冉 霞，牟 蘭

(1.貴陽醫(yī)學(xué)院化學(xué)教研室，貴州 貴陽 550025;2.貴州省煙草品質(zhì)研究重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

紅外光譜技術(shù)是一種定性定量的分析測試技術(shù)，因其分析簡便、快速、低成本、無污染、不需非破壞樣品且可多組分同時測定等優(yōu)點，成為近年來發(fā)展迅速的一種綠色分析技術(shù)。該技術(shù)在種草藥成分檢測與質(zhì)量控制方面已相對比較成熟。紅外光譜在中藥材及其制劑的定性、定量及分類鑒定方面的研究很多［1-3］。將藥材視為混合物，所含各種化學(xué)成分只要在質(zhì)和量方面相對穩(wěn)定，統(tǒng)一樣品處理，則所得紅外光譜相對穩(wěn)定，得到混合物的紅外光譜具有一定的客觀性和可重復(fù)性［4］。近年來近紅外分析技術(shù)在煙草化成分分析、煙氣分析、煙葉類型與產(chǎn)地判別及物理指標(biāo)測定、在線檢測等方面得到廣泛應(yīng)用［5，6］。McClure［7］等對產(chǎn)自 16 個國家的1600多個樣品進(jìn)行了基于近紅外光譜的分類研究，經(jīng)數(shù)學(xué)方法建模后，對煙葉品種或產(chǎn)地均得到了很好判別。宋怡等［8］應(yīng)用傅立葉變換近紅外光譜，測定了煙草樣品的光譜數(shù)據(jù)，建立了快速分析并預(yù)測煙草中植物色素數(shù)學(xué)模型。而利用中紅外光譜技術(shù)對煙葉研究鮮為報道。

貴州是煙草種植大省，獨特的生態(tài)環(huán)境造就了煙葉與眾不同的質(zhì)量和風(fēng)格特色。貴州煙葉的風(fēng)格界定一直沿用傳統(tǒng)的介于“濃香”與“清香”之間的“中間香”型，其山地?zé)熑~的特征彰顯不夠明確。近年來，有專家提出了貴州煙葉的香型風(fēng)格可細(xì)化分為兩類［9-11］，其中分布于黔中、黔南、黔北、黔東植區(qū)煙葉劃為山地“醇甜香”型，而西部地區(qū)的黔西南、黔西北區(qū)域劃分為山地“清甜香”香型。本文以貴州典型植煙地區(qū)特色優(yōu)質(zhì)煙葉為研究對象，利用紅外光譜技術(shù)，研究了煙葉的紅外特征光譜及貴州不同地區(qū)煙葉的紅外光譜的差異，并結(jié)合統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行聚類分析，建立鑒別貴州“清甜香”型和“醇甜香”型兩類不同香型風(fēng)格烤煙的快速檢測方法，為快速判斷煙草風(fēng)格品質(zhì)提供參考。

1 材料及方法

1.1 材料

貴州典型植煙區(qū)代表性的C3F煙葉各2 kg，由貴州省煙草品質(zhì)研究重點實驗室提供，共125個。其中黔西北植煙區(qū)的威寧縣、黔西縣、畢節(jié)市、大方縣、金沙縣、赫章縣6個采樣點共47個樣，黔西植煙區(qū)的盤縣、水城2個采樣點共14個樣，黔西南植煙區(qū)的興義縣、普安縣2個采樣點共17個樣，黔東南植煙區(qū)的鎮(zhèn)遠(yuǎn)縣、天柱縣2個采樣點共17個樣，黔北植煙區(qū)有綏陽縣、道真縣、湄潭縣3個采樣點共13個樣，黔東北植煙區(qū)有德江縣、石阡縣、印江縣三個采樣點共8個樣，黔南植煙區(qū)的甕安縣、貴定縣2個采樣點共7個樣。樣品于40℃烘箱干燥6h，粉碎，過40目篩，放入冰箱備用。

1.2 儀器藥品

IR Affinity-1紅外光譜儀(SHIMADZU)，粉碎機(jī)，200目篩，天平，保干器，壓片機(jī)，瑪瑙研缽，KBr(光譜純)。

1.3 實驗方法

一維紅外光譜:各煙葉樣品粉碎過200目篩后，準(zhǔn)確稱取KBr和樣品按100∶1的比例充分混合研磨均勻，定量取混合均勻的樣片壓片，盡量保證每一片的厚度均勻，于IR Affinity-1紅外光譜儀測定其后外吸收，獲得一維紅外光譜。

二階導(dǎo)數(shù)譜:采用SHIMADZU公司的IR Affinity-1軟件中的求導(dǎo)功能，選擇3點基線校正，13平滑因子平滑，獲得各樣品的紅外二階導(dǎo)數(shù)譜圖。

測試條件:掃描范圍:400～5 000 cm-1，掃描次數(shù):20次，分辨率:1.0 cm-1。

數(shù)據(jù)處理:采用SHIMADZU公司的IR Affinity-1軟件及其求導(dǎo)功能分別對不同地區(qū)煙葉樣品一維紅外光譜及二階導(dǎo)數(shù)譜的光譜特征進(jìn)行分析，同時利用PSS 17.0統(tǒng)計分析軟件，利用組間聯(lián)接的聚類方法中的“平方歐式距離”度量標(biāo)準(zhǔn)對不同地區(qū)煙葉樣品的平均透光率進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 穩(wěn)定性和重現(xiàn)性考察

取同一樣品供試片連續(xù)測定3次，測量結(jié)果如圖1所示。重復(fù)測定3次所得到的紅外譜圖非常相似，從其重疊譜圖可知，3次測定譜圖基本一致，譜圖間相關(guān)系數(shù)分別為1.000 0、1.000 0、0.999 9。

