陳 偉，徐衛(wèi)華

(1.廣東藥學院生命科學與生物制藥學院，廣東省生物技術候選藥物研究重點實驗室，廣州 510006;2.中山大學生命科學學院，有害生物控制與資源利用國家重點實驗室，廣州 510275)

Wnt/β-catenin 信號通路是進化上非常保守的發(fā)育相關信號通路，在胚胎發(fā)育過程中的細胞命運決定、細胞增殖、細胞極性、組織穩(wěn)態(tài)以及疾病的發(fā)生等方面都起著重要的作用(MacDonald et al.，2009;Clevers and Nusse，2012)。

β-catenin 是一個多功能蛋白，參與細胞骨架的構成。此外，它更廣為人所知的角色是其作為Wnt/β-catenin 信號通路的重要成員(Bienz，2005)。β-catenin 在Wnt/β-catenin 信號通路中的作用最早源于果蠅Drosophila melanogaster 的研究。1991年，Peifer 等發(fā)現(xiàn)果蠅的armadillo 基因(β-catenin 同源基因)參與Wnt/β-catenin 信號通路(Peifer et al.，1991)。研究表明，armadillo基因和wingless 基因?qū)壟咛グl(fā)育的影響非常相似，減少armadillo 基因的表達與降低wingless 基因表達所產(chǎn)生的表型一致，它們均參與調(diào)節(jié)成蟲盤模式的正確形成。隨著對Wnt/β-catenin 信號通路的深入研究，發(fā)現(xiàn)β-catenin 是該信號通路中的核心成員:細胞質(zhì)中存在一個降解復合物，可以通過一系列的翻譯后修飾降解β-catenin 蛋白，使得Wnt/β-catenin 信號通路處于失活的狀態(tài);當存在特定的Wnt 配體時，降解復合物受到破壞，β-catenin 在細胞質(zhì)中累積后進入細胞核并與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF 結(jié)合，最終激活下游靶標基因的轉(zhuǎn)錄(MacDonald et al.，2009;Clevers and Nusse，2012)。研究表明，β-catenin 在進化上高度保守，例如果蠅和小鼠Mus musculus 的β-catenin 蛋白的同源性高于80%(Schneider et al.，2003)。

昆蟲滯育是昆蟲適應外界不利環(huán)境因素的重要對策之一。棉鈴蟲Helicoverpa armigera 是一種蛹滯育昆蟲，滯育棉鈴蟲的蛹期長達數(shù)月，而正常發(fā)育棉鈴蟲的蛹期不到一個月。在前期工作中，我們已克隆了棉鈴蟲的β-catenin 基因(陳偉和徐衛(wèi)華，2015)，并從核酸水平調(diào)查發(fā)現(xiàn)滯育和發(fā)育蛹腦中β-catenin 基因的表達存在差異。為了便于從蛋白水平調(diào)查β-catenin 以及整個Wnt/β-catenin 信號通路在棉鈴蟲滯育中的作用，有必要制備抗棉鈴蟲β-catenin 蛋白的抗體。

本研究以此為出發(fā)點，對β-catenin 的部分肽段進行原核表達，制備多克隆抗體，檢驗了抗體的效價和特異性，并通過Western blot 技術初步調(diào)查了β-catenin 在滯育和發(fā)育棉鈴蟲蛹腦中的表達差異。

1 材料與方法

1.1 實驗昆蟲

棉鈴蟲為本課題組所飼養(yǎng)。組織材料的收集與保存:將化蛹后的棉鈴蟲置于冰冷的鹽水(0.75% NaCl)溶液中，在解剖鏡下解剖組織，臨時存放在冰冷的鹽水中。解剖結(jié)束后于4℃，5000 g 離心1 min 收集組織，棄去上清，將組織存放在-80℃。

1.2 菌株、載體、細胞和試劑

大腸桿菌 Escherichia coli DH5α 及 BL21(DE3)、pET32a 載體均為本實驗室保存;Taq DNA polymerase、DNA 連接試劑盒及限制性核酸內(nèi)切酶購自Takara 公司;質(zhì)粒DNA 小量提取試劑盒、DNA 產(chǎn)物純化試劑盒、DNA marker 均購自愛思進生物技術有限公司;Ni-NTA 瓊脂糖柱填料購自Qiagen 公司;蛋白Marker、HRP 偶聯(lián)的羊抗兔二抗以及Western blot 所用發(fā)光液均購自Thermo公司;Alexa Fluor 488 標記的羊抗兔二抗購自Invitrogen 公司;弗氏佐劑購自Sigma 公司;引物合成及測序由濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司完成。其它試劑均為分析純(A.R.)。

