物樣品溶液1 mL，加入0.05 mg/mL DPPH 無水乙醇溶液2 mL，混合后避光靜置30 min，然后于517 nm 處測量吸光值(At)，同時測定等體積無水乙醇和對應梯度濃度樣品的混合液吸光值(Aj)、等體積無水乙醇和DPPH 溶液混合液的吸光值(Ai)和等體積無水乙醇的吸光值(A0)，計算DPPH·自由基清除率(%) =[1-(At-Aj)/(Ai-A0)]×100.

分別配制鴨兒芹提取物樣品梯度濃度為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 mg/mL，采用南京建成生物工程研究所的抗超氧陰離子自由基及產(chǎn)生超氧陰離子自由基測試盒檢測.試驗按照說明進行，采用蒸餾水作空白，計算O-2·自由基清除率 (%)=[(A0-At)/A0]×100.其中A0為對照管的吸光度，At為樣品管的吸光值.

1.2.3 鴨兒芹對·OH 自由基的清除

分別配制濃度為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 mg/mL的鴨兒芹提取物樣品溶液1 mL，加入0.15 mol/L 磷酸鹽緩沖液2.0 mL、0.75 mmol/L鄰二氮菲溶液1.0 mL、0.75 mmol/L 硫酸亞鐵溶液1.0 mL，最后加入2%過氧化氫1 mL，混勻后放置30 min.空白是以蒸餾水代替樣品溶液，對照組是以蒸餾水代樣品和硫酸亞鐵，于波長520 nm 處測吸光度值，計算·OH 自由基的清除率(%) =[(A0-At)/A0]×100.其中A0為對照管的吸光度，At為樣品管的吸光值.

1.2.4 鴨兒芹對小鼠肝臟自發(fā)性脂質(zhì)過氧化的抑制

分別配制濃度為0.5、1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5 mg/mL的鴨兒芹提取物樣品溶液0.5 mL (對照管用生理鹽水代替)，加入現(xiàn)制的5%肝臟組織勻漿1.5 mL，混勻后37℃水浴中震蕩溫育120 min后，再加入1.5 mL 20%三氯乙酸終止反應，3 500 rpm離心10 min，取上清液2.0 mL.各上清液加入1.5 mL 0.67%硫代巴比妥酸，95℃水浴15 min 顯色后取出冷卻至室溫，測定其在532 nm 處的吸光值，計算MDA生成抑制率(%) =[(A0-At)/A0]×100.其中A0為對照管的吸光度，At為樣品管的吸光值.

1.2.5 鴨兒芹對Fe2+-VitC 誘導肝臟線粒體氧化損傷的抑制

制備肝臟線粒體懸浮液[6].分別取濃度為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mg/mL的鴨兒芹提取物樣品溶液0.4 mL (空白管、對照管用生理鹽水代替)，向各樣品溶液中加入1.0 mL 線粒體懸浮液.其中樣品管、對照管同時再加入0.4 mL 硫酸亞鐵溶液(0.5 mmol/L)和0.4 mL VitC 溶液(0.5 mmol/L)，空白管加入0.8 mL 生理鹽水.振蕩混勻后于37℃溫育30 min，測其在520 nm 處吸光值，并計算線粒體腫脹度(%) =[(A0-At)/A0]×100%.其中A0、At分別是空白管和樣品管或對照管的吸光值.

2 結果

2.1 鴨兒芹對DPPH·自由基的清除作用

DPPH·是一種穩(wěn)定的自由基，其乙醇溶液呈深紫色并在517 nm 處有最大吸收峰.自由基清除劑可使其顏色變淺，所以可通過吸光值的降低來反映自由基清除劑樣品對DPPH·的清除能力.圖1顯示，鴨兒芹提取物對DPPH·自由基的清除作用具有明顯的量效關系，其IC50為5.48 mg/mL，且當提取物濃度達到9 mg/mL 時，其對DPPH·自由基的清除率達到最大85.4%.

圖1 鴨兒芹對DPPH·自由基的清除作用

2.2 鴨兒芹對·自由基的清除作用

2.3 鴨兒芹對·OH 自由基的清除作用

圖2 鴨兒芹對O -2·自由基的清除作用

·OH 自由基的氧化性質(zhì)十分活躍，對機體的生物膜等具有極強的破壞性，具有作用最強、毒性最大等特點.圖3顯示，鴨兒芹提取物對·OH 自由基的清除作用較強，一定濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)明顯的量效關系，其IC50為2.78 mg/mL，特別是在鴨兒芹提取物質(zhì)量濃度2.0～5.0 mg/mL之間，清除率增加極明顯，當鴨兒芹提取物質(zhì)量濃度為6 mg/mL，其對·OH 自由基的清除率達到最大94.2%.

圖3 鴨兒芹對·OH 自由基的清除作用

2.4 鴨兒芹對肝細胞膜自發(fā)脂質(zhì)過氧化的抑制作用

鴨兒芹提取物對小鼠肝臟自發(fā)脂質(zhì)過氧化反應的抑制作用如圖4，顯示一定濃度范圍內(nèi)，鴨兒芹提取物對小鼠肝臟自發(fā)脂質(zhì)過氧化的抑制作用呈現(xiàn)出明顯的量效關系，其IC50為2.86 mg/mL.當鴨兒芹提取物質(zhì)量濃度達到4.5 mg/mL 時，抑制率已接近最大抑制率86.8%.

