李國(guó)攀 （長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州434025）

榮俊 （長(zhǎng)江大學(xué)生物醫(yī)藥研究所，湖北 荊州434025）

多殺性巴氏桿菌（Pasteurellamultocida，Pm）是一類屬于巴氏桿菌科巴氏桿菌屬的球桿狀或短桿狀細(xì)菌，革蘭氏染色呈陰性，可以引起家禽、豬、兔、羊、牛和人的感染發(fā)病，主要表現(xiàn)為禽霍亂、豬萎縮性鼻炎、牛出血性敗血癥、牛羊地方性流行性肺炎等［1～3］。目前防治巴氏桿菌病主要以抗生素為主，但是抗生素的過度使用，很容易在細(xì)菌中出現(xiàn)耐藥性，并且對(duì)生物體尤其是泌尿系統(tǒng)產(chǎn)生明顯的毒副作用［4］。疫苗免疫防治將是未來(lái)防控巴氏桿菌病的重要途徑，目前研發(fā)和使用的相關(guān)疫苗主要有：C48－1強(qiáng)毒株滅活疫苗［5］，莢膜、外膜蛋白、脂多糖及交叉保護(hù)性抗原因子類的亞單位疫苗［6～9］，具備治療作用的免疫復(fù)合物疫苗［9］，自然篩選或者人工培養(yǎng)弱化的減毒活疫苗［10，11］，異源弱毒多價(jià)活載體疫苗［12］。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，人們從分子水平進(jìn)行細(xì)菌部分基因改造，人工缺失某些毒力因子部分片段，使其毒力減弱，構(gòu)建弱毒活疫苗候選菌株，這是細(xì)菌弱毒活疫苗研究的新方向。巴氏桿菌Pm70（GenBank登錄號(hào)：NC—002663）和36950（GenBank登錄號(hào)：CP003022）的全基因組序列測(cè)定的完成，為深入地解析多殺性巴氏桿菌的遺傳演變、生理代謝及致病機(jī)制提供了分子基礎(chǔ)，同時(shí)為新型疫苗的設(shè)計(jì)和藥物靶標(biāo)的篩選提供依據(jù)。

同源重組技術(shù)是基因敲除的一種傳統(tǒng)技術(shù)，由于該技術(shù)的整合位點(diǎn)精確，交換頻率較高，而被廣泛應(yīng)用。微生物基因敲除的技術(shù)要點(diǎn)主要包括基因敲除同源重組載體的構(gòu)建；載體的轉(zhuǎn)化、同源重組的篩選、突變體的生理和分子生物學(xué)的鑒定等幾個(gè)方面。在微生物中打靶載體的導(dǎo)入通常用的是電穿孔的方法，但是影響電穿孔效率和篩選同源重組轉(zhuǎn)化子的因素較為復(fù)雜，不同的細(xì)菌、不同的DNA可能需要不同的方法。本研究以構(gòu)建的打靶質(zhì)粒pBluescript－F1KanRF2電轉(zhuǎn)化至多殺性巴氏桿菌R473為例，探討了最優(yōu)的電轉(zhuǎn)化方案和最合理的篩選方法。

1 材料與方法

1.1 菌種與質(zhì)粒

菌種為牛源多殺性巴氏桿菌R473，購(gòu)自中國(guó)獸藥藥品監(jiān)察所，血清型6：B；同源重組打靶質(zhì)粒pBluescript－F1KanRF2為長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動(dòng)物科研平臺(tái)構(gòu)建，其中，F(xiàn)1和F2為R473aroA基因的上下游同源臂，具有CmR和KanR2種抗生素篩選標(biāo)記。

1.2 主要試劑與儀器

Eppendorf Multiporator電穿孔儀、1mm電轉(zhuǎn)化杯、Quawell Q5000超微量紫外分光光度計(jì)、訊數(shù)抑菌圈（抗生素效價(jià)）測(cè)量?jī)x，美國(guó)BD（Becton Dickinson）公司的腦心浸出汁肉湯（BHI）培養(yǎng)基，血清、瓊脂粉、硫酸卡那霉素、TAKARA的DNA聚合酶。

1.3 引物

合成1對(duì)可特異性檢測(cè)多殺性巴氏桿菌的引物，擴(kuò)增產(chǎn)物大小約1300bp。PMP1：5’－TATAAAATTCAAAGTATATC－3’；PMP2：5’－CGCAGTCCACCCTTTTTTA－3’。合成1對(duì)可特異檢測(cè)KanR基因，大小550bp。pUC4KF：5’－GAC TCG TCC AAC ATC AAT AC－3’；pUC4KR：5’－AAT CAG GTG CGA CAA TCT－3’。

