羅 霞，文曉鵬

(1.貴州大學(xué)貴州省農(nóng)業(yè)生物工程研究院，貴州 貴陽(yáng) 550025;2.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025;3.貴州大學(xué)山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025)

基因表達(dá)分析技術(shù)在轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行基因表達(dá)定量分析時(shí)，通常使用看家基因(housekeeping genes)作為內(nèi)參基因(reference genes)對(duì)目標(biāo)基因(target gene)表達(dá)量進(jìn)行校正［1］，以期獲得真實(shí)可靠的結(jié)果。UQT基因和18s rRNA基因在核苷酸上具有高度的保守性和同源性，并在各種組織中表達(dá)相對(duì)恒定，因而，常被作為研究其他基因的表達(dá)模式及調(diào)控機(jī)制的分子內(nèi)標(biāo)［2，3］。

火龍果(Hylocereus undatus)是近年來(lái)廣泛關(guān)注的一種新興熱帶亞熱帶果樹，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值［4］。樊慶杰等［5］研究表明，火龍果的抗旱基因資源尤其豐富。深入探討這些基因的表達(dá)調(diào)控規(guī)律需要內(nèi)參基因作為數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化的對(duì)照。本文采用同源克隆法從火龍果中克隆了UQT和18s rRNA基因片段并分析其表達(dá)，為了解基因調(diào)控表達(dá)的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為培養(yǎng)70 d后的紅龍果、紅龍、B7(白肉種質(zhì)1)、B4(白肉種質(zhì)2)和紫紅龍，以及干旱脅迫處理的紫紅龍組培苗的莖段。

1.2 方法

1.2.1 干旱脅迫處理 用10%PEG處理生根紫紅龍組培苗24 h、3 d、5 d、7 d和10 d。采集莖段，液氮速凍后置-80℃的超低溫冰箱保存。

1.2.2 總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄 用Trizol(天根生化科技有限公司，DP405)試劑提取保存的火龍果莖段總RNA，對(duì)提取的總RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度檢測(cè)。按照Quant cDNA第一鏈合成試劑盒(天根生化科技有限公司，KR103)說明書操作進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。

1.2.3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中已報(bào)道的植物UQT和18s rRNA基因序列，運(yùn)用Premier 5.0軟件、DNAMAN分析軟件及BLAST程序，設(shè)計(jì)了2對(duì)擴(kuò)增保守區(qū)的引物。UQT基因的引物 U1，5’-GATTTATTTCATTGGCAGGC-3’和 U2，5’-AGGATCATCAGGATTTGGGT-3’，其目的片段為270 bp;18s rRNA基因的引物為S1，5’-TTAGGCCATGGAGGTTTCTCA-3’和 S2，5’-GAGTTGATGACACGCGCTTA-3’，其目的片段為209 bp。引物合成由上海生工生物技術(shù)公司完成。

1.2.4 RT-PCR擴(kuò)增UQT基因和18s rRNA基因

PCR擴(kuò)增體系都采用60 ul反應(yīng)體系:2xMaster Mix 30 μl，ddH2O 21 μl，primer1 為 3 μl，primer2 為3 μl，cDNA 為 3 μl。UQT 基因擴(kuò)增條件:94℃ 預(yù)變性4 min;94℃變性30 s;58℃退火30 s;72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7 min。18s rRNA基因擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性4 min;94℃變性30 s;55℃退火30 s;72℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。

1.2.5 序列的生物信息學(xué)分析 應(yīng)用NCBI(http://www.ncbi.nlm.Gov)中的ORFfinder程序進(jìn)行開放閱讀框(ORF)分析并將其推導(dǎo)為相應(yīng)的氨基酸序列。通過BLAST工具進(jìn)行核酸序列相似性檢索，應(yīng)用DNAman進(jìn)行比對(duì)結(jié)果生成系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.6 基因表達(dá)分析 使火龍果內(nèi)參基因UBQ和Actin基因?yàn)殛?yáng)性對(duì)照，對(duì)5份火龍果種質(zhì)以及其中一份紅龍果材料在干旱脅迫處理下的表達(dá)特性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA的提取

瓊脂糖凝膠電泳圖和核酸定量檢測(cè)顯示，RNA電泳圖譜帶型清晰。28s rRNA的亮度約為18s rRNA度的2倍，OD值均在1.8～2.0 mg/L。由此可見，RNA樣品的完整性較好，無(wú)明顯降解，可以用于進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 內(nèi)參基因的RT-PCR擴(kuò)增

以總RNA反轉(zhuǎn)錄所得到的第一鏈cDNA為模板，分別進(jìn)行UQT基因和18s rRNA基因RT-RNA擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，分別在約271 bp和209 bp處有1條特異條帶，該序列與預(yù)測(cè)的目的片段大小相符(圖1)。

圖1 火龍果UQT基因和18s rRNA基因的擴(kuò)增Fig.1 Amplification of genes UQT and 18s rRNA from pitaya

