官奕宏，李紅衛(wèi)，呂 謀

(青島理工大學(xué)環(huán)境與市政工程學(xué)院，山東青島 266033)

近幾年，抗生素的用量越來越大，全世界每年抗生素的使用量在10萬噸～20萬噸，大部分抗生素具有水溶性，人類和動物服用的抗生素有40%～90% 將隨尿液排出體外［1］?？股貫E用所造成的環(huán)境污染問題在國內(nèi)外已經(jīng)引起高度重視，尤其是在歐美一些發(fā)達(dá)國家。目前很多國家在污水、地表水甚至地下水中檢測到磺胺、喹諾酮和大環(huán)內(nèi)酯類等抗生素的存在［2～4］。諾氟沙星和四環(huán)素分別作為喹諾酮類和四環(huán)素類抗生素的代表，在水中的檢出的頻率都很高［5，6］。

藻類是水生態(tài)系統(tǒng)的初級生產(chǎn)者，可以作為監(jiān)測評價(jià)水環(huán)境質(zhì)量和污染物生態(tài)毒性的重要指示生物［7］，外源污染物對藻類的毒性作用將直接影響水生食物鏈的能量傳遞，進(jìn)而對高營養(yǎng)級生物和整個(gè)水生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生影響。銅綠微囊藻是水華藍(lán)藻的常見藻類，是藻類爆發(fā)時(shí)的優(yōu)勢種群［8］，可以作為水生態(tài)系統(tǒng)初級生產(chǎn)者的代表，因此研究抗生素對銅綠微囊藻的毒性，可以反應(yīng)兩種抗生素對于水生態(tài)系統(tǒng)的影響，對于評價(jià)抗生素在水環(huán)境中的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義。

本文利用葉綠素?zé)晒饧夹g(shù) (PAM)，通過檢測銅綠微囊藻的生物量、葉綠素-a含量、光合作用參數(shù)、活性氧 (ROS)和丙二醛 (MDA)等指標(biāo)的變化，研究了兩種抗生素對銅綠微囊藻的毒性，揭示了兩種抗生素對銅綠微囊藻的作用機(jī)制，為準(zhǔn)確評估不同抗生素的水環(huán)境生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

銅綠微囊藻藻種 (FACHB)購于武漢水生生物研究所，采用BG-11培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基中的化學(xué)組分均為分析純。試驗(yàn)中使用的諾氟沙星和四環(huán)素均購于美國Aladdin公司。

1.2 試驗(yàn)方法

銅綠微囊藻的培養(yǎng)方法如下:批量式培養(yǎng)在光照培養(yǎng)箱 (上海精科，250 L)中，培養(yǎng)箱溫度設(shè)置為25℃ ±1℃，光照強(qiáng)度為3000～4000 Lux，采用12h∶12h的光照/黑夜循環(huán)模式。試驗(yàn)時(shí)，取對數(shù)期的藻細(xì)胞置于250 mL錐形瓶中，用BG-11培養(yǎng)基稀釋至所需藻密度，在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上每種抗生素設(shè)置5個(gè)濃度梯度，諾氟沙星和四環(huán)素的濃度梯度分別為 0.2mg/L，0.5mg/L，1.0mg/L，2.0mg/L，5.0mg/L 和 0.2mg/L，1.0mg/L，5.0mg/L，10.0mg/L，15.0 mg/L，同時(shí)設(shè)置空白對照組，將銅綠微囊藻置于原培養(yǎng)條件下暴露培養(yǎng)，每隔24 h檢測不同濃度抗生素作用下銅綠微囊藻細(xì)胞的OD680，葉綠素光，光合量子產(chǎn)率，ROS和MDA，檢測至96 h，48 h時(shí)檢測不同樣品的SEM照片。

抗生素儲備液配制:由于諾氟沙星水溶性較差，在酸性或堿性時(shí)易溶，所以諾氟沙星配制過程中加入少量的NaOH，最后再用1.0 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至7.0;四環(huán)素的鹽酸鹽能溶于水，實(shí)驗(yàn)中利用無水乙醇可以加快溶解速度，放置在搖床震蕩1～2 h，4℃下儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 檢測指標(biāo)

藻細(xì)胞生物量:本試驗(yàn)采用吸光度法和流式細(xì)胞儀法結(jié)合的方法定量銅綠微囊藻細(xì)胞數(shù)。流式細(xì)胞儀可以很準(zhǔn)確的確定細(xì)胞個(gè)數(shù)，本文建立了一條OD680和細(xì)胞數(shù)的相關(guān)曲線 Y=0.055X-0.005，如圖1所示，二者的相關(guān)性很好，R2達(dá)到0.999，后續(xù)試驗(yàn)都可以根據(jù)該曲線來表征細(xì)胞個(gè)數(shù)。