1.4 感受態(tài)的制備

將R473菌種劃線于BHI平板上，37°C培養(yǎng)24h，挑取單克隆接種到BHI液體培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)。將37℃過夜培養(yǎng)的種子液按1%的接種量接種到50mL BHI培養(yǎng)基中，于37℃振蕩培養(yǎng)（2h左右）至光密度D600nm為0.4～0.6，將菌液冰浴30min后，4℃離心（5000r／min×10min）收集菌體，用50mL預(yù)冷的10%無(wú)菌蔗糖清洗菌體2次，再用1mL預(yù)冷10%蔗糖10%甘油重懸并分裝于1.5mLEP管中（50μL／每管），－80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 不同電場(chǎng)強(qiáng)度下的電轉(zhuǎn)化

將電轉(zhuǎn)化儀的脈沖電壓分別設(shè)定為1.0、1.3、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.5kV幾個(gè)梯度，電脈沖維持時(shí)間為5ms，電脈沖次數(shù)為1。每次向50μL巴氏桿菌感受態(tài)細(xì)胞中加入3μg的質(zhì)粒pBluescript－F1KanRF2（約100ng／μL），終濃度為37.5μg／mL，混勻后冰上放置10min，轉(zhuǎn)入冰浴的1mm電轉(zhuǎn)化杯中，進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，電擊后的細(xì)胞立即加入1mL預(yù)熱的BHI培養(yǎng)液，37℃、200 r／min復(fù)蘇2h，將細(xì)菌離心濃縮后涂布于BHI（50μg／mL Kan，5%血清）平板，37℃培養(yǎng)24～48h后，用訊數(shù)抑菌圈（抗生素效價(jià)）測(cè)量?jī)x計(jì)算克隆數(shù)，并隨機(jī)挑取單克隆進(jìn)行PCR驗(yàn)證。

1.6 不同DNA濃度下的電轉(zhuǎn)化

將電壓設(shè)定為1.9kV，電脈沖時(shí)間5ms，脈沖次數(shù)1次，在50μL巴氏桿菌感受態(tài)細(xì)胞中分別加入0.5、1、2、3、4μg的質(zhì)粒pBluescript－F1KanRF2，使質(zhì)粒 DNA 的終濃度分別為9.1、16.7、28.6、37.5、44.4μg／mL，進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。用BHI（50μg／mL Kan，5%血清）平板進(jìn)行篩選，用訊數(shù)抑菌圈（抗生素效價(jià)）測(cè)量?jī)x計(jì)算克隆數(shù)，并隨機(jī)挑取單克隆進(jìn)行PCR驗(yàn)證。

1.7 不同營(yíng)養(yǎng)條件下的電轉(zhuǎn)化

將電壓設(shè)定為1.9kV，電脈沖時(shí)間5ms，脈沖次數(shù)1次，在50μL巴氏桿菌感受態(tài)細(xì)胞中加入3μg的質(zhì)粒pBluescript－F1KanRF2，進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。并分別用含有5%、2.5%、1%、0血清的 BHI（50μg／mL Kan）平板進(jìn)行篩選，用訊數(shù)抑菌圈（抗生素效價(jià)）測(cè)量?jī)x計(jì)算克隆數(shù)，并隨機(jī)挑取單克隆進(jìn)行PCR驗(yàn)證。

1.8 不同濃度抗生素篩選的電轉(zhuǎn)化

將電壓設(shè)定為1.9kV，電脈沖時(shí)間5ms，脈沖次數(shù)1次，在50μL巴氏桿菌感受態(tài)細(xì)胞中加入3μg的質(zhì)粒pBluescript－F1KanRF2，進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。并分別用含有50、20、10、5μg／mL Kan抗生素的BHI（5%血清）平板進(jìn)行篩選，用訊數(shù)抑菌圈（抗生素效價(jià)）測(cè)量?jī)x計(jì)算克隆數(shù)，并隨機(jī)挑取單克隆進(jìn)行PCR驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 脈沖電壓對(duì)電轉(zhuǎn)化的影響

不同脈沖電壓下的電轉(zhuǎn)化結(jié)果見表1。由表1可知，在脈沖電壓為1900V（19kV／cm）左右時(shí)，可以篩選到較多的發(fā)生了同源重組的轉(zhuǎn)化子。

表1 不同電場(chǎng)強(qiáng)度電轉(zhuǎn)化對(duì)篩選轉(zhuǎn)化子數(shù)量的影響

2.2 質(zhì)粒DNA濃度對(duì)電轉(zhuǎn)化的影響

不同質(zhì)粒DNA濃度下的電轉(zhuǎn)化結(jié)果見表2。由表2可知，當(dāng)感受態(tài)中質(zhì)粒DNA的濃度在37.5μg／mL左右時(shí)，可獲得最多的發(fā)生了同源重組的轉(zhuǎn)化子。

