葉 輝，李齊激，史亞男，楊 艷，楊付梅，楊小生*

(1.遵義醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義 563099;2.貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550002)

氧化應(yīng)激是體內(nèi)一種重要的病理生理反應(yīng)，主要是自由基產(chǎn)生過多或抗氧化物質(zhì)水平減少而使兩者之間的平衡失調(diào)，從而造成的細(xì)胞老化或損傷;生物體組織器官的老化與氧化應(yīng)激有直接關(guān)系，特別是神經(jīng)系統(tǒng)的氧化應(yīng)激造成神經(jīng)性疾病，如:帕金森病、阿爾茨海默?。?-3］。研究發(fā)現(xiàn)通過抗過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)細(xì)胞DNA損傷能較好地反應(yīng)抗氧化、細(xì)胞保護(hù)作用［4］。熊果酸(Ursolic acid)是一種廣泛存在于天然植物中五環(huán)三萜類化合物，具有廣泛的生物活性，包括抗氧化活性［5］，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞［6］、心肌細(xì)胞［7］、肝細(xì)胞保護(hù)作用［8］，抗氧化應(yīng)激效應(yīng)是較為認(rèn)可的作用機(jī)制之一［9］。在以熊果酸為先導(dǎo)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，從而篩選抗氧化應(yīng)激活性物質(zhì)的進(jìn)程中，前人做了大量工作，初步證實(shí)五環(huán)三萜化合物的抗氧化活性與取代位置、取代基團(tuán)、分子構(gòu)象等關(guān)系密切，尤其是羥基取代及其數(shù)目［10-11］。本實(shí)驗(yàn)擬通過增加熊果酸C1-3位的羥基數(shù)目和C28位取代基團(tuán)，合成系列1，2，3-三羥基熊果酸及其衍生物，并運(yùn)用MTT法對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的細(xì)胞毒性、H2O2損傷PC12細(xì)胞保護(hù)活性進(jìn)行篩選，初步探討其構(gòu)效關(guān)系，為進(jìn)一步藥物篩選提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

熊果酸購(gòu)自貴州省迪大科技有限公司(純度90%);WGH-30型雙光束紅外分光光度計(jì)測(cè)定，KBr壓片;Varian INOVA 400 NHz核磁共振儀，TMS為內(nèi)標(biāo)，CDCl3和CD3OD為溶劑;HP-5973型質(zhì)譜儀;XT-4顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀(控溫型)，溫度未經(jīng)校正;各種試劑均為分析純或化學(xué)純。

1.2 合成方法

以熊果酸為原料，先芐基化得中間體2，再在甲基磺酰氯作用下的中間體3，經(jīng)碳酸鋰處理得中間體4，通過二氧化硒氧化得5，再經(jīng)NaOH水溶液處理脫羧得6，中間體6在間氯過氧苯甲酸作用下環(huán)氧得7，經(jīng)高氯酸水解得9，最后采用鈀碳催化氫化的 1，2，3- 三羥基熊果酸(10)［12］，進(jìn)而對(duì) 10 的C-28位進(jìn)行衍生得11-15。合成路線見Scheme 1。

1.2.1 化合物7-10的合成 取300 mg(0.551 mmol)6，加入50 mL的二氯甲烷溶解，再加入254 mg(1.102 mmol)間氯過氧苯甲酸，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫反應(yīng)4 h，氯仿萃取，有機(jī)層用飽和食鹽水洗滌、無水MgSO4干燥有機(jī)相，減壓除去溶劑，殘留物經(jīng)硅膠柱層析(石油醚∶乙酸乙酯=10∶1，V/V)純化得7(270 mg)。

圖1 合成路線Fig.1 Synthesispathway

取50 mg(0.089 mmol)7，加入20 mL的甲醇溶解，再加47 mg(0.445 mmol)鈀炭，用油泵邊抽除空氣邊注入氫氣，反復(fù)三次，在氫氣保護(hù)下反應(yīng)10 h，濾除鈀炭，減壓除去甲醇，加入適量水分散后，用乙酸乙酯萃取，有機(jī)層用飽和食鹽水洗滌、無水MgSO4干燥有機(jī)相，減壓除去溶劑，殘留物經(jīng)硅膠柱層析 (石油醚∶丙酮=2∶1，V/V)純化得8(39 mg)。

