白仲杰，任群利，俸婷婷，趙 致，周 英，林 冰*

(1.貴州大學(xué)貴州省中藥民族藥創(chuàng)制工程中心，貴州 貴陽(yáng) 550025;2.貴州省藥食同源植物資源研究開(kāi)發(fā)中心，貴州 貴陽(yáng) 550025)

灰氈毛忍冬 Lonicera macranthoides Hand-Mazz.屬于忍冬科忍冬屬常綠藤本植物，《中國(guó)藥典》2005年版一部將其作為新收載品種，與紅腺忍冬、華南忍冬一同列入新增的山銀花項(xiàng)下［1-2］。主要含綠原酸、木犀草素等成分，具有清熱解毒、抗菌消炎的功效。被廣泛應(yīng)用于癰腫疔瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風(fēng)熱感冒、溫?zé)岚l(fā)病等疾病的治療［3-5］。在2005與2010年版《中國(guó)藥典》中，山銀花與金銀花藥用部位、性味歸經(jīng)、功能主治和用法用量都完全一致。

炎癥反應(yīng)作為眾多疾病的一個(gè)早期反應(yīng)，在疾病的發(fā)生發(fā)展中占有著重要的位置，而巨噬細(xì)胞則是調(diào)節(jié)炎性疾病的一個(gè)靶細(xì)胞，當(dāng)免疫系統(tǒng)受到自身抗體或者特殊抗原的刺激時(shí)，巨噬細(xì)胞釋放各種炎癥因子和趨化因子，如白介素(interleukin，IL-6)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF- α)、前列腺素 E2(prostaglandin E2，PGE2)等［6］，引起細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)平衡失調(diào)，在炎癥過(guò)程中起著重要的作用。目前關(guān)于山銀花對(duì)炎癥因子的調(diào)控作用的研究較少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)脂多糖(LPS)刺激RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞系建立炎癥細(xì)胞模型，測(cè)定灰氈毛忍冬不同極性萃取部位對(duì)該炎癥模型細(xì)胞中炎癥因子分泌量的影響，從細(xì)胞水平研究灰氈毛忍冬抗炎活性，為研究灰氈毛忍冬的抗炎活性及其作用機(jī)制提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 細(xì)胞

RAW264.7細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所細(xì)胞庫(kù)。

1.2 試劑與藥材

供試藥材灰氈毛忍冬來(lái)自于貴州，經(jīng)鑒定為忍冬科忍冬屬灰氈毛忍冬的花。а-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)CS)、PBS、L- 谷氨酰胺、二甲基亞砜(DMSO)、脂多糖(LPS)、ELISA試劑盒(sigma)、地塞米松(sigma)。

1.3 儀器

高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司，1260);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器公司，RE-52AA);真空干燥箱(BZF-50 VACUUM OVEN);電子天平(FA1004);循環(huán)水式多用真空泵(GZX-9146MBE);低速大容量離心機(jī)(Heal Force Neofμge23R);CO2培養(yǎng)箱(3111，Thermo Fisher Scientific)，倒置熒光顯微鏡(XD20-RFL，寧波舜宇儀器有限公司)，超凈工作臺(tái)(SW-CJ-1FD，蘇州凈化設(shè)備有限公司);酶標(biāo)儀(1510，Thermo Fisher Scientific)。

2 方法

2.1 灰氈毛忍冬不同極性萃取部位的制備

取灰氈毛忍冬過(guò)2號(hào)篩粉末20 g，按1∶10的料液比加入200 mL 75%甲醇回流提取兩次，每次2 h，過(guò)濾后合并濾液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮成浸膏狀。然后加入200 mL蒸餾水溶解制成混懸液，依次加入100 mL石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、水飽和的正丁醇萃取，連續(xù)萃取2次，萃取剩余部分為水部分，回收各部位萃取溶劑于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干，再于真空干燥箱內(nèi)烘干。最終依照極性大小順序得到水、水飽和的正丁醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚等5個(gè)萃取部位樣品粉末。將5個(gè)萃取部位樣品粉末用DMSO溶解后，于實(shí)驗(yàn)前用а-MEM培養(yǎng)液分別配制成濃度為100、200、400 μg/mL的樣品溶液。

2.2 RAW 264.7細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠單核巨噬細(xì)胞系 RAW 264.7細(xì)胞在37℃、5%CO2條件下，用含10%胎牛血清的 α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，2天換一次培養(yǎng)基，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期備用。