1.3 原核表達載體pET 32a-catenin 的構建

根據(jù)Har-β-catenin 的cDNA 序列，設計兩端分別含有NcoI 和BamHI 酶切位點的特異性引物，擬擴增一段編碼300個氨基酸殘基序列。正向引物序列為:5'-CATGCCATGGCTGAAGATGACG AAATGGAGG-3';反向引物序列為:5'-AAGGATCCGCTGGAGCATACTGACAGC-3'，其中下劃線表示酶切位點。以棉鈴蟲蛹腦cDNA 為模板，PCR 擴增出目的片段并回收后用NcoI 和BamHI 進行雙酶切，與同樣經(jīng)過雙酶切的pET32a載體進行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。挑選克隆，經(jīng)菌落PCR 鑒定正確后送交測序驗證。

1.4 真核表達載體pIZ-β-catenin 的構建

為了構建不含任何標簽的Har-β-catenin 真核表達載體，我們設計了一對引物。正向引物帶BamHI 酶切位點，為了增強達標效率，引物中設計了Kozak 序列，具體序列為5'-ACGGATCCG CTATGGACAGCTACCAGATACCATCGTC-3'，下劃線表示BamHI 酶切位點。反向引物帶XbaI 酶切位點，引物中包含終止密碼子TAG，序列為5'-AGTCTAGACTAGAGATCGGTGTCGTACCAAG-3'，

下劃線表示XbaI 酶切位點。PCR 擴增β-catenin編碼區(qū)全長，用BamHI 和XbaI 對擴增產(chǎn)物進行雙酶切后，與同樣雙酶切的pIZ/v5 載體進行連接。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，鑒定后進行測序確認。

1.5 融合蛋白的誘導表達

提取鑒定正確的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。挑選單菌落，在含氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)液中37℃過夜培養(yǎng)。次日，按1∶100 轉(zhuǎn)接至新的5 mL LB 培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)直O(jiān)D600nm約0.6時，加入終濃度為1 mM 的IPTG，20℃分別培養(yǎng)3、6、9 h 后取150 μL 菌液，離心收集。加入20 μL 上樣緩沖液，煮沸5-10 min，SDS-PAGE 檢測蛋白的表達。

1.6 融合蛋白的大量表達及純化

按照1.4 的方法，培養(yǎng)800 mL 細菌，進行大規(guī)模誘導。離心收集細菌后，用50 mL 結(jié)合緩沖液(20 mM Na3PO4，500 mM NaCl，pH7.8)重懸細菌。冰浴超聲破碎(超聲2 s，停2 s，總共20 min)后離心。分別取10 μL 上清和挑取一點不溶的包涵體進行SDS-PAGE，確定融合蛋白是在上清表達還是包涵體表達。目的蛋白在包涵體表達則用50 mL 尿素結(jié)合緩沖液(20 mM Na3PO4，500 mM NaCl，8 M 尿素，pH 7.8)溶解包涵體;目的蛋白表達在上清則直接進行后續(xù)純化實驗。

上柱純化前，用含20 mM 咪唑的緩沖液平衡鎳柱。然后先后用含75 mM 和300 mM 咪唑的緩沖液進行梯度洗脫，收集洗脫液，進行SDS-PAGE檢測。

1.7 多克隆抗體的制備

用純化的蛋白免疫新西蘭雄兔，制備多克隆抗體。首次免疫時，取1 mg 純化蛋白與等體積的弗氏完全佐劑混勻，充分乳化后皮下多點注射。此后每兩周加強免疫1 次，抗原與弗氏不完全佐劑乳化后注射。免疫4 次后，取血，收集血清。

1.8 ELISA(酶聯(lián)免疫吸附法)檢測抗體效價

在酶標板的每孔加入2 pmol 純化的蛋白進行包被，4℃過夜。棄去包被液，用PBST(1×PBS中加入0.5%的TWEEN-20)洗板3 次。每孔加入200 μL 含2%脫脂奶粉的PBST，37°C 封閉1 h。然后依次加入100 μL 一定比例稀釋的抗血清，1∶3000 稀釋的二抗。洗板后加入100 μL 新配的DAB 顯色液于37°C 顯色，最后用H2SO4終止反應。