取200 mg(0.357 mmol)7，加入 20 mL 的 1，4-二氧六環(huán)溶解，冰浴下緩慢加入101 μL(1.785 mmol)高氯酸，兩滴蒸餾水。氮?dú)獗Ｗo(hù)下油浴60℃反應(yīng)8 h，加入10 mL水，攪拌0.5 h，減壓除去部分1，4-二氧六環(huán)，用乙酸乙酯萃取，有機(jī)層用飽和食鹽水洗滌、無水MgSO4干燥有機(jī)相，減壓除去溶劑，殘留物經(jīng)硅膠柱層析(石油醚∶丙酮=2∶1，V/V)純化得9(63 mg)。

參照化合物8的制備方法，由化合物9(100 mg，0.173 mmol)，鈀炭(92 mg，0.865 mmol)，制備得10(77 mg)。

1.2.2 化合物11-15的合成 化合物11的制備取100 mg(0.205 mmol)10，加入20 mL的 DMF溶解，再加141 mg(1.025 mmol)K2CO3，氮?dú)獗Ｗo(hù)下常溫反應(yīng)8 h，用乙酸乙酯萃取，有機(jī)層用飽和食鹽水洗滌、無水MgSO4干燥有機(jī)相，減壓除去溶劑，殘留物經(jīng)硅膠柱層析(石油醚∶丙酮=1∶1，V/V)純化得11(107 mg)。

化合物12的制備取50 mg(0.084 mmol)11，加入20 mL的乙醇溶解，加入1 mL水，在加入42.4 mg(0.420 mmol)的三乙胺，氮?dú)獗Ｗo(hù)下回流1 h，用乙酸乙酯萃取，有機(jī)層用飽和食鹽水洗滌、無水MgSO4干燥有機(jī)相，減壓除去溶劑，殘留物經(jīng)硅膠柱層析(石油醚∶丙酮=1∶1，V/V)純化得12(36 mg)。

化合物13的制備取50 mg(0.084 mmol)11，加入20 mL的DMF溶解，再加58 mg(0.420 mmol)K2CO3，分別加入12.3 mg(0.168 mmol)的二乙胺，氮?dú)獗Ｗo(hù)下常溫反應(yīng)8 h，用乙酸乙酯萃取，有機(jī)層用飽和食鹽水洗滌、無水MgSO4干燥有機(jī)相，減壓除去溶劑，殘留物經(jīng)硅膠柱層析(石油醚∶丙酮=1∶2，V/V)純化得13(33 mg)。

化合物14的制備參照化合物13的制備方法，由化合物 11(50 mg，0.084 mmol)，N-甲基哌嗪(42 mg，0.420 mmol)，K2CO3(58 mg，0.420 mmol)，制備得14(39 mg)。

化合物15的制備參照化合物13的制備方法，由化合物11(50 mg，0.084 mmol)，二乙醇胺(44 mg，0.420 mmol)，K2CO3(58 mg，0.420 mmol)，制備得15(42 mg)。

1.3 抗過氧化氫損傷PC12細(xì)胞活性測(cè)試

1.3.1 細(xì)胞毒性測(cè)試 將PC12細(xì)胞懸液稀釋成5×104cells·well-1，種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔 100 μL，放置在 37℃，5%CO2，100% 相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，在各孔中分別加入不同濃度的受試化合物(終濃度為1.0×10-4，1.0×10-5，1.0×10-6mol/L)，不加受試化合物為空白對(duì)照組，每個(gè)濃度組制備4個(gè)復(fù)孔，在相同條件下，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入5 g/L MTT 20 μL，37 ℃孵育4 h，吸出培養(yǎng)基，每孔加100 μL二甲基亞砜溶解結(jié)晶，微型振蕩5 min后，用酶標(biāo)儀在490 nm～570 nm下測(cè)定各孔吸光度(A值)，各濃度組均取4次測(cè)定平均值［13］。通過與對(duì)照組的比較計(jì)算實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞毒性。

