姚力芬1 李 丹1 陳麗華2 李廣彬1 孫盼盼1 李佳釀3

（1．西北民族大學(xué) 化工學(xué)院，甘肅 蘭州，730030；2．西北民族大學(xué) 實(shí)驗(yàn)中心，甘肅 蘭州，730030；3．西北民族大學(xué) 電氣工程學(xué)院，甘肅 蘭州，730030）

近年來(lái)，石油污染的環(huán)境污染問(wèn)題已越來(lái)越引起人們的廣泛關(guān)注，在治理石油污染的方法中，生物修復(fù)法因其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)受到廣泛關(guān)注[1]。篩選出高效降解石油烴降解菌是生物修復(fù)的必然，目前有關(guān)石油降解菌方面的研究報(bào)道較多[2-3]。本文從甘肅隴東長(zhǎng)慶油田中取得含油污泥，從中分離篩選得到六株降解石油烴菌株，并將其制得混合菌劑，同時(shí)進(jìn)行了混合菌劑處理含油污泥的小試實(shí)驗(yàn)，為以后的實(shí)際應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 含油污泥

試驗(yàn)所用油泥采自甘肅隴東油區(qū)。油泥的TPH含量為50g/kg，含水率為25%，pH為7.82。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 菌株分離

根據(jù)雒曉芳[4]等人的分離方法，取土樣2.5g，加入到有200mL無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的三角瓶中，在30℃，120r/min的恒溫?fù)u床上進(jìn)行振蕩培養(yǎng)7d，移取一定量的富集培養(yǎng)液接入新鮮降油培養(yǎng)基中，在相同條件下培養(yǎng)7d，相同操作共重復(fù)3次，經(jīng)過(guò)3個(gè)周期的馴化后，在無(wú)菌條件下，用接種環(huán)蘸取馴化培養(yǎng)液，在降油培養(yǎng)基的平板上劃線后，平板倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～72h，然后將代表性較好的菌落在降油培養(yǎng)基平板上反復(fù)劃線純化得到單一菌落，再將純化的菌株接種至斜面保存培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，保存于4℃冰箱中，待用。

2.2 菌株的鑒定

（1）常規(guī)鑒定：參照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》[5]，對(duì)篩選得到的六株菌株進(jìn)行了菌落特征及菌體形態(tài)特征觀察。

（2）生理生化鑒定：參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[6]首先將篩選出來(lái)的六株菌進(jìn)行復(fù)活，在無(wú)菌條件下，分別各挑取少量菌加入生化管中，密封，放入35℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后觀察現(xiàn)象，平行做兩組實(shí)驗(yàn)。

2.3 混合菌劑的發(fā)酵

2.3.1 菌劑的復(fù)活

將營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基配制好后，分裝于試管中，每支試管約4-5mL，后將所有所需儀器高壓滅菌，滅菌條件：121℃，20min，50℃保存。隨后在超凈臺(tái)上進(jìn)行接種，接種完后在恒溫培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24h，保存進(jìn)行下一步工作。

2.3.2 一次擴(kuò)培

將營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基配制好后，分裝于三角瓶中，每個(gè)三角瓶約10mL，后將所有所需儀器高壓滅菌，滅菌條件：121℃，20min，50℃保存。隨后在超凈臺(tái)上進(jìn)行接種，接種完后在恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24h，保存進(jìn)行下一步工作。

2.3.3 發(fā)酵

做好發(fā)酵罐的滅菌工作，然后進(jìn)行接種，即倒入由a1、a2、a3、a4、a5、a6這六株菌（前三株所占體積百分?jǐn)?shù)為50%，后三株為50%）按體積比為1:1:1:1:1:1配成菌懸液。

2.4 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

按照文獻(xiàn)[5]，對(duì)于在發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵的混合菌劑，每三小時(shí)取樣一次，冷卻后放入冰箱，48h后統(tǒng)一用752型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定其OD值。

2.5 TPH降解率的測(cè)定

根據(jù)參考文獻(xiàn)[7]，土壤中石油類物質(zhì)的測(cè)定采用紫外分光光度法。采用索式提取法提取土壤中石油類物質(zhì)，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)出相對(duì)應(yīng)的吸光度，計(jì)算每千克干土中石油類物質(zhì)含量，進(jìn)而計(jì)算出石油類物質(zhì)降解率 w：

其中w1： 為第1天土壤中石油類物質(zhì)含量，mg/kg；mi為第i天土壤中石油類物質(zhì)含量，mg/kg。紫外分光光度法測(cè)得原油的標(biāo)準(zhǔn)方程為：