表2 不同DNA濃度電轉(zhuǎn)化對(duì)篩選轉(zhuǎn)化子數(shù)量的影響

2.3 營(yíng)養(yǎng)條件電轉(zhuǎn)化篩選陽(yáng)性克隆的影響

電轉(zhuǎn)化后采用不同含量的血清培養(yǎng)對(duì)篩選轉(zhuǎn)化子數(shù)量的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。由表3可知，電轉(zhuǎn)化之后加入1%～5%血清進(jìn)行培養(yǎng)均可以篩選到較多的發(fā)生了同源重組的轉(zhuǎn)化子，與不加入任何血清相比，結(jié)果極顯著。

表3 電轉(zhuǎn)化后用不同營(yíng)養(yǎng)條件培養(yǎng)對(duì)篩選轉(zhuǎn)化子數(shù)量的影響

2.4 抗生素濃度對(duì)電轉(zhuǎn)化篩選陽(yáng)性克隆的影響

電轉(zhuǎn)化后用不同濃度抗生素培養(yǎng)對(duì)篩選轉(zhuǎn)化子數(shù)量的影響的結(jié)果見表4。由表4可知，隨著抗生素濃度的下降，篩選到的轉(zhuǎn)化子數(shù)量會(huì)逐漸增多，且效果明顯。但是抗生素的濃度過低會(huì)增加假陽(yáng)性的風(fēng)險(xiǎn)，而過高又可能會(huì)發(fā)生不定向的重組，因此終濃度為20～50μg／mL的硫酸卡那霉素對(duì)篩選結(jié)果是有利的。

表4 電轉(zhuǎn)化后用不同濃度抗生素培養(yǎng)對(duì)篩選轉(zhuǎn)化子數(shù)量的影響

2.5 同源重組轉(zhuǎn)化子的鑒定

電轉(zhuǎn)化后，在含有卡那霉素的BHI平板上有單菌落生長(zhǎng)，而轉(zhuǎn)化之前R473對(duì)卡那霉素敏感，因此這些轉(zhuǎn)化子可能是發(fā)生了同源重組，隨機(jī)挑取單克隆進(jìn)行PCR鑒定。由圖1結(jié)果可知，轉(zhuǎn)化子用PMP1與PMP2擴(kuò)增可以特異得到1300bp目的帶；由圖2可知，轉(zhuǎn)化子用pUC4KF與pUC4KR擴(kuò)增可以特異得到550bp目的帶。與預(yù)期結(jié)果相符，轉(zhuǎn)化子為陽(yáng)性克隆。

圖1 轉(zhuǎn)化子采用PMP1與PMP2引物擴(kuò)增結(jié)果

3 討論

克隆一段與受體細(xì)胞染色體高度類似的DNA序列，中間插入抗生素篩選標(biāo)記，并高效地電轉(zhuǎn)化至受體細(xì)胞中，通過單交換或雙交換，篩選得到發(fā)生定向突變的突變株，是設(shè)計(jì)正向篩選的同源重組的一般策略。影響同源重組轉(zhuǎn)化和篩選效率的因素比較復(fù)雜，概括起來(lái)主要有同源重組載體因素、電轉(zhuǎn)化因素以及篩選因素等。

同源重組打靶載體一般具有1個(gè)或者2個(gè)篩選標(biāo)記，并且這種篩選標(biāo)記能夠在受體細(xì)胞中發(fā)揮功能。構(gòu)建的載體pBluescript－F1KanRF2具有2種篩選標(biāo)記：CmR和KanR，且郭東春等［13］已證明這2種篩選標(biāo)記可以用于多殺性巴氏桿菌的遺傳操作體系中。在受體細(xì)胞中打靶質(zhì)粒的非自主復(fù)制是同源重組載體的另外一個(gè)基本特性；但有研究報(bào)道，利用結(jié)合轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式篩選的轉(zhuǎn)化子，即使在Pir蛋白不存在的情況，其質(zhì)粒在下巴氏桿菌中也能自我復(fù)制，在無(wú)抗生素的選擇下，傳代80～100次，才獲得發(fā)生同源重組的克?。?4，15］，這無(wú)疑增加了篩選難度。pBluescript系列載體在多殺性巴氏桿菌中是不能夠自我復(fù)制的，這在巴氏桿菌的aroA以及purF等基因敲除的研究中得到驗(yàn)證［13，16］。因此電擊轉(zhuǎn)化以pBluescript為骨架構(gòu)建的同源重組載體，只要篩選具有KanR的轉(zhuǎn)化子均已發(fā)生了同源重組交換。同源重組序列的長(zhǎng)度顯著地影響基因同源重組效率。Leloup等［17］的研究表明：同源片段長(zhǎng)度在0.3～1.2kb范圍內(nèi)，同源重組的效率呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)。pBluescript－F1KanRF2載體的同源臂在600～700bp之間，經(jīng)電轉(zhuǎn)化后可以得到較高的重組效率。