細(xì)胞毒性=(1-實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100%

1.3.2 抗過氧化氫損傷PC12細(xì)胞活力測(cè)試 采用MTT法測(cè)試了化合物7-15對(duì)細(xì)胞毒性和抗過氧化氫損傷細(xì)胞PC12活力測(cè)試，陽(yáng)性對(duì)照藥為維生素E。實(shí)驗(yàn)以PC12細(xì)胞1×104cells·well-1種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后棄上清，按以下分組:①空白對(duì)照組:加入無血清PC12細(xì)胞培養(yǎng)基;②模型組:加入200 μmol/L的 H2O2繼續(xù)培養(yǎng)24 h;③受試化合物低劑量組(終濃度為1.0×10-6mol/L);④受試化合物中劑量組(終濃度為1.0×10-5mol/L);⑤受試化合物高劑量組(終濃度為1.0×10-4mol/L)，分別加入不同濃度受試化合物處理24 h后，再加入200 μmol/L H2O2繼續(xù)培養(yǎng)24 h。⑥陽(yáng)性對(duì)照組:分別加入上述高中低三個(gè)濃度的維生素E處理24 h后，再加入200 μmol/L H2O2繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在波長(zhǎng)為570 nm處測(cè)定每個(gè)孔的吸光度，并計(jì)算細(xì)胞保護(hù)率。

細(xì)胞保護(hù)率=(實(shí)驗(yàn)組OD值/正常細(xì)胞組OD值)×100%。

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物的光譜數(shù)據(jù)

化合物7白色固體，產(chǎn)率:87.4%，mp 52～55℃;IR(KBr)υmax3 448，2 923，1 720，1 457，1 386 cm-1;1H-NMR(CDCl3，400 MHz)δ:7.35(m，5H，Ar-H)，5.25(s，1H，-CH=)，5.12 ～ 4.95(dd，2H，CH2-)，3.51 ～ 3.50(d，1H，J=5.6Hz，OCH-)，3.46 ～ 3.44(dd，1H，OCH-)，3.00 ～2.99(d，1H，J=3.6Hz，OCH-)，1.08，1.08，1.00，0.82，0.64(s，15H，5CH3)，0.95 ～ 0.93(d，3H，J=8.0Hz，CH3)，0.89 ～ 0.88(3H，d，J=4.0Hz，CH3);13C-NMR(CDCl3，100 MHz)δ:177.3，137.7，136.3，128.3，128.3，128.0，128.0，127.8，125.7，67.0，65.9，64.9，55.9，52.7，48.1，42.3，40.3，40.2，39.1，38.8，38.7，36.6，35.7，32.4，31.8，30.6，29.6，27.8，24.2，23.3，22.8，22.3，21.8，18.6，17.0，17.0，15.7;ESI-MS m/z:583 ［M+Na］+。

化合物8白色固體，產(chǎn)率:92.9%，mp 258～260 ℃;IR(KBr)υmax3 443，2 925，1 691 cm-1;1HNMR(CD3OD，400 MHz)δ:5.23(s，1H，-CH=)，3.56 ～3.55(d，2H，J=4.8Hz，OCH-)，3.46～3.44(dd，1H，OCH-)，2.99 ～2.98(d，1H，J=2.8Hz，OCH-)，1.12，1.08，1.01，0.95，0.84(s，15H，5CH3)，0.94 ～0.92(d，3H，J=4.8Hz，CH3)，0.88 ～ 0.86(3H，d，J=6.0Hz，CH3);13C-NMR(CD3OD，100 MHz)δ:182.1，139.3，127.0，68.9，65.0，64.9，56.7，54.5，43.7，41.6，41.4，40.5，40.4，40.1，38.1，36.9，33.5，33.2，31.7，29.2，28.4，25.3，24.1，24.0，22.7，21.6，19.8，17.9，17.6，16.7;ESI-MS m/z:493 ［M+Na］+。