1.9 Western blot 檢測

收集細胞，或在解剖鏡下解刨獲取棉鈴蟲的腦組織，仔細除凈附著在腦上的脂肪體，滯育和發(fā)育蛹腦表達分析所用的材料分別為棉鈴蟲化蛹后10 d 的滯育蛹腦(DP10)和發(fā)育蛹腦(NP10)。取約106個細胞，加入100 μL Ripa 試劑(50 mM Tris-HCl(pH 7.4)，150 mM NaCl，1% NP-40)重懸細胞，4℃搖動1 h;或取20個腦，加入300 μL Ripa 試劑電動勻漿，4℃搖動 1 h。12000 rpm，20 min 離心收集上清。測定濃度后，取一定量的蛋白，SDS-PAGE 電泳后，將凝膠與甲醇活化的PVDF 膜浸泡在轉(zhuǎn)膜緩沖液(25 mM Tris，192 mM Glycine，20%甲醇)中，15 min 后轉(zhuǎn)膜(100 V，60 min)。5%脫脂奶粉(溶于PBST中)封閉后，分別用1∶8000 稀釋的一抗和1∶5000稀釋的二抗室溫孵育1 h。PBST 洗膜后ECL 淋洗，在暗房顯影曝光。

2 結(jié)果與分析

2.1 Har-β-catenin 部分肽段的誘導表達

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)后，經(jīng)1 mM 濃度的IPTG 在20℃誘導后，SDS-PAGE 結(jié)果顯示在約54 kDa 處有一條明顯的蛋白條帶，其大小與預期相符，而空載體轉(zhuǎn)化菌均未出現(xiàn)同樣的條帶。同樣的細菌經(jīng)37℃誘導后，在54 kDa 處有一條很弱的條帶，說明20℃比較適合該重組蛋白的表達。

圖1 Har-β-catenin 部分片段的原核表達Fig.1 Expression of partial Har-β-catenin peptide in E.coli

2.2 Har-β-catenin 部分肽段的純化

大規(guī)模誘導后電泳結(jié)果表明重組蛋白主要表達在包涵體。pET-32a 載體攜帶有His 標簽，重組蛋白適合用鎳柱進行純化(莉孟等，1999;王朝陽等，2004)。用尿素結(jié)合緩沖液溶解包涵體后，上鎳柱進行純化，期間用雙波長紫外記錄儀實時監(jiān)測。結(jié)果用300 mM 咪唑進行洗脫時，檢測到一個明顯的吸收峰(圖2A)。洗脫樣進行SDS-PAGE 分析，結(jié)果如圖2B，300 mM 咪唑洗脫出較純的重組蛋白，Image J 軟件分析表明，其純度約85%。

圖2 Har-β-catenin 部分肽段的純化Fig.2 Purification of partial Har-β-catenin peptide

2.3 抗體效價檢測

制備抗體后，用ELISA 方法測定抗體效價。對抗體進行倍比稀釋，與2 pmol 的抗原孵育后顯示，抗體的效價較高:1∶256000 稀釋的抗體也能呈現(xiàn)出明顯的顏色反應(圖3)。而免疫前血清與抗原孵育后無顏色反應。

圖3 Har-β-catenin 抗體的效價檢測Fig.3 Titer of anti-β-catenin antibody detected by ELISA

2.4 抗體特異性檢測

對于制備的抗體，接著采用Western blot 的方法檢測抗體的特異性。如圖4 所示，棉鈴蟲蛹腦蛋白與Har-β-catenin 孵育后，暗示曝光顯影，在約80-90 kDa 處有兩條蛋白帶，此外再無其它雜帶。

圖4 抗Har-β-catenin 多克隆抗體的Western blot 分析Fig.4 Western blot analysis of the polyclonal antibody of Har-β-catenin

為了鑒定哪一條是蛹腦中Har-β-catenin 蛋白，構建了不表達任何標簽蛋白的Har-β-catenin 真核表達載體。如圖5A 所示，分別用BamHI、XbaI 單酶切以及BamHI 和XbaI 雙酶切均均獲出現(xiàn)了預期大小大條帶(pIZ/V5 載體大小為2876 bp，Har-β-catenin 的ORF 為2382 bp)。轉(zhuǎn)染48 h 后檢測，結(jié)果如圖5B 所示:與對照相比，取5 μg 蛋白進行Western blot，靠上的條帶亮度明顯增強，而靠下的條帶亮度基本無變化，這說明靠上的條帶是Har-β-catenin 蛋白條帶?？傮w來講，制備的Har-β-catenin 特異性很好，雜帶少，基本無背景。

圖5 過表達確定Har-β-catenin 蛋白條帶Fig.5 Protein band of Har-β-catenin determined by overexpression