圖1 吸光度與細(xì)胞密度的相關(guān)曲線Fig.1 Relation curve between absorbance in 680 nm and cell density

葉綠素和光合作用參數(shù):

藻的葉綠素和光合活性參數(shù)采用Phyto-PAM(Walz，德國)測定，取不同劑量抗生素作用的樣品4 mL，置于PAM用的檢測管中。

光合量子產(chǎn)率Y值通過式 (1)計(jì)算得到:

式中:

Fm——在暗適應(yīng)狀態(tài)下，PSII系統(tǒng)在打開飽和脈沖后產(chǎn)生的最大熒光值;

F0——在暗適應(yīng)狀態(tài)下，PSII系統(tǒng)在打開飽和脈沖前產(chǎn)生的熒光值。

快速光響應(yīng)曲線 (PLC)的測定條件設(shè)定為:步長 20 s，最大光照強(qiáng)度 1564 μmol/(m2·s)。通過快速光響應(yīng)曲線的測定可得到相應(yīng)光能利用率α的值，藻細(xì)胞內(nèi)的葉綠素-a含量也可以通過熒光性能檢測，Phyto-PAM可以直接得到藻細(xì)胞葉綠素-a 的含量［9］。

活性氧 (ROS)的檢測:將培養(yǎng)48h后的藻細(xì)胞樣品收集，取1 mL藻液在2000 r/min條件下離心，將細(xì)胞收集，用磷酸緩沖溶液洗兩遍，黑暗條件下，在10 μM的熒光探針H2DCF-DA中培養(yǎng)30 min，離心后用磷酸緩沖液沖洗2遍，用酶標(biāo)儀(SynergyTM4)檢測細(xì)胞內(nèi)部DCF的熒光強(qiáng)度，即可表示細(xì)胞內(nèi)部ROS含量［10］，ROS相對含量計(jì)算公式如下:

丙二醛 (MDA)的檢測:取在不同條件下培養(yǎng)48 h的藻液50mL，在4000 r/min的條件下離心，去掉上清液，將分離的藻細(xì)胞加入石英砂充分研磨，之后加入磷酸緩沖液充分?jǐn)嚢?，離心得到上清液即為酶液。取0.6克TBA(硫代巴比妥酸)，先用少量1M NaOH溶解，用10%TCA(三氯乙酸)定容至100 mL。1 mL酶液 +2 mL0.6%的TBA，封口沸水浴15 min，迅速冷卻后再離心，取上清液，在600、532、450 nm三個(gè)波長下測定吸光度［11］，計(jì)算公式如下:

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

每種試驗(yàn)處理都設(shè)置3組平行樣品，結(jié)果以均值加標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。每種處理后的樣品都與空白組進(jìn)行對照，數(shù)據(jù)置信度在P＜0.05，用 origin數(shù)據(jù)處理軟件作圖處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 兩種抗生素對銅綠微囊藻生長曲線的影響

諾氟沙星和四環(huán)素對銅綠微囊藻生長曲線影響如圖2所示。從圖2A中可以看出，諾氟沙星濃度低于0.5 mg/L時(shí)對銅綠微囊藻的生長抑制作用不強(qiáng)，在0.2 mg/L時(shí)促進(jìn)了藻細(xì)胞的生長;諾氟沙星濃度達(dá)到1.0 mg/L時(shí)，對銅綠微囊藻生長有明顯的抑制，超過2.0 mg/L時(shí)，培養(yǎng)1天后銅綠微囊藻停止生長。由圖2B可知，隨濃度增加，四環(huán)素對銅綠微囊藻的抑制作用越來越明顯，當(dāng)四環(huán)素濃度超過5.0 mg/L時(shí)，培養(yǎng)1天后藻細(xì)胞停止生長。諾氟沙星和四環(huán)素對銅綠藻的抑制作用都有明顯的濃度-效應(yīng)關(guān)系，二者對銅綠微囊藻96 h的EC50分別為0.85 mg/L 和 2.64 mg/L，這說明諾氟沙星對銅綠微囊藻的抑制作用比四環(huán)素更強(qiáng)。

圖2 不同劑量抗生素對銅綠微囊藻生長曲線影響(A為諾氟沙星處理組，B為四環(huán)素處理組)Fig.2 Effects of different dosage of antibiotic on the growth curve of Microcystis aeruginosa(A.Norfloxacin，B.Tetracycline)