2.3 序列分析

經(jīng)測(cè)序和序列分析，結(jié)果表明(圖2，圖3)，271 bp的UQT基因編碼87個(gè)氨基酸序列。且UQT基因的序列和18s rRNA基因的序列與其他植物的UQT基因核苷酸序列的同源性分別為94% ～98%和98%～99%。因此推斷，所克隆得到的片段分別為UQT和18s rRNA基因片斷。將克隆得到的內(nèi)參基因分別命名為HuUQT和Hu18s rRNA。

圖2 UQT基因的cDNA序列及推定氨基酸序列Fig.2 cDNA sequence and amino acid sequence of UQT gene

圖3 HuUQT(A)和Hu18s rRNA(B)與其它植物UQT和18s rRNA的核苷酸序列同源性分析Fig.3 Nucleotide sequence homology analysis of HuUQT and Hu18s rRNA with gene HuUQT and Hu18s rRNA of other plants

2.3 內(nèi)參基因的表達(dá)分析

圖4 HuActin、HuUBQ、HuUQT 和 Hu18S rRNA在火龍果不同種質(zhì)的表達(dá)模式Fig.4 Expression patterns of HuActin，HuUBQ，HuUQT and Hu18S rRNA in different cultivars of pitaya

研究選擇了5份不同種質(zhì)的火龍果和在干旱脅迫下的紫紅龍。對(duì)RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，UQT基因和18s rRNA基因與目前研究中常用的HuUBQ和HuActin基因在不同種質(zhì)中均能一致性表達(dá)(圖4)，說明本次克隆的2個(gè)基因適用于火龍果種質(zhì)之間差異的研究;且UQT基因和18s rRNA基因在干旱脅迫的表達(dá)也均一致(圖5)，表明這2個(gè)基因在分析火龍果抗逆基因表達(dá)模式時(shí)是合適的，且18s rRNA基因的表達(dá)穩(wěn)定性較優(yōu)于其余3個(gè)內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性。

圖5 HuActin、HuUBQ、HuUQT 和 Hu18S rRNA在干旱脅迫下的表達(dá)模式Fig.5 Expression patterns of HuActin，HuUBQ，HuUQT and Hu18S rRNA under drought stress treatment.

3 討論

在追蹤基因表達(dá)的微小變化時(shí)，內(nèi)參基因被用來(lái)作為數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化的對(duì)照，以校正作為模板的cDNA所存在的數(shù)量差異［6］。但是單獨(dú)使用一個(gè)內(nèi)參基因往往不能得到準(zhǔn)確的定量結(jié)果，必須幾個(gè)內(nèi)參基因結(jié)合使用［7］。目前發(fā)現(xiàn)的看家基因有幾百種，迄今，在火龍果研究中，只有HuUBQ和HuActin兩個(gè)內(nèi)參基因被克?。?］。本研究克隆的UQT基因和18s rRNA基因能有效彌補(bǔ)了火龍果內(nèi)參基因的不足和豐富了NCBI中火龍果內(nèi)參基因。

UQT基因和18s rRNA基因是常用的內(nèi)參基因［9］UQT屬于泛素家族基因，廣泛存在于真核細(xì)胞的熱穩(wěn)定多肽，在進(jìn)化上顯示出高度保守性，在介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解、轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)以及應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［10］;18S rRNA的功能同整個(gè)基因譜有關(guān)(負(fù)責(zé)裝配)。近來(lái)越來(lái)越多的研究利用UQT基因和18s rRNA基因作為內(nèi)標(biāo)來(lái)定量，如Song等研究丹參PAL基因的表達(dá)時(shí)用到了UQT作為內(nèi)參［11］，18S rRNA被超過90% 的研究單獨(dú)用作參照基因進(jìn)行定量［12］，魏永贊等在分析荔枝的內(nèi)參基因克隆及穩(wěn)定性的研究中，表明UQT基因和18s rRNA基因在表達(dá)中有較好的穩(wěn)定性［13］。

本次研究中克隆了271 bp的UQT基因片段和209 bp的18s rRNA基因片段，UQT基因編碼了87個(gè)氨基酸。通過序列分析，UQT基因核苷酸序列與蓖麻、馬鈴薯、大豆同源性達(dá)78%以上。18s rRNA基因核苷酸序列與絨毛槐、兔尾草、陸地棉、杜仲同源性達(dá)98%以上，且兩內(nèi)參基因在干旱脅迫下和品種間表達(dá)較保守，進(jìn)一步證明了UQT基因編碼的是一種高度保守。選擇幾個(gè)內(nèi)參基因作參照有助于得到更為可靠的表達(dá)結(jié)果，這在大豆［6］、葡萄［14］、楊樹［6］中已被證實(shí)，因此本研究克隆的UQT基因和18s rRNA基因?yàn)槟苓M(jìn)一步準(zhǔn)確研究抗逆相關(guān)基因的表達(dá)奠定基礎(chǔ)，為研究火龍果的基因表達(dá)提供了參照序列和參考依據(jù)。

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