其中：相關(guān)系數(shù)R2為0.5591。

為方便計(jì)算，將其轉(zhuǎn)變?yōu)?50 mL樣品中所含的石油類總量和吸光度之間的關(guān)系式為：

其中：D為用250mL石油醚萃取含油土樣得到萃取液的有效吸光度，無(wú)量綱；M為樣品所含石油類污染物總量，mg。

2.6 微生物計(jì)數(shù)法

根據(jù)參考文獻(xiàn)[8]土壤中微生物數(shù)量測(cè)定采用平板菌落計(jì)數(shù)法。

2.7 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)的調(diào)節(jié)劑選擇的是容易取材的玉米秸稈，玉米秸稈提前粉碎備用，有機(jī)肥選用的是風(fēng)干牛糞（C/N比為26，速效氮含量為1.7%），并按照油泥（濕重）與玉米秸稈的比例為98：2，油泥（濕重）與有機(jī)肥的比例為3：80的，含水率為50%來(lái)混合材料。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)兩個(gè)處理，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，兩個(gè)處理均在室內(nèi)同一條件下進(jìn)行，底層鋪上防滲塑料布，將所有物料倒在塑料布上，攪拌均勻，堆置起來(lái)。同時(shí)在兩個(gè)堆體里加入發(fā)酵菌劑。上面覆蓋塑料薄膜，以保溫和保濕。中間插入通氣管，通氣管上每隔10cm打一個(gè)直徑為1cm的孔，通氣管外接通風(fēng)設(shè)備，以在發(fā)酵過(guò)程中控制氧含量。在堆體上分別設(shè)置四個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)，測(cè)量堆體溫度，并動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)堆肥過(guò)程中堆體的PH、溫度等。當(dāng)堆體的溫度經(jīng)歷了升溫，高溫，降溫三個(gè)階段，并在溫度降低至40℃左右時(shí)，向?qū)嶒?yàn)組堆體里按照5%的比例加入混合降油菌劑，25天時(shí)補(bǔ)加一次降油菌劑。對(duì)照組不添加菌劑。每7天采樣，測(cè)定實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組微生物數(shù)量、脫氫酶活性及降油率的變化。

3 結(jié)果與討論

3.1 菌株的鑒定

3.1.1 常規(guī)鑒定

對(duì)篩選得到的六株菌株進(jìn)行了菌落特征及菌體形態(tài)特征觀察，以下是各菌株的革蘭氏染色和簡(jiǎn)單染色的效果圖示。

鏡檢結(jié)果如下圖1及表1所示：

表1 菌落的形狀、質(zhì)地、顏色及形態(tài)

3.1.2 生理生化測(cè)試

首先將篩選出來(lái)的六株菌進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表2所示。

表2 生理生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果

符號(hào)說(shuō)明：“+”表示該項(xiàng)反應(yīng)結(jié)果為陽(yáng)性；“-”表示該項(xiàng)反應(yīng)結(jié)果為陰性。

3.1.3 菌種鑒定結(jié)果

根據(jù)鏡檢和生理生化試驗(yàn)結(jié)果對(duì)照，得到以下結(jié)果如表3所示。

表3 常規(guī)鑒定實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2 混合菌劑生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

根據(jù)圖2可知，混合菌在發(fā)酵開(kāi)始時(shí)由于剛剛進(jìn)入新的環(huán)境，開(kāi)始時(shí)的0~3h菌體處于生長(zhǎng)遲緩期，3~21h時(shí)間段內(nèi)菌體迅速生長(zhǎng)，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，21h時(shí)菌體吸光度值達(dá)到最大值為。21h后菌體生長(zhǎng)趨勢(shì)開(kāi)始進(jìn)入穩(wěn)定期，所以發(fā)酵菌劑時(shí)間選定為24h。

圖2 混合菌劑生長(zhǎng)曲線

3.3 微生物數(shù)量與TPH降解率的變化關(guān)系

控制其他影響條件基本相同，如溫度、酸度、堿度、電導(dǎo)率、C/N、堆體的通氣情況，均在微生物的最適范圍子內(nèi)。在不考慮其他變量的情況下，以是否加入石油烴降解菌劑作為唯一變量，討論對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組微生物數(shù)量與降解幅度的關(guān)系。