化合物9白色固體，產(chǎn)率:30.6%，mp 252～254 ℃;IR(KBr)υmax3 441，2 924，1 722，1 455，1 377 cm-1;1H-NMR(CDCl3，400 MHz)δ:7.35(m，5H，Ar-H)，5.26(s，1H，-CH=)，5.12 ～4.96(dd，2H，CH2-)，3.79 ～ 3.82(m，1H，J=3.6Hz，OCH-)，3.63 ～ 3.65(d，1H，J=8.4Hz，OCH-)，3.43 ～3.45(d，1H，J=4.4Hz，OCH-)，1.11，1.06，0.87，0.85，0.65(s，15H，5CH3)，1.03～1.01(d，3H，J=8.0Hz，CH3)，0.94 ～ 0.93(d，3H，J=4.0Hz，CH3);13C-NMR(CDCl3，100 MHz)δ:177.3，138.4，136.2，128.3，128.3，128.1，128.1，127.9，125.2，74.5，73.7，76.0，65.9，52.7，47.9，48.0，42.4，40.1，39.3，39.0，38.7，38.4，38.1，36.6，32.3，30.5，29.5，27.8，24.1，23.7，23.1，21.1，17.8，17.2，17.0，14.1;ESI-MS m/z:601［M+Na］+。

化合物10白色固體，產(chǎn)率:91.7%，mp 297～299 ℃;IR(KBr)υmax3 450，2 926，1 691 cm-1;1HNMR(CD3OD，400 MHz)δ:5.27(s，1H，-CH=)，4.00(d，1H，J=2.4Hz，OCH-)，3.68(d，1H，J=2.4Hz，OCH-)，3.45(d，1H，J=3.2Hz，OCH-)，1.28，1.23，1.13，1.00，0.87(15H，s，5CH3)，0.96 ～ 0.94(d，3H，J=4.0Hz，CH3)，0.90～0.89(d，3H，J=5.2Hz，CH3);13C-NMR(CD3OD，100 MHz)δ:180.5，139.5，127.1，77.4，75.3，74.9，49.6，47.6，47.2，43.4，42.7，41.5，40.3，39.7，39.3，39.2，34.8，33.8，33.6，33.5，30.1，28.8，26.5，24.4，24.0，24.0，19.1，18.1，17.8，14.8;ESI-MS m/z:511［M+Na］+。

化合物11無色油狀物，產(chǎn)率:87.7%，bp 95～97 ℃;IR(KBr)υmax3 425，2 928，1 727，1 532，1 456 cm-1;1H-NMR(CDCl3，400 MHz)δ:5.27(s，1H，-CH=)，4.33 ～ 4.30(t，2H，J=6Hz，CH2-)，3.95(d，1H，J=5.6Hz，OCH-)，3.70(d，1H，J=2.4Hz，OCH-)，3.54(d，1H，J=4.0Hz，OCH-)，3.51 ～ 3.48(t，2H，J=6Hz，CH2-)，1.28，1.20，1.11，1.00，0.80(s，15H，5CH3)，0.94 ～ 0.95(d，3H，J=6.0Hz，CH3)，0.86 ～ 0.87(d，3H，J=6.4Hz，CH3);13C-NMR(CDCl3，100 MHz)δ:177.2，138.1，125.1，77.3，77.0，76.7，73.8，63.6，52.7，48.1，42.5，40.3，39.4，38.9，38.8，38.3，38.1，36.7，32.3，30.6，29.6，29.0，27.9，24.1，23.7，23.2，21.1，17.8，17.4，17.0，14.5，14.1;ESI-MS m/z:618［M+Na］+。