影響電轉(zhuǎn)化效率的因素主要包括電場(chǎng)強(qiáng)度、DNA濃度、感受態(tài)的質(zhì)量、電擊次數(shù)等。其中電場(chǎng)強(qiáng)度是一個(gè)很重要的參數(shù)，應(yīng)控制一個(gè)合適的電壓，使電擊細(xì)胞后能在細(xì)胞壁表面上出現(xiàn)核酸物質(zhì)可以進(jìn)入的孔洞，但是電壓又不可過高，因?yàn)檫^高的電壓會(huì)造成細(xì)菌大量死亡，同時(shí)，死亡的細(xì)菌會(huì)影響活菌體的生長(zhǎng)［18］。一般情況下，細(xì)菌越小，將外援DNA導(dǎo)入其中所需要的電場(chǎng)強(qiáng)度越大。酵母約7.2μm×5.6μm，大腸桿菌大小（0.4～0.7）μm×（1～3）μm，而巴氏桿菌為卵圓形或球形的革蘭氏陰性小桿菌，大小為（0.2～0.4）μm×（0.5～2.5）μm。巴氏桿菌比酵母、大腸桿菌形態(tài)更小，因此在進(jìn)行電轉(zhuǎn)化時(shí)，選擇的電壓要比對(duì)它們的高，這樣才能得到所需的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。熊萍萍等［19］在多殺性巴氏桿菌C48－16電轉(zhuǎn)化條件的研究中發(fā)現(xiàn)，在12kV／cm的電場(chǎng)強(qiáng)度可以得到最大轉(zhuǎn)化效率，而筆者在多殺性巴氏桿菌R473中發(fā)現(xiàn)19kV／cm是最合適的，這可能是因?yàn)槎鄽⑿园褪蠗U菌R473比C48－16的莢膜層更厚一些。DNA濃度是另外一個(gè)重要的因素。同源重組是一個(gè)概率事件，因此理論上，轉(zhuǎn)化時(shí)高DNA濃度可以增加同源重組幾率，但是將pBluescript－F1KanRF2電轉(zhuǎn)化至R473時(shí)發(fā)現(xiàn)，44.4μg／mL的DNA濃度篩選到的陽(yáng)性克隆比37.5μg／mL的少，可能是因?yàn)檩^高的DNA濃度會(huì)使細(xì)菌更容易發(fā)生二次重組，從而產(chǎn)生更多的回復(fù)突變，使抗性消失。

圖2 轉(zhuǎn)化子采用pUC4KF與pUC4KR引物擴(kuò)增結(jié)果

本研究主要考察了電轉(zhuǎn)化后的營(yíng)養(yǎng)條件和抗生素濃度對(duì)篩選轉(zhuǎn)化子數(shù)量的影響。電擊轉(zhuǎn)化是一個(gè)物理過程，整個(gè)過程對(duì)細(xì)菌損傷較大，有研究表明電擊后剩余30%左右的細(xì)菌存活，此時(shí)的轉(zhuǎn)化效率最高。血清中含有一些微量生長(zhǎng)因子，它們對(duì)多殺性巴氏桿菌的增殖和損傷修復(fù)起著積極的作用。電轉(zhuǎn)化后用1%～5%血清進(jìn)行培養(yǎng)均可以篩選到較多的發(fā)生了同源重組的轉(zhuǎn)化子，且5%血清的效果更好更經(jīng)濟(jì)，而不加入血清培養(yǎng)幾乎不產(chǎn)生克隆，結(jié)果極顯著?？股氐暮Y選濃度是與標(biāo)記基因的表達(dá)呈正相關(guān)的，即標(biāo)記基因在多殺性巴氏桿菌R473中的啟動(dòng)子越強(qiáng)，拷貝數(shù)越高，可以用較高濃度的抗生素將這些轉(zhuǎn)化子篩選出來(lái)。但是定向的基因敲除決定了篩選標(biāo)記在R473只能有1個(gè)拷貝，這與構(gòu)建酵母表達(dá)菌株期望獲得高產(chǎn)是相反的。但較低濃度的抗生素會(huì)使結(jié)果出現(xiàn)更多的假陽(yáng)性，而較高濃度的抗生素壓力會(huì)使不定向重組的可能性增加。因此，在本研究中，筆者認(rèn)為用20～50μg／mL的硫酸卡那霉素對(duì)篩選結(jié)果是有利的。

通過電轉(zhuǎn)化的方法篩選發(fā)生同源重組的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子是一項(xiàng)基礎(chǔ)工作，這為將來(lái)敲除多殺性巴氏桿菌的毒力基因，開發(fā)基因工程減毒株提供技術(shù)支持。

致謝：特別感謝中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所的郭東春老師惠贈(zèng)pBluescript－Tn903質(zhì)粒。

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