2.3 不同極性萃取部位對(duì)RAW 264.7細(xì)胞活性的影響

采用MTT法檢測(cè)不同極性萃取部位對(duì)RAW264.7細(xì)胞活性的影響。待RAW264.7細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期后，加1 mL 0.25%胰酶消化40 s，再加入3 mLα-MEM培養(yǎng)基吹打消化，調(diào)整細(xì)胞密度為8×105mL-1，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔定容 100 μL。于37℃、5%CO2條件培養(yǎng)4 h 后，每孔加100 μL配制好的濃度分別為100、200和400 μg/mL的五個(gè)萃取部位的樣品溶液，同時(shí)設(shè)立正常組(只加細(xì)胞和培養(yǎng)基)、LPS組(加入LPS刺激)和調(diào)零孔(不加細(xì)胞，只加培養(yǎng)基)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)每孔加100 μL濃度為 10 μg/mL的LPS刺激，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)72 h加入20 μL濃度為5 mg/mL MTT溶液，37℃培養(yǎng)4 h后，小心吸取上清液，加入150 μL的DMSO，充分震蕩使結(jié)晶溶解后，于570 nm下測(cè)各孔的OD值，并計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率［7］。

細(xì)胞相對(duì)增殖率(%)=(實(shí)驗(yàn)孔-調(diào)零孔)/(對(duì)照孔-調(diào)零孔)×100%

2.4 ELISA法檢測(cè)不同極性萃取部位對(duì)IL-6和TNF-α的抑制作用

待RAW264.7細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期后，加1 mL 0.25%胰酶消化40 s，再加入3 mL α-MEM培養(yǎng)基吹打消化，調(diào)整細(xì)胞密度為8×105mL-1，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔定容100 μL。于37℃、5%CO2條件培養(yǎng)4 h后，每孔加100 μL配制好的濃度分別為100、200和400 μg/mL的五個(gè)萃取部位的樣品溶液，同時(shí)設(shè)立正常組、LPS組、地塞米松組(20 μg/mL)和調(diào)零孔，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)每孔加100 μL濃度為10 μg/mL的 LPS刺激，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h后按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)IL-6和TNF-α的表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1 不同極性萃取部位對(duì)RAW264.7細(xì)胞活性的影響

五個(gè)萃取部位對(duì)RAW264.7細(xì)胞相對(duì)增殖率的影響見(jiàn)表1。細(xì)胞毒性分級(jí)［8］見(jiàn)表2。

表1 五個(gè)極性萃取部位對(duì)RAW264.7細(xì)胞相對(duì)增殖率的影響(x- ± s，n=3)Tab.1 The effect of concentrations of five extraction parts with different polarities on the RGR of RAW264.7 cell(x-±s，n=3)

表2 細(xì)胞相對(duì)增殖率和細(xì)胞毒性分級(jí)Tab.2 Relative cell proliferation rate and cell toxicity grading

表3 五個(gè)極性萃取部位對(duì)RAW264.7細(xì)胞毒性分級(jí)Tab.3 Five polar extraction parts on the toxicity grading of RAW264.7 cell

由表1、2、3可知，五個(gè)萃取部位不同濃度(100、200、400 μg/mL)作用 RAW 264.7 細(xì)胞72 h，與正常組比較，水部位和水飽和正丁醇部位(200、400 μg/mL)對(duì)細(xì)胞的活力有一定的抑制，其細(xì)胞毒性分級(jí)為1，并且有濃度依賴(lài)性。而水飽和正丁醇部位(100 μg/mL)和其它組在此濃度下對(duì)細(xì)胞活力無(wú)抑制作用。說(shuō)明在大的極性萃取部位，所含的多種化學(xué)成分對(duì)于RAW264.7細(xì)胞有相對(duì)較大的抑制作用。

3.2 IL-6標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立

IL-6標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 IL-6標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1 IL-6 standard curve

由圖1可知，OD值在IL-6濃度為15 ng/L到480 ng/L范圍之間的線(xiàn)性關(guān)系良好，回歸方程為y=285.71x-51.26，相關(guān)系數(shù)R2=0.993 8。

3.3 TNF-α標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立

TNF-α標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 TNF-α標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.2 TNF-αstandard curve

由圖2可知，OD值在TNF-α濃度為20 ng/L到640 ng/L范圍之間的線(xiàn)性關(guān)系良好，回歸方程為y=357.14x-66.86，相關(guān)系數(shù)R2=0.993 3。

3.4 不同極性萃取部位對(duì)IL-6和TNF-α的表達(dá)量的影響結(jié)果

五個(gè)部位、三個(gè)樣品濃度對(duì)RAW264.7細(xì)胞炎癥模型中IL-6和TNF-α的表達(dá)量的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4和表5。表中IL-6和TNF-α的表達(dá)量用±s(ng/L)表示，組間的顯著性差異用one-way ANOVA顯著性分析。

表4 五個(gè)極性萃取部位不同樣品濃度對(duì)IL-6表達(dá)量的影響(x- ± s，n=3)Tab.4 The effect of concentrations of five polar extraction parts on the expression of IL-6(x- ± s，n=3)