2.4 Har-β-catenin 在滯育和發(fā)育蛹腦中的表達分析

前期從轉(zhuǎn)錄水平調(diào)查發(fā)現(xiàn)，非滯育蛹腦中Har-β-catenin 的表達量明顯高于滯育蛹腦。制備好抗體后，為了從蛋白層面驗證這個結(jié)果，初步調(diào)查了Har-β-catenin 在棉鈴蟲滯育和發(fā)育蛹腦中的表達情況。滯育條件下培養(yǎng)的棉鈴蟲，化蛹10 d 后滯育狀態(tài)較為穩(wěn)定(Bao and Xu，2011)。選用化蛹后10 d 的滯育蛹腦(DP10)和發(fā)育蛹腦(NP10)進行比較，如圖6 所示，發(fā)育蛹腦中Har-β-catenin明顯高于滯育蛹腦，而內(nèi)參對照Actin 基本一致，這與以前的結(jié)果吻合。

圖6 Western blot 檢測棉鈴蟲滯育和發(fā)育10 d 蛹腦中β-catenin 表達水平Fig.6 Expression levels of β-catenin in DP10and NP10determined by Western blot

3 結(jié)論與討論

Wnt/β-catenin 信號通路是一條重要的生長發(fā)育相關的信號通路，在胚胎發(fā)育和疾病發(fā)生方面起重要的調(diào)節(jié)作用，其在進化上極其保守(Logan and Nusse，2004)。

β-catenin 在Wnt/β-catenin 信號通路中起著重要的作用(Song et al.，2003):當存在特定的Wnt 配體時，“自由”β-catenin 增多并進入細胞核，作為共轉(zhuǎn)錄激活因子與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF 結(jié)合，從而激活下游基因的轉(zhuǎn)錄(Song et al.，2003;Varea et al.，2009)。鑒于β-catenin 在Wnt/β-catenin 信號通路中的重要作用及其進化上的保守性，對β-catenin 進行研究可以大致推斷整個信號通路是否在某個生理過程中起作用。許多科研工作者將β-catenin 作為研究Wnt/β-catenin 信號通路的重要指標(Moon et al.，2002;Dhawan and Gopinathan，2004)。

然而，β-catenin 相關的研究雖然在模式生物-果蠅中有較多的報道，在其它昆蟲的功能研究卻甚少有報道，更未見從蛋白水平對其進行研究的報道。為了便于從蛋白水研究β-catenin 及Wnt/β-catenin 信號通路在棉鈴蟲滯育中的作用，本研究制備了棉鈴蟲β-catenin 的抗體并初步調(diào)查了滯育和發(fā)育蛹腦中β-catenin 的表達情況。

β-catenin 蛋白主要在包涵體表達，經(jīng)過鎳柱上樣，咪唑梯度洗脫后，純化后重組蛋白約占總蛋白的85%。雖然還含有少部分菌體蛋白，但不影響多克隆抗體的制備(陳易斐等，2011)。制備的棉鈴蟲β-catenin 抗體，在1∶8000 稀釋的情況下，Western blot 在蛹腦中僅檢測出兩條比較靠近的條帶，而且基本無背景。后續(xù)的β-catenin 過表達實驗證明，其中一條靠上的條帶就是棉鈴蟲的β-catenin 蛋白。這些結(jié)果說明，制備的β-catenin 抗體靈敏度高，特異性好，這為后續(xù)實驗的可靠性打下了良好的基礎。

用制備的β-catenin 抗體初步調(diào)查滯育和發(fā)育蛹腦中β-catenin 蛋白的表達情況，結(jié)果表明滯育蛹腦中β-catenin 蛋白水平明顯低于發(fā)育蛹腦，這與我們前期從核酸水平調(diào)查的β-catenin 差異吻合，進一步證明了制備的抗體的可靠性。

需要指出的是，用β-catenin 抗體進行Western blot 檢測出的另一條非特異條帶與β-catenin 似乎具備相同的表達模式:在滯育蛹中表達低于發(fā)育蛹腦，這應該是該蛋白自身的表達特點，而非蛋白上樣有誤導致的問題，因為內(nèi)參蛋白Actin 基本無差異。但該蛋白是何蛋白，其與β-catenin 是否有關系等問題還需后續(xù)做進一步調(diào)查。另外，調(diào)查的是β-catenin 總蛋白，實際上β-catenin 除了在Wnt/β-catenin 信號通路中起作用外，還參與細胞骨架的構成(Huber and Weis，2001)，因此若要準確反映Wnt/β-catenin 信號通路中β-catenin 的表達情況，還需要進一步調(diào)查核蛋白中β-catenin 表達，或者選用特異性識別“自由”β-catenin 的抗體。

總體來講，β-catenin 多克隆抗體的成功制備，不僅可以為深入研究β-catenin 以及Wnt/βcatenin 信號通路在棉鈴蟲發(fā)育中的作用奠定了基礎。同時，由于β-catenin 在進化上的高度的保守性(Moon et al.，2002)，不同物種的β-catenin蛋白同源性很高，因此制備的β-catenin 抗體也有望應用于其它昆蟲相應的研究。

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