化合物12白色固體，產(chǎn)率:80.5%，mp 159～161 ℃;IR(KBr)υmax3 425，2 925，1 724，1 644，1 457 cm-1;1H-NMR(CDCl3，400 MHz)δ:5.24(s，1H，-CH=)，4.15 ～ 4.12(t，2H，J=6.0Hz，CH2-)，4.02(d，1H，J=2.8Hz，OCH-)，3.74(d，1H，J=2.8Hz，OCH-)，3.54(d，1H，J=4.0Hz，OCH-)，2.72 ～2.70(t，2H，J=5.6Hz，CH2-)，2.37 ～2.00(m，8H，CH2-)，2.00(s，3H，CH3)，1.21，1.11，1.02，0.97，0.79(s，15H，5CH3)，0.95 ～0.94(d，3H，J=4.8Hz，CH3)，0.88 ～ 0.86(d，3H，J=6.4Hz，CH3);13C-NMR(CDCl3，100 MHz)δ:177.4，138.4，125.3，77.3，77.0，76.1，76.1，74.4，73.7，61.8，56.3，54.5，52.7，52.6，48.0，47.9，45.4，42.5，40.3，39.4，39.0，38.4，38.3，38.2，36.7，32.4，29.6，24.2，23.7，23.2，21.2，17.9，17.4，17.3，17.1，14.2;ESI-MS m/z:637 ［M+Na］+。

化合物13白色固體，產(chǎn)率:66.9%，mp 124～126 ℃;IR(KBr)υmax3 430，2 927，1 724，1 457 cm-1;1H-NMR(CDCl3，400 MHz)δ:5.25(s，1H，-CH=)，4.14 ～ 4.11(t，2H，J=7.2Hz，CH2-)，4.02(d，1H，J=3.6Hz，OCH-)，3.73(d，1H，J=2.4Hz，OCH-)，3.54(d，1H，J=4.4Hz，OCH-)，2.75 ～2.73(t，2H，J=6.8Hz，CH2-)，2.63 ～2.58(dd，4H，CH2-)，1.21，1.07，1.02，0.96，0.80(s，15H，5CH3)，1.14 ～ 1.05(m，6H，2CH3)，0.93 ～0.95(d，3H，J=6.0Hz，CH3)，0.85 ～0.87(d，3H，J=6.4Hz，CH3);13C-NMR(CDCl3，100 MHz)δ:177.5，138.3，125.3，77.3，77.0，76.7，76.0，74.4，73.8，61.2，60.4，52.8，50.5，48.0，47.9，47.4，42.5，40.3，39.4，39.0，38.8，38.3，36.6，32.4，30.4，29.6，27.9，24.1，23.7，23.2，21.2，17.9，17.4，17.3，17.2，14.2;ESI-MS m/z:610 ［M+Na］+。

化合物14白色固體，產(chǎn)率:75.6%，mp 147～149 ℃;IR(KBr)υmax3 442，2 949，1 644，1 463，1 429 cm-1;1H-NMR(CDCl3，400 MHz)δ:5.26(s，1H，-CH=)，4.12 ～ 4.10(t，2H，J=6.0Hz，CH2-)，4.03 ～ 4.02(d，1H，J=2.8Hz，OCH-)，3.75(d，1H，J=2.4Hz，OCH-)，3.64 ～3.62(t，4H，J=5.2Hz，CH2-)，3.55(d，1H，J=4.0Hz，OCH-)，2.84 ～2.81(t，2H，J=6.8Hz，CH2-)，2.75 ～2.72(t，4H，J=5.6Hz，CH2-)，1.21，1.10，1.02，0.97，0.79(s，15H，5CH3)，0.94 ～ 0.93(d，3H，J=6.4Hz，CH3)，0.86 ～ 0.85(d，3H，J=6.4Hz，CH3);13C-NMR(CDCl3，100 MHz)δ:177.8，138.4，125.3，77.3，77.0，76.8，76.1，74.5，73.8，61.9，59.8，56.3，52.8，48.1，47.9，42.5，40.3，39.3，39.0，38.8，38.4，38.0，36.7，32.3，30.6，29.6，27.9，24.2，23.7，23.2，21.1，17.9，17.4，17.2，17.1，14.2;ESI-MS m/z:642 ［M+Na］+。