由表4可知，LPS對(duì)照組IL-6的表達(dá)量極顯著性高于正常組的表達(dá)量，P＜0.01;同時(shí)與LPS對(duì)照組IL-6表達(dá)量199.94 μg/mL相比，地塞米松組IL-6 表達(dá)量為137.88 μg/mL，P ＜0.01，說(shuō)明地塞米松對(duì)IL-6表達(dá)量有極顯著地抑制作用;各個(gè)萃取部位中，除了石油醚部位(100 μg/mL)對(duì)IL-6表達(dá)量沒(méi)有顯著性的抑制作用外，石油醚部位(200 μg/mL)對(duì)IL-6表達(dá)量有顯著性的抑制作用，P＜0.05;其它各個(gè)部位對(duì)IL-6表達(dá)量均有極顯著地抑制作用，P＜0.01，并且其抑制作用都有濃度依賴(lài)性。相比較而言，其中以乙酸乙酯部位和二氯甲烷部位對(duì)IL-6表達(dá)量的抑制作用最為明顯。

由表5可知，LPS對(duì)照組TNF-α的表達(dá)量極顯著性高于正常組的表達(dá)量，P＜0.01;同時(shí)與LPS對(duì)照組TNF-α表達(dá)量200.96 μg/mL相比，地塞米松組 TNF-α表達(dá)量156.98 μg/mL，P＜0.01，說(shuō)明地塞米松對(duì)TNF-α表達(dá)量有極顯著地抑制作用;各個(gè)萃取部位中，除了水部位(100 μg/mL)對(duì)TNF-α表達(dá)量沒(méi)有顯著性的抑制作用外，其它各個(gè)部位對(duì)IL-6表達(dá)量均有極顯著地抑制作用，P＜0.01，并且其抑制作用都有濃度依賴(lài)性。相比較而言，其中以水飽和正丁醇部位和乙酸乙酯部位對(duì)TNF-α表達(dá)量的抑制作用最為明顯。

表5 五個(gè)極性萃取部位不同樣品濃度對(duì)TNF-α表達(dá)量的影響(x- ± s，n=3)Tab.5 The effect of concentrations of five polar extraction parts on the expression of TNF-α(x-±s，n=3)

4 討論

4.1 RAW264.7細(xì)胞作為一種巨噬細(xì)胞，受到脂多糖外界刺激后能夠啟動(dòng)體內(nèi)炎癥介質(zhì)產(chǎn)生，并啟動(dòng)機(jī)體抵抗炎癥系統(tǒng)的功能［9］。RAW264.7細(xì)胞在受到LPS刺激后，通過(guò)脂多糖結(jié)合蛋白 CD14受體和Toll樣受體4等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，激活轉(zhuǎn)錄因子細(xì)胞核因子κB(NF-κB)和活化蛋白-1，引起各種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的過(guò)度表達(dá)，觸發(fā)機(jī)體內(nèi)的炎癥瀑布連鎖反應(yīng)，進(jìn)一步引起全身炎癥反應(yīng)綜合征［10］。

4.2 本實(shí)驗(yàn)選擇RAW264.7細(xì)胞作為研究對(duì)象，采用LPS刺激，建立炎癥模型以研究灰氈毛忍冬各個(gè)極性萃取部位對(duì)炎癥因子的調(diào)控。經(jīng)LPS刺激后，炎癥因子IL-6和TNF-α的表達(dá)量明顯上調(diào)，表明此炎癥細(xì)胞模型成功構(gòu)建。在應(yīng)用灰氈毛忍冬各個(gè)極性萃取部位后，可以劑量依賴(lài)性的抑制炎癥因子IL-6和TNF-α的表達(dá)，說(shuō)明灰氈毛忍冬各個(gè)極性萃取部位均可通過(guò)抑制炎癥因子參與炎癥反應(yīng)的過(guò)程。

4.3 在此次實(shí)驗(yàn)之前，本課題組對(duì)NO的表達(dá)也進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)灰氈毛忍冬各個(gè)極性萃取部位對(duì)NO的表達(dá)有明顯的劑量依賴(lài)性和萃取部位的極性依賴(lài)性。表明灰氈毛忍冬各個(gè)極性萃取部位可以通過(guò)調(diào)控炎癥因子NO、IL-6和TNF-α的表達(dá)而參與炎癥反應(yīng)的過(guò)程。已知在巨噬細(xì)胞系統(tǒng)中有眾多的信號(hào)通路和炎癥介質(zhì)參與炎癥反應(yīng)，如通過(guò)抑制信號(hào)通路 CD14［11］、PKC［12］、NF- κB［13］、AP-1等多層次、多靶點(diǎn)調(diào)控IL-6、TNF-α和IL-β等炎癥介質(zhì)的表達(dá)，從而發(fā)揮抗炎作用?；覛置潭泻卸鄠€(gè)化學(xué)成分，其抗炎功效的具體有效成分，以及其保護(hù)作用是否涉及其他的分子作用機(jī)制，還有待繼續(xù)研究。

［1］中華人民共和國(guó)藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典［S］.一部.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:21.

［2］中華人民共和國(guó)藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典［S］.一部.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010:28.

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