圖1 紅外光譜精密度(左:展開圖;右:重疊圖)Fig.1 Precision of IR(Left:expanded;right:overlays)

同一份樣品，分別取樣3次進(jìn)行壓片測量，所得紅外光譜圖比較一致，如圖2所示，譜圖間相關(guān)系數(shù)分別為 1.000 0、0.998 5、0.998 9。

圖2 紅外光譜重現(xiàn)性(左:展開圖;右:重疊圖)Fig.2 Reproducibility of IR(Left:expanded;right:overlays)

2.2 煙草紅外光譜特征

煙草樣品紅外光譜特征如圖3所示，主要在1 053、1 630、2 952、3 400 cm-1附有較強(qiáng)的吸收。在3 700-3 000 cm-1波數(shù)之間的3 400 cm-1主要歸屬為υ-OH吸收，2 952 cm-1附近的吸收峰主要歸屬為亞甲基的對稱伸縮振動和反對稱伸縮振動，1 630 cm-1附近的吸收峰主要是υC=O歸屬吸收峰，在500-800 cm-1(指紋區(qū))和1 250-1 400 cm-1兩個區(qū)域有較為復(fù)雜的吸收峰。

圖3 煙草樣品紅外光譜特征Fig.3 Characteristics of tobacco samples by IR

2.3 不同地區(qū)煙葉紅外光譜特征

由圖4可知，不同地區(qū)煙葉樣品的紅外譜圖相似，說明各樣品的成分大致相同。即便如此，各地區(qū)樣品的紅外光譜仍有一定的差異，如黔東南、銅仁兩地在780、1 317 cm-1兩處吸收峰較為明顯，而其他地區(qū)相對較弱。說明各地區(qū)煙葉所含的某些化合物存在差異。

圖4 不同地區(qū)煙葉紅外吸收光譜Fig.4 Infrared absorption spectrum of tobacco from different regions

二階導(dǎo)數(shù)譜可以在一定程度上剝離譜圖的重疊峰，減少譜圖的疊加，提高譜圖分辨率。為了進(jìn)一步驗證不同地區(qū)煙葉紅外光譜的差異，對不同地區(qū)煙草樣品的紅外光譜求導(dǎo)(圖5)。各地區(qū)煙草的二階導(dǎo)數(shù)譜在500～1 000 cm-1和1 500～2 000 cm-1兩個吸收帶存在差異，尤其是在1 500～2 000 cm-1特征性較明顯，其中六盤水、銅仁、遵義三個地區(qū)的二階導(dǎo)數(shù)譜在1 500～2 000 cm-1吸收峰較多，大致是因為不同地區(qū)煙葉所含碳氧雙鍵基團(tuán)類化合物差異所致。

紅外光譜吸收峰的差異主要表征各煙葉樣品組成成分之間的差異，而吸收峰的強(qiáng)度大小則說明樣品的成分含量間的特征。 表1列出了部分樣品605、1 053、1 436、1 630、2 952 cm-1附近五個特征峰的透光率，從中可見同一地區(qū)各樣品特征之間峰透光率差異不大，相對偏差RSD≤3.42%;不同地區(qū)樣品特征峰的透光率存在較大的差異，相對偏差RSD≥8.53%。表2列出了不同地區(qū)各煙葉樣品紅外特征峰的平均透光率。

圖5 不同地區(qū)煙葉的紅外二階導(dǎo)數(shù)譜Fig.5 Second derivative spectra of tobacco from different regions

2.4 不同地區(qū)煙葉紅外光譜透光率特征

2.4.1 不同地區(qū)煙葉紅外特征峰透光率特征

表1 不同樣品紅外特征峰的透光率Tab.1 Transmittance of IR characteristic peaks in different samples

表2 不同地區(qū)煙葉樣品紅外特征峰的透光率Tab.2 Transmittance of IR characteristic peaks in tobacco samples from different regions

2.4.2 不同地區(qū)煙葉紅外光譜透光率聚類分析用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件的組間聯(lián)接聚類方法中“平方歐式距離”度量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，得到不同地區(qū)煙葉紅外特征吸收峰透光率的樹狀聚類圖(圖6)。在距離系數(shù)為3.5時，黔西南、黔西北地區(qū)的畢節(jié)、六盤水、黔西南所屬“清甜香”型煙區(qū)域樣品能很好的聚為一類，說明“清甜香”型風(fēng)格的煙葉紅外特征性非常明顯。距離系數(shù)為8時，能將特征吸光度按地區(qū)聚為三類(第一類:畢節(jié)、六盤水、黔西南、銅仁;第二類:黔東南、遵義;第三類:黔南)。

圖6 不同地區(qū)煙葉紅外特征峰透光率樹狀聚類圖Fig.6 Cluster dendrogram of characteristic peaks’transmittance of tobacco from different regions

3 結(jié)論

紅外特征光譜表明，在400～3 000 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)具有605、1 053、1 436、1 616、2 952 cm-1五個明顯的特征峰。各地區(qū)煙草的二階導(dǎo)數(shù)譜在500～1 000 cm-1和1 500～2 000 cm-1兩個吸收帶存在差異。其中六盤水、銅仁、遵義三個地區(qū)的二階導(dǎo)數(shù)譜在1 500～2 000 cm-1吸收峰較多，大致是因為不同地區(qū)煙葉所含碳氧雙鍵類化合物差異所致。

紅外光譜透光率特征表明:同一地區(qū)各樣品特征之間峰透光率差異不大，而不同地區(qū)樣品特征峰的透光率存在較大的差異。利用紅外特征峰透光率聚類，能很好的將所屬“清甜香”型煙區(qū)域樣聚為一類，說明“清甜香”型風(fēng)格的煙葉紅外特征性非常明顯。

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