化合物15白色固體，產(chǎn)率:80.8%，mp 142～145 ℃;IR(KBr)υmax3 442，2 949，1 708，1 635，1 456 cm-1;1H-NMR(CDCl3，400 MHz)δ:5.28(s，1H，-CH=)，4.23 ～4.19(m，2H，CH2-)，4.11 ～4.03(m，2H，CH2-)，3.80(s，1H，OCH-)，3.74(s，1H，OCH-)，3.54(s，1H，OCH-)，1.20，1.12，1.02，0.94，0.81(s，15H，5CH3)，0.96(d，3H，J=2.8Hz，CH3)，0.87 ～ 0.86(d，3H，J=5.2Hz，CH3);13C-NMR(CDCl3，100 MHz)δ:177.9，139.3，125.0，77.3，77.0，76.8，63.9，61.3，52.9，48.3，48.0，42.7，40.3，39.4，39.1，38.8，38.4，38.2，36.7，32.4，30.6，29.6，27.8，24.2，23.7，23.2，21.1，17.8，17.4，17.2，17.1，14.2;ESI-MS m/z:555［M+Na］+。

2.2 細(xì)胞毒性

由表1可知，UA細(xì)胞毒性較小，在濃度1.0×10-4、1.0×10-5、1.0 ×10-6mol/L 下細(xì)胞的死亡率為6.69%、8.37%、9.78%;化合物 7、9、11、12、14有明顯的細(xì)胞毒性，在濃度為1.0×10-4mol/L細(xì)胞的死亡率分別為 85.17%，87.27%，84.20%，88.31%，85.08%;化合物10的細(xì)胞毒性小于UA，衍生物13、15無細(xì)胞毒性。

表1 化合物對(duì)PC12細(xì)胞的毒性Tab.1 The toxicity of compounds on PC12 cells

2.3 抗過氧化氫損傷PC12細(xì)胞活性

表2 化合物對(duì)抗過氧化氫損傷PC12細(xì)胞的保護(hù)率Tab.2 The protection rate of compounds against H2O2induced damage of PC12 cells

由表2可知，UA無抗過氧化氫損傷PC12細(xì)胞活性，化合物10有微弱的抗過氧化氫損傷PC12細(xì)胞活性，13、15抗過氧化氫損傷PC12細(xì)胞活性較好，在1.0×10-4mol/L水平，對(duì)過氧化氫損傷PC12細(xì)胞抑制率分別為35.93%，40.18%，尤其是15，抑制率高于陽(yáng)性對(duì)照(維生素E)。

綜上，構(gòu)效關(guān)系結(jié)果分析如下:(1)UA母環(huán)上引入三個(gè)羥基后，細(xì)胞毒性降低，抗過氧化氫損傷PC12細(xì)胞活性增強(qiáng)。(2)在三羥基熊果酸C-28引入溴乙烷、N-甲基哌嗪、羥基乙烷(11、12、14)顯著增強(qiáng)了其對(duì)細(xì)胞的毒性。(3)在三羥基熊果酸C-28引入脂肪碳后，再引入二乙胺基、二乙醇胺基(13、15)，可顯著降低細(xì)胞毒性，且明顯增強(qiáng)抗過氧化氫損傷PC12細(xì)胞活性，其中引入二乙醇胺基的抗過氧化氫損傷PC12細(xì)胞活性強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照維生素 E。(5)化合物 UA、10、14、15比較，化合物14在高濃度時(shí)有明顯的細(xì)胞毒性，可能引入的乙烷基團(tuán)是細(xì)胞毒性基團(tuán)，但在低濃度1.0×10-5mol/L對(duì)過氧化氫損傷PC12細(xì)胞也有明顯的保護(hù)活性，化合物UA、10、14隨著羥基數(shù)目增多，其抗過氧化氫損傷PC12細(xì)胞活性逐漸增強(qiáng)。

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