余道平，彭啟新，胡庭興，謝孔平，李小杰

(1.四川省自然資源科學(xué)研究院，四川成都 610041;2.四川省生物資源保護與可持續(xù)利用重點實驗室，四川成都 610041;3.峨眉山生物資源實驗站，四川峨眉山 614201;4.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，四川雅安 625000)

楨楠(Phoebe zhennan)為樟科(Lauraceae)楠屬(Phoebe Nees)高大喬木，產(chǎn)于四川、陜西、云南等省。野生海拔1 100 m以下，分布區(qū)位于亞熱帶常綠闊葉林區(qū)西部，四川、湖北西部和貴州西部都有分布。楨楠是我國二級保護樹種，樹干高大、通直、挺拔，樹冠濃蔭，四季常青，常見于風(fēng)景名勝區(qū)、寺廟等。在園林上常作為庭蔭樹或行道樹，為我國著名的觀賞樹種之一。在植物的一個胚珠中包含兩個或兩個以上種胚的現(xiàn)象稱為多胚現(xiàn)象［1］。楨楠的多胚現(xiàn)象已有部分報道［2，3］，但對楨楠多胚的形態(tài)特征和多胚著生位置等研究報道不多。本研究觀察了楨楠多胚種子的形態(tài)特征及多胚苗的生長情況，觀察了多胚苗體細胞染色體數(shù)目，旨在了解楨楠多胚形態(tài)特征和多胚苗的生長發(fā)育情況，并探討其遺傳基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

楨楠種子于2013年11月初采自峨眉山海拔1 000 m分布區(qū)，種子經(jīng)揉撮除去外種皮，沖洗干凈后用濕沙儲藏備用。

1.2 方法

1.2.1 多胚形態(tài)及其發(fā)育觀察

2014年3月將楨楠種子沿著種縫掰開，觀察多胚種子中胚的形態(tài)與著生位置，并統(tǒng)計多胚率。將種子播于穴盤中培養(yǎng)，觀察多胚苗的形態(tài)特征及生長發(fā)育狀況。

1.2.2 多胚苗體細胞染色體數(shù)目鑒定

切取單胚種子和多胚種子萌發(fā)的幼嫩根尖為材料，用0.002 mol·L-18-羥基哇琳預(yù)處理 5 h，4℃冰箱中卡諾固定液固定20 h，在1 mol·L-1鹽酸中(水浴60℃)溶液解離7 min～8 min，取出用水漂洗，切取根尖置于載玻片上，改良品紅染液染色，過一下酒精燈(充分著色)放置約10 min，壓蓋玻片，敲片，于100倍油鏡下觀察30個細胞，統(tǒng)計染色體數(shù)目并拍照。

2 結(jié)果和分析

2.1 多胚現(xiàn)象觀察結(jié)果

通過對450粒楨楠種子的觀察，多胚種子數(shù)共56粒，多胚率為12.4%。多胚種子胚數(shù)有2胚、3胚、4胚，依胚數(shù)可把楨楠多胚種子分為雙胚型、3胚型、4胚型。其中雙胚出現(xiàn)的頻率較高，占9.0%，3胚率為2.4%，4胚率0.6%。

2.2 胚的形態(tài)與著生位置

楨楠多胚種子在外形和內(nèi)部結(jié)構(gòu)上與單胚種子有些差別，多胚種子外形不規(guī)整，有凸起，且2-4瓣。單胚種子的胚著生在種子的底部，子葉朝向種子頂部，胚具有發(fā)育完整的子葉和胚軸。本研究發(fā)現(xiàn)楨楠種子多胚的形態(tài)及其著生部位存在多樣性，如圖2所示。從多胚種子中切取胚進行胚形態(tài)的觀察，發(fā)現(xiàn)胚有大胚和小胚之分，大胚的形態(tài)大小和生長發(fā)育狀況與單胚種子的胚一致，胚發(fā)育正常;小胚個體小，有些發(fā)育完整，有胚軸和子葉，一些發(fā)育不完整。對胚的著生位置觀察后發(fā)現(xiàn)，單胚種子的胚一般著生在種子的底部，而多胚種子的胚可出現(xiàn)在種子的底部、頂部、中部和中部的兩側(cè);雙胚有緊靠著的，有分開的。依多胚在種子內(nèi)的著生位置可將雙胚種子初步劃分為3種類型:(1)雙胚緊靠著生在種子底部(圖2-B，E)，(2)雙胚緊靠著生在種子中部的兩側(cè)(圖1-F，G);(3)雙胚分離著生(一胚在種子底部，一胚在種子中部或頂部)(圖1-C，D，H)。3胚種子一般分離著生，一胚著生在種子底部，另兩胚在種子中上部(圖1-I，J，K)。4胚種子中的大胚著生在種子底部，其他3胚分離著生在種子中部或頂部(圖1-L)。