由圖3可知，微生物的數(shù)量與降解幅度在總體上基本呈相關(guān)關(guān)系，因微生物數(shù)量較多時(shí)，石油烴類化合物被大量分解，降解幅度較大。堆肥0天時(shí)，在實(shí)驗(yàn)組加入發(fā)酵菌劑和石油烴復(fù)合降解菌劑。此時(shí)，堆體的細(xì)菌數(shù)較多（約155×107個(gè)/g），微生物處于遲滯期，開(kāi)始適應(yīng)環(huán)境，不能適應(yīng)環(huán)境的微生物會(huì)死亡，數(shù)量稍有降低。適應(yīng)環(huán)境的微生物開(kāi)始利用堆體中的有機(jī)物合成自身的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，遲滯末期，細(xì)胞個(gè)體變大，開(kāi)始分裂。此時(shí)，細(xì)菌數(shù)雖稍有下降，但微生物數(shù)量仍較高，微生物利用石油作為能源進(jìn)行新陳代謝，堆體中的石油烴類化合物被分解，降解幅度較大（約12%）。從第5天到第17天，微生物數(shù)量增長(zhǎng)較快，達(dá)到最大340*107個(gè)/g，此時(shí)，微生物處于對(duì)數(shù)期，細(xì)菌利用堆體中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)合成細(xì)胞結(jié)構(gòu)大量繁殖，分解堆體中復(fù)雜有機(jī)物為較簡(jiǎn)單的有機(jī)物。因堆體為牛糞，纖維素含量較高，有機(jī)質(zhì)含量較低，一次發(fā)酵菌劑主要是分解纖維素為較簡(jiǎn)單的糖類，利于降油菌劑分解。此時(shí)，堆體中的石油烴類化合物被微生物大量分解，降解幅度達(dá)到最大（35%左右）。

圖3 微生物數(shù)量與TPH降解率的關(guān)系

從第17天到24天，細(xì)菌數(shù)量開(kāi)始下降，細(xì)菌開(kāi)始進(jìn)入穩(wěn)定期，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)稱為主要的限制因素。此時(shí)，能被一次發(fā)酵菌劑降解的纖維素已基本被分解，其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量也較低，細(xì)菌所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不夠，停止生長(zhǎng)分裂，細(xì)胞內(nèi)的有害代謝產(chǎn)物開(kāi)始積累；當(dāng)進(jìn)入衰亡期時(shí)，細(xì)菌所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)已消耗殆盡，細(xì)菌開(kāi)始進(jìn)入內(nèi)源消耗，細(xì)胞內(nèi)的有害代謝產(chǎn)物大量積累，影響細(xì)菌的生理活動(dòng)，此時(shí)細(xì)菌開(kāi)始死亡，微生物數(shù)量下降達(dá)到最低（約150×107個(gè)/g）。當(dāng)微生物數(shù)量下降時(shí)，細(xì)菌的降解幅度開(kāi)始下降，微生物數(shù)量達(dá)到最低時(shí)，降解幅度為負(fù)（約-12%），說(shuō)明含油量相比上次增加，當(dāng)微生物死亡時(shí)，部分石油烴類殘存在微生物殘?bào)w內(nèi)，并未被分解，或是細(xì)菌的代謝物中含有短鏈的脂肪烴類物質(zhì)，所以含油量增高，降解幅度為負(fù)。

從37天開(kāi)始，對(duì)照組加入二次降解菌劑（六株高效降解石油烴類的復(fù)合菌劑），微生物數(shù)量又開(kāi)始大幅度增加（達(dá)到400*107個(gè)/g），大量利用石油烴類化合物合成細(xì)胞自身結(jié)構(gòu)，降解幅度達(dá)到隨之增加（達(dá)到18%）。此后，微生物數(shù)量開(kāi)始逐漸降低趨于穩(wěn)定，并逐步接近土壤本底值，降解幅度也趨于穩(wěn)定。

對(duì)照組采用未加入降解菌劑的含油污泥和牛糞的堆肥實(shí)驗(yàn)，控制所有變量與實(shí)驗(yàn)組保持相同，由圖3可知，在堆體開(kāi)始發(fā)酵時(shí)，堆體內(nèi)的微生物也經(jīng)歷適應(yīng)期，對(duì)數(shù)期，穩(wěn)定期和衰亡期，數(shù)量稍有變化，但由于對(duì)牛糞中的纖維素利用率較低，造成營(yíng)養(yǎng)不足，難以大量降解石油烴類化合物，降解幅度幾乎不變（維持在4%左右）。

4 結(jié)論

本研究從被長(zhǎng)期被原油污染污染的土壤中分離篩選方法篩選出6種降油菌（a1~a6），并通過(guò)常規(guī)鑒定和生理生化試驗(yàn)，得到a1、a2、a3均為芽孢桿菌，a4、a6均為假單胞菌，a5為不動(dòng)桿菌。通過(guò)細(xì)菌的復(fù)活，一次擴(kuò)培，發(fā)酵操作，制得混合菌劑。

在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行微生物修復(fù)石油污染土壤的小試實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，當(dāng)土壤中石油含量為50g/kg時(shí)，加入混合菌劑的石油降解率比沒(méi)有加菌劑的降解效率高，添加5%菌劑81d的降解率為90.20%，均大于對(duì)照組（只添加有機(jī)肥）的降解率31.10%，說(shuō)明了該混合菌劑具有應(yīng)用于實(shí)際石油污染土壤生物修復(fù)的潛力。

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