練高登，謝 輝，馮佳婷，肖 丹

(長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué))

0 引言

近代以來(lái)，中藥告別了傳統(tǒng)的單一個(gè)體應(yīng)用的時(shí)代，開(kāi)始了中藥制劑、中成藥等企業(yè)化、規(guī)模化生產(chǎn)，隨之產(chǎn)生的中藥藥渣也以每年數(shù)十萬(wàn)噸遞增、積累．據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，中藥藥渣中殘留約30%～40%的藥用指標(biāo)成分外，還大量的粗蛋白、粗脂肪、有機(jī)物、微量元素及一些未知的促生長(zhǎng)物質(zhì)．李艷軍等［1］對(duì)藿香正氣藥渣中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明粗蛋白含量約為13%，粗脂肪約為3%，各種纖維含量約為60%，鈣磷含量約為7%左右．將其按一定比例添加到泌乳母兔的飼料中，對(duì)母兔的泌乳及仔兔的生長(zhǎng)性能都有提高．由此表明，直接將加工后的中藥藥渣直接添加與飼料中，會(huì)影響到飼料的適口性，甚至?xí)a(chǎn)生毒性．借助于微生物的分解作用可以降低藥物的毒副作用，同時(shí)可以促進(jìn)中藥中的一些大分子如纖維素等的生物轉(zhuǎn)化，提高小分子蛋白和游離氨基酸的含量［2-3］．王兵等［4］利用白腐菌對(duì)中藥渣進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，其蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)高71%，而粗纖維質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低了12%．利用微生物對(duì)藥渣進(jìn)行發(fā)酵，提前能把藥渣中營(yíng)養(yǎng)早分離早分解，提高吸收率，同時(shí)發(fā)酵藥渣中含有大量的益生菌存在，促進(jìn)腸道微生態(tài)的平衡．因此最終得到的產(chǎn)品具有中草藥和微生物的雙重功效．微生物發(fā)酵中藥藥渣在當(dāng)今動(dòng)物生產(chǎn)上的應(yīng)用與開(kāi)發(fā)將成為人們研究的一大熱點(diǎn)［5］．

人參提取工藝多采用醇提法提取含皂苷等活性成分，研究表明用60%乙醇提取人參后的藥渣，含有大量的人參總皂苷及多糖，同時(shí)還含有大量的人參木質(zhì)素及纖維、蛋白質(zhì)、淀粉．楊東川等［6］研究發(fā)現(xiàn)利用枯草桿菌發(fā)酵紅參