劉盛榮 張維瑞 柯斌榕 劉新銳 吳小平*

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基于拮抗試驗(yàn)的杏鮑菇菌株分類(lèi)研究

劉盛榮1張維瑞1柯斌榕2劉新銳2吳小平2*

（1.寧德師范學(xué)院生物系，福建 寧德 352100；2.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心，福建 福州 350002）

利用拮抗反應(yīng)對(duì)全國(guó)各地收集的81株杏鮑菇進(jìn)行分類(lèi)研究。結(jié)果顯示，81個(gè)菌株可分為11個(gè)類(lèi)群，最大群包含25個(gè)菌株，最小群僅含1個(gè)菌株。從中顯示我國(guó)杏鮑菇菌株既具有豐富的遺傳多樣性，又可能存在嚴(yán)重的同物異名現(xiàn)象。

杏鮑菇；拮抗反應(yīng)；分類(lèi)；遺傳多樣性

杏鮑菇（）又名刺芹側(cè)耳，屬擔(dān)子菌亞門(mén)、層菌綱、傘菌目、側(cè)耳科、側(cè)耳屬，是原產(chǎn)于歐洲南部、北非、中亞等地的一種品質(zhì)優(yōu)良的大型傘菌[1]。常發(fā)生于傘形花科刺芹屬刺芹枯死的枝和根的周?chē)Ｔ谖覈?guó)新疆、四川、青海等地有少量分布。杏鮑菇具有味道鮮美、鮮品貨架期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)。我國(guó)于20世紀(jì)90年代引種并進(jìn)行試驗(yàn)性栽培，目前除利用自然季節(jié)規(guī)模栽培外，工廠(chǎng)化設(shè)施栽培在上海、廣東、福建、山東等地區(qū)也已較為普遍。

科研人員對(duì)杏鮑菇的營(yíng)養(yǎng)生理[2,3]、工廠(chǎng)化栽培[4～6]、瓶栽[7]、育種[8～10]等方面進(jìn)行了深入研究，其遺傳多樣性研究也有不少報(bào)道。如尚曉東等[11]利用RAPD分析19株杏鮑菇的遺傳關(guān)系，賀冬梅等[12]通過(guò)酯酶同工酶確定不同杏鮑菇的親緣關(guān)系，馮偉林等[13]以ISSR指紋圖譜研究杏鮑菇遺傳差異。但這些研究所收集的菌株數(shù)量較少，難以真實(shí)反映我國(guó)杏鮑菇整體情況。因此收集大量菌株進(jìn)行系統(tǒng)研究十分必要。為評(píng)估杏鮑菇菌種的遺傳多樣性，本研究依托福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心的菌種優(yōu)勢(shì)，利用拮抗反應(yīng)對(duì)從全國(guó)各地收集的81個(gè)杏鮑菇菌株進(jìn)行分類(lèi)研究，以期為杏鮑菇的遺傳研究、育種以及菌種管理提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株及來(lái)源見(jiàn)表1。采用PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、水1 000 mL，121 ℃滅菌15 min。

1.2 方法

（1）菌種活化。將4 ℃冰箱保存的供試菌株取出后重新接種于新鮮斜面，于28 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)7天，作為活化菌株用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

（2）拮抗對(duì)峙培養(yǎng)。將融化至溫度約50 ℃的PDA培養(yǎng)基15～20 mL倒入直徑9 cm的培養(yǎng)皿，凝固后隨機(jī)抽取1個(gè)菌株作為測(cè)試菌株，用接種針從活化的斜面中挑取黃豆大小的瓊脂塊菌絲，面朝下接種至培養(yǎng)皿中部；相距1 cm處接種另一菌株，封口倒置于28 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，約7 天后觀(guān)察菌絲接觸后兩者的拮抗反應(yīng)并拍照。