2.2 兩種抗生素作用前后銅綠微囊藻的掃描電子顯微鏡 (SEM)照片

圖3所示為銅綠微囊藻在不同抗生素作用后的SEM照片。圖3A為正常銅綠微囊藻細(xì)胞，細(xì)胞表面光滑，呈規(guī)則球狀。圖3B和圖3C分別為諾氟沙星和四環(huán)素作用后的銅綠微囊藻細(xì)胞，藻細(xì)胞發(fā)生明顯變形，表面凹陷，表面分泌物明顯減少，這說明諾氟沙星和四環(huán)素能夠破壞藻細(xì)胞的生理機(jī)能，改變細(xì)胞內(nèi)外滲透壓，導(dǎo)致藻細(xì)胞死亡。另外，諾氟沙星作用后的藻細(xì)胞變形要比四環(huán)素的明顯，這說明諾氟沙星對銅綠微囊藻的毒性強(qiáng)過四環(huán)素。

2.3 兩種抗生素對銅綠微囊藻葉綠素-a含量的影響

圖3 銅綠微囊藻的SEM照片A為空白組，B為諾氟沙星處理組，C為四環(huán)素處理組Fig.3 The SEM images of Microcystis aeruginosa.A.black ontrol，B.treated by Norfloxacin，C.treated by Tetracycline.

葉綠素-a是植物進(jìn)行光合作用的重要物質(zhì)，在光能的吸收、傳遞和轉(zhuǎn)換過程中起著關(guān)鍵作用。葉綠素-a含量可以間接反映細(xì)胞的活性和光合作用能力，圖4為兩種抗生素作用96 h后對銅綠微囊藻葉綠素-a含量的影響。從圖中可知，低濃度時(shí)，兩種抗生素都可以刺激銅綠微囊藻葉綠素-a的合成，隨著兩種抗生素濃度的升高葉綠素-a含量呈現(xiàn)下降的趨勢，10 mg/L的諾氟沙星作用96 h后，藻液幾乎變?yōu)橥该鳎~綠素下降的原因可能是葉綠體的流失或破壞［12］。在相同劑量時(shí)，諾氟沙星作用后的藻細(xì)胞葉綠素-a含量更低，說明諾氟沙星比四環(huán)素對銅綠微囊藻光合作用的影響更嚴(yán)重。

圖4 銅綠微囊藻葉綠素-a含量變化ig.4 The changes of chlorophyll-a in Microcystis aeruginosa

2.4 兩種抗生素對銅綠微囊藻光合作用的影響

光合量子產(chǎn)率Y值表示PSII原初光能轉(zhuǎn)換效率，Y值變化能夠直接顯示光合作用強(qiáng)弱。α值為光能利用率，它的值為快速光響應(yīng)曲線的初始斜率，能夠表示藻細(xì)胞光合作用中光能的利用效率。圖5為不同劑量抗生素作用96 h后銅綠微囊藻Y值得變化，從圖中可以看出諾氟沙星低于0.5 mg/L時(shí)Y值變化很小，超過0.5 mg/L時(shí)，隨著諾氟沙星濃度增大Y值逐漸降低，最后變?yōu)?。四環(huán)素對銅綠微囊藻Y值得影響規(guī)律與諾氟沙星類似，但同劑量條件下，諾氟沙星作用的藻細(xì)胞Y值更低，說明諾氟沙星對藻細(xì)胞光合作用過程破壞程度比四環(huán)素更大。

圖6為兩種抗生素對銅綠微囊藻α值的影響，由圖可知，諾氟沙星低于0.5 mg/L時(shí)對α值沒有明顯影響，四環(huán)素在達(dá)到1.0 mg/L前對α值影響很小，隨兩種抗生素濃度增加，銅綠微囊藻的α值降低，二者都表現(xiàn)出顯著的濃度-效應(yīng)關(guān)系。這說明諾氟沙星和四環(huán)素都明顯的阻礙了銅綠微囊藻對光能的利用，且諾氟沙星的阻礙作用更明顯，由于光能的利用率降低導(dǎo)致藻細(xì)胞活性減弱。由Y值和α值得變化可知，破壞光合系統(tǒng)是諾氟沙星和四環(huán)素對銅綠微囊藻重要的致毒機(jī)理。

圖5 銅綠微囊藻光合量子產(chǎn)率Y值得變化Fig.5 The changes of photosynthetic quantum yield in Microcystis aeruginosa

圖6 銅綠微囊藻光能利用率α值的變化Fig.6 The changes of efficiency for solar energy utilization α in Microcystis aeruginosa