圖4 鴨兒芹對肝細胞膜自發(fā)脂質(zhì)過氧化的抑制作用

2.5 鴨兒芹對Fe2+-VitC 誘導的肝臟線粒體氧化損傷的抑制作用

表1和圖5顯示，鴨兒芹提取物能抑制Fe2+-VitC 誘導肝線粒體氧化損傷.隨著鴨兒芹提取物質(zhì)量濃度的增加，反應體系的吸光值OD520nm遞增，線粒體氧化損傷所致腫脹度明顯下降，并呈現(xiàn)顯著的量效關系.當鴨兒芹提取物質(zhì)量濃度達到5.0 mg/mL 時，鴨兒芹提取物抗小鼠肝臟線粒體氧化損傷接近最佳效果

圖5 鴨兒芹對Fe2+-VitC 誘導的肝臟線粒體氧化損傷的抑制作用

3 討論

自由基是游離存在的具有非偶電子的基團或原子，在體內(nèi)有很強的氧化反應能力，易對蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等產(chǎn)生傷害，從而引起機體損傷[7].人類食物中有多種抗氧化物質(zhì)，它們能夠清除自由基，并能以消除過氧化氫、清除超氧陰離子和單態(tài)氧的方式抑制自由基的形成[8].鴨兒芹含有豐富的揮發(fā)性成分與其他生物活性物質(zhì)[9]，本研究結果表明鴨兒芹提取物對DPPH·、·、·OH 這3種自由基均表現(xiàn)出顯著的清除效果，其最大清除率分別達到85.4%、82.4%和94.2%，其IC50分別為5.48、4.23和2.78 mg/mL，表明鴨兒芹提取物具有較強的清除自由基的活性功能，特別是對·OH的清除能力尤為突出.

生物膜的完整性是細胞維持正常生理功能的必要條件，然而生物膜脂質(zhì)過氧化作用能氧化分解膜中多元不飽和脂肪酸而產(chǎn)生MDA，從而使膜的通透性增大，影響膜的正常生理功能[10-11].本研究結果表明，鴨兒芹提取物能明顯抑制體外生物膜脂質(zhì)過氧化作用，在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)明顯的量效關系.鴨兒芹提取物的對生物膜脂質(zhì)過氧化反應的抑制作用不但表現(xiàn)在生物膜的自發(fā)性脂質(zhì)過氧化，而且還表現(xiàn)在由Fe2+-VitC誘導的肝臟線粒體膜的脂質(zhì)過氧化，表明鴨兒芹提取物對生物膜的脂質(zhì)過氧化具有廣泛的抑制作用.

通過鴨兒芹提取物的體外抗氧化作用研究，表明鴨兒芹是一種良好的天然抗氧化劑的優(yōu)勢資源，也為進一步研究其體內(nèi)生理活性提供了理論基礎.

[1]ìlhami Gücιn，Münιr Oktay，Ekrem kirecci，et al.Screening of antioxidant and antimicrobial activities of anise(Pimpinella anisum L.) seed extracts[J].Food Chem.，2003 (83):371-382.

[2]Devasagayam TPA.Free Radicals and Antioxidants inHuman Health Foreword[J].Indian J Biochem Bio，2009 (46):5.

[3]Dong FL，Xia GY，Xiong ZK.Antioxidative activity of Ganoderma lucidum polysaccharide[J].J Tradit Med Information，2010，2 (2):24-24.

[4]張志軍，李淑芳，魏雪生，等.靈芝多糖體外抗氧化活性的研究[J].化學與生物工程，2011，28 (3):63-66.

[5]焦維麗，趙兵，高昂，等.鴨兒芹藥學研究概況[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2011，39 (34):20996-20997.

[6]李靜娟，劉雨生，童先宏.酶檢測法在線粒體功能及混雜程度評價中的應用[J].臨床輸血與檢驗，2004，6(3):167-168.

[7]李勇，孔令青，高洪，等.自由基與疾病研究進展[J].動物醫(yī)學進展，2008，29 (4):85-88.

[8]Guptam，Mazumder UK，Gomathi P.In vitro antioxidant and free radical scavenging activities of Galega purpurea root[J].Pharmacognosy Magazine，2007，3 (12):219-223.

[9]李勝華，牛友芽.鴨兒芹的化學成分研究[J].中草藥，2012，43 (12):2365-2368.

[10]馮芹，夏文凱，王現(xiàn)珍，等.連翹苷元對四氯化碳大鼠急性肝損傷的保護作用[J].中國藥理學通報，2015，31 (3):426-430.

[11]羅慧英，黃亞紅，朱麗娟，等.藏藥蕨麻對實驗性酒精肝損傷小鼠的保護作用研究[J].中國臨床藥品理學與治療學，2014，19 (10):1107-1110.