與測(cè)試菌株無(wú)拮抗反應(yīng)或僅有微弱拮抗反應(yīng)的菌株作為一個(gè)類(lèi)群（包括測(cè)試菌株在內(nèi)），不轉(zhuǎn)入下一輪拮抗實(shí)驗(yàn)；與測(cè)試菌株有拮抗反應(yīng)的所有菌株轉(zhuǎn)入下一輪實(shí)驗(yàn)，從這些菌株中隨機(jī)抽取1個(gè)菌株作為測(cè)試菌株，與其余菌株進(jìn)行拮抗對(duì)峙培養(yǎng)，依次類(lèi)推，直至將所有菌株都作出分類(lèi)（圖1）。

圖1 拮抗實(shí)驗(yàn)示意圖

注：1，隨機(jī)選取1個(gè)菌株作為測(cè)試菌株；2，測(cè)試菌株與其余菌株分別一一配對(duì)；3，與測(cè)試菌株無(wú)拮抗反應(yīng)或呈微弱反應(yīng)的為一群（包含測(cè)試菌株），其余菌株進(jìn)入下一輪實(shí)驗(yàn)；4，再?gòu)闹须S機(jī)選取1菌株為測(cè)試菌株；5，測(cè)試菌株與其余菌株分別一一配對(duì)，依次類(lèi)推直至所有菌株分群完。

表1 供試菌株

注：菌株來(lái)源Pl. e 0001-5（福建省輕工業(yè)研究所）；Pl. e 0006-15、17（福建農(nóng)科院蠶桑所）；Pl. e 0018[李曉宇贈(zèng)（日本產(chǎn)品分離）]；Pl. e 0019（深圳羅湖食用菌廠(chǎng)）；20、21（東北食藥用菌研究所）；Pl. e 0022（姜堰市富康食用菌研究所）；Pl. e 0023、24（江都市天達(dá)食用菌研究所）；Pl. e 0023+1、26-29（貴州習(xí)酒食用菌研究所）；Pl. e 0023+2、46+1（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食用菌研究所）；Pl. e 0025、30（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)菌種中心）；Pl. e 0031、31+1、32（古田戴維浩）；Pl. e 0032+1、44、45（古田科興食用菌研究所）；Pl. e 0033（保定冀微覃源）；Pl. e 0034-41（壽光市食用菌研究所）；Pl. e 0042（四川省農(nóng)科院微生物實(shí)驗(yàn)室）；Pl. e 0043（泌陽(yáng)縣食用菌研究所）；Pl. e 0046-49（嘉魚(yú)縣環(huán)宇食用菌研究所）；Pl. e 0050（古田科協(xié)為民食用菌場(chǎng)）；Pl. e 0051（錦州亞泰食用菌研究所）；Pl. e 0052-63（龍海九湖食用菌研究所）；Pl. e 0064-67（三明真菌研究所）；Pl. e 0066+1、66+2、68-71（福州市農(nóng)科所食用菌室）；Pl. e 0072、73（錦州亞泰食用菌研究所）；Pl. e 0074、75（福建省農(nóng)科院植保所）。

2 結(jié)果與分析

2.1 杏鮑菇菌株間的拮抗反應(yīng)

經(jīng)7～15 天培養(yǎng)，所有供試杏鮑菇菌株的菌絲表現(xiàn)潔白、長(zhǎng)勢(shì)好。不同菌株間菌絲接觸后的典型拮抗反應(yīng)有3種表現(xiàn)（圖2）：（1）菌絲間無(wú)拮抗反應(yīng)；（2）拮抗反應(yīng)微弱（少數(shù)）；（3）拮抗反應(yīng)明顯，菌絲間形成明顯溝狀。筆者將與測(cè)試菌株無(wú)拮抗反應(yīng)或反應(yīng)微弱的菌株視為同一類(lèi)群。

圖2 典型的杏鮑菇菌株間拮抗反應(yīng)