2.5 兩種抗生素在銅綠微囊藻內(nèi)部產(chǎn)生的氧化脅迫

活性氧 (ROS)是生物有氧代謝過程中的一種副產(chǎn)品，當(dāng)細(xì)胞受到外部刺激時(shí)，ROS含量會急劇增多［13］，過高的 ROS水平會使細(xì)胞及其基因結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重的損壞。圖7為兩種抗生素作用48 h后銅綠微囊藻內(nèi)部ROS含量變化，由圖可知諾氟沙星在較低濃度就可引起ROS明顯增加，且與投加劑量成正相關(guān);諾氟沙星濃度超過5.0 mg/L，藻細(xì)胞內(nèi)ROS含量出現(xiàn)降低，這是因?yàn)樵寮?xì)胞大量死亡后內(nèi)部的ROS會釋放出來，因此出現(xiàn)下降［14］。四環(huán)素濃度低于 1.0 mg/L，藻細(xì)胞內(nèi)部ROS并無明顯增加，隨四環(huán)素濃度繼續(xù)升高，ROS含量出現(xiàn)快速上升，10mg/L的四環(huán)素作用后，ROS相對含量達(dá)到300%，但同劑量條件下，諾氟沙星對銅綠微囊藻產(chǎn)生的氧化脅迫明顯強(qiáng)于四環(huán)素。

高濃度的諾氟沙星和四環(huán)素都能誘導(dǎo)藻細(xì)胞內(nèi)ROS的大量產(chǎn)生，而逐漸增加的抗氧化酶活性并不足以清除細(xì)胞內(nèi)的 ROS和阻止光致氧化作用，造成其過度積累，誘導(dǎo)對生物大分子 (如蛋白質(zhì)，DNA，細(xì)胞膜脂)的氧化損傷，引起細(xì)胞代謝紊亂，使得藻細(xì)胞膜系統(tǒng)和功能異常或受到損傷，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞死亡［15］。因此，氧化脅迫是諾氟沙星和四環(huán)素致死銅綠微囊藻的重要機(jī)理。

圖7 銅綠微囊藻ROS相對含量的變化Fig.7 The changes of ROS relative content in Microcystis aeruginosa

2.6 兩種抗生素對銅綠微囊藻細(xì)胞膜的破壞

圖8 銅綠微囊藻MDA相對含量的變化Fig.8 The changes of MDA relative content in Microcystis aeruginosa

丙二醛 (MDA)是細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，其含量可以反映活性氧自由基對細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的損傷程度［16］，其含量的大量增加也說明藻細(xì)胞的抗氧化系統(tǒng)處于一個(gè)不平衡的狀態(tài)。圖8為兩種抗生素作用48 h后藻細(xì)胞內(nèi)部MDA含量的變化，兩種抗生素在高濃度時(shí)都會引起銅綠微囊藻內(nèi)部MDA的急劇升高，在同劑量時(shí)，諾氟沙星處理組的MDA含量明顯高于四環(huán)素，說明諾氟沙星對銅綠微囊藻細(xì)胞膜的損傷明顯強(qiáng)于四環(huán)素。試驗(yàn)結(jié)果從側(cè)面證明，諾氟沙星和四環(huán)素都能在藻細(xì)胞內(nèi)部誘導(dǎo)產(chǎn)生大量活性氧，從而使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受損，最終導(dǎo)致藻細(xì)胞死亡。

3 結(jié)論

3.1 諾氟沙星和四環(huán)素在低濃度時(shí)都可以促進(jìn)銅綠微囊藻生長，高濃度時(shí)二者對銅綠微囊藻表現(xiàn)出明顯的抑制作用，且諾氟沙星抑制能力明顯強(qiáng)于四環(huán)素;諾氟沙星和四環(huán)素對銅綠微囊藻96 h EC50分別為0.85 mg/L 和2.64 mg/L。

3.2 諾氟沙星和四環(huán)素在高濃度時(shí)對銅綠微囊藻光合作用有顯著的破壞，葉綠素-a濃度、Y值和α值變化都表現(xiàn)出明顯的濃度-效應(yīng)關(guān)系，光合系統(tǒng)的破壞是諾氟沙星和四環(huán)素致死銅綠微囊藻的重要機(jī)理之一。

3.3 諾氟沙星和四環(huán)素在高濃度時(shí)會在藻細(xì)胞內(nèi)部誘導(dǎo)產(chǎn)生大量活性氧，氧化藻細(xì)胞膜，引起MDA濃度明顯升高，且同劑量諾氟沙星產(chǎn)生的氧化脅迫明顯強(qiáng)于四環(huán)素，因此氧化脅迫是兩種抗生素破壞藻細(xì)胞的重要途徑。

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