圖1 楨楠多胚形態(tài)和位置示意圖Fig.1 The shape and position of polyembryony in Phoebe zhennan seeds

2.3 多胚再生植株的生長發(fā)育狀況

多胚種子在穴盤里培養(yǎng)20 d后開始發(fā)芽，經(jīng)40 d的生長發(fā)育，發(fā)現(xiàn)多胚苗在長勢，個體大小，根、莖、葉器官發(fā)育等性狀上各異;多胚苗存在大、小株，同株的比率少，多胚植株均具有自己獨立的根和莖，在所觀察的幼苗中，未發(fā)現(xiàn)多胚苗連體或無胚軸或無根等現(xiàn)象。雙胚植株的形態(tài)可歸納為兩種類型:(1)雙同株，即兩植株大小、長勢相同、生長發(fā)育正常(圖2-A);(2)大小株，即兩植株生長發(fā)育正常、但一株長勢正常另一株長勢稍弱(圖2-B)。在3胚和4胚再生植株中，可見1～2個植株生長正常，其余的長勢較弱(圖2-C)。

圖2 多胚植株發(fā)育狀況Fig.2 Developmental status of polyembryonic seedlings

2.4 多胚植株體細胞染色體數(shù)目鑒定結(jié)果

對楨楠單胚植株、多胚植株進行體細胞染色體數(shù)目鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們的體細胞染色體數(shù)目相同，均為二倍體(2n=24)(圖3)，未發(fā)現(xiàn)染色體數(shù)目異常的情況，說明楨楠多胚植株是二倍體植株。

圖3 楨楠多胚苗體細胞染色體Fig.3 Somatic chromosomes of Phoebe zhennan polyembryonic seedlings(2n=24)

3 結(jié)論與討論

由1粒多胚種子可以同時萌發(fā)出兩株或兩株以上的幼苗，這種一籽多苗稱之為多胚苗［4］。有許多研究表明植物的多胚現(xiàn)象與其無融合生殖現(xiàn)象具有一定的相關(guān)性。因此許多學(xué)者試圖尋找多胚苗材料，進而從中篩選出具有無融合生殖特性的基因資源［5～6］。本試驗是通過解剖、觀察胚的形態(tài)來判斷楨楠的單胚、多胚比率和胚著生位置的，這與張蕾［7］的研究方法較為一致，而黃宇［8］、莫饒等［9］是依據(jù)多胚苗形成情況來判定的。本研究發(fā)現(xiàn)楨楠多胚率為12.4%，多胚在種子內(nèi)的位置不定，且形成的多胚苗的生長發(fā)育也有差異。對于楨楠多胚的形成是否為無融合生殖還有待于進一步弄清其胚胎發(fā)育特性，以及多胚發(fā)生頻率是否與其遺傳基因、環(huán)境因子有關(guān)，都還有待于進一步研究，這將對其開展育種工作具有重大意義。

本研究還對楨楠單胚苗、多胚苗的體細胞染色體數(shù)目進行了鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單胚苗、多胚苗均為二倍體材料(2n=24)，這與莫饒等［10］在芒果多胚研究中的結(jié)果一致。為了了解多胚種子后代在遺傳基因上的關(guān)系，還需進一步開展其染色體核型分析、SSR標(biāo)記等研究。

［1］黃群策，孫敬三.被子植物多胚苗的研究進展［J］.植物學(xué)通報，1998，15(2):1～7.

［2］余道平，彭啟新，李小杰，等.細葉楠穴盤育苗技術(shù)［J］.林業(yè)實用技術(shù)，2012(12):39～40.

［3］舒金枝.楨楠容器育苗［J］.廣西林業(yè)科學(xué)，2009，38(3):45～46.

［4］馮輝，翟玉瑩.韭菜多胚苗及其與無融合生殖關(guān)系的研究［J］.園藝學(xué)報，2007，34(1):225～226.

［5］馮輝，趙鐘志.韭菜無融合生殖的遺傳特性及其與多胚性關(guān)系的研究［J］.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2010，41(3):270～274.

［6］張斯淇，徐強，鄧秀新.無融合生殖與柑橘多胚現(xiàn)象的研究進展［J］.植物科學(xué)學(xué)報，2014，32(1):88～96.

［7］張蕾，葛鈞.平邑甜茶多胚現(xiàn)象研究［J］.安徽農(nóng)學(xué)通報，2008，14(21):61～62.

［8］黃宇.閩楠種子萌發(fā)與多胚苗研究［J］.福建林業(yè)科技，2014，41(3):27～31.

［9］莫饒 ，鄭成木，朱穩(wěn)，等.咖啡多胚現(xiàn)象與多胚苗形態(tài)發(fā)育的研究［J］.植物學(xué)通報，2004，21(2):189～194.

［10］莫饒，羅遠華，周世民，等.幾個芒果品種的胚性及多胚苗遺傳分析［J］.熱帶亞熱帶植物學(xué)報，2005，3(6):475～479.