2.2 81個(gè)杏鮑菇菌株的分群

拮抗反應(yīng)依次以8、35、50、5、52、23、71、40、67、4為測(cè)試菌株，進(jìn)行了10輪實(shí)驗(yàn)，結(jié)果供試的81株杏鮑菇可分成11個(gè)類(lèi)群，各群所包含的菌株數(shù)相差懸殊，其中最大的類(lèi)群包含25個(gè)菌株，最小的群有3個(gè)，各自?xún)H含1個(gè)菌株，詳細(xì)分群結(jié)果如表2所示。

表2 81株杏鮑菇分群

注：“a”本輪測(cè)試菌株。

3 討 論

真菌的拮抗反應(yīng)是體細(xì)胞不親和的直接體現(xiàn)[14,15]。食用菌是具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的一類(lèi)真菌，體細(xì)胞的不親和性現(xiàn)象同樣普遍存在。由于拮抗分類(lèi)鑒定具有簡(jiǎn)單、快速、直觀(guān)等優(yōu)點(diǎn)，因此是最常用的食用菌菌種鑒定方法。諸多研究顯示，該方法具有較高的可靠性，如黃傘的拮抗反應(yīng)分類(lèi)結(jié)果與以酯酶同工酶的分類(lèi)方法相一致[16]，金針菇拮抗分類(lèi)與RAPD分析結(jié)果吻合[17]。此外，白靈菇[18]、真姬菇[19]、姬松茸[20]、香菇[21]、靈芝[22]等拮抗分類(lèi)鑒定結(jié)果與其他鑒定方法的分類(lèi)結(jié)果也相吻合。

本研究依據(jù)拮抗反應(yīng)將81株杏鮑菇分為11個(gè)類(lèi)群。福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心林驥[23]采用SCAR分子標(biāo)記技術(shù)結(jié)合拮抗反應(yīng)對(duì)其中72株杏鮑菇進(jìn)行分類(lèi)，結(jié)果供試菌株分成了59類(lèi)，顯示出更高的鑒別能力。此外，研究者認(rèn)為其中13株為同種異名菌株（占所有菌株的18.06%），這與本研究結(jié)論有一定相似性。總之，杏鮑菇菌株在我國(guó)具有豐富的遺傳多樣性，通過(guò)基因工程、細(xì)胞融合或雜交等技術(shù)將不同的種質(zhì)進(jìn)行合理化組合，可預(yù)期獲得符合特定需求的杏鮑菇新菌株。

值得注意的是，有3個(gè)群各自?xún)H含有1個(gè)菌株，推測(cè)可能的原因如下：（1）這些菌株不是主要的商業(yè)性栽培品種，使得相互間引種以及被菌業(yè)工作者進(jìn)行組織分離的可能性小，其在菌種市場(chǎng)的流通較少；（2）這些菌株與其他大多數(shù)杏鮑菇菌株相比，存在獨(dú)特的遺傳差異。此外，本實(shí)驗(yàn)其中一個(gè)類(lèi)群包含25個(gè)菌株，這個(gè)群可能存在較多同物異名菌株，是由于主栽品種相互引種、組織分離、隨意命名所致。

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Study on classification ofstrains based on antagonism test

Liu Shengrong1, Zhang Weirui1, Ke Binrong2, Liu Xinrui2, Wu Xiaoping2

(1.Department of Biology, Ningde Normal University, Ningde Fujian 35200; 2.College of life science, Mycological Research Center, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou Fujian 35002)

Classification of 81 strains collected from different areas in China was carried out based on antagonism tests. The results showed that 81 tested strains could be divided into 11 different groups. Of these groups, the largest group consists of 25 strains. However, there are three groups each containing only one strain. The results showed that a high diversityoccurs instrains in China. Apparently synonymy may be a serious problems in: many of strains with different names may fall within the same group.

; antagonism test; classification; genetic diversity

S646

A

2095-0934（2015）01-33-04

吳小平，博士，福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院教授，主要從事食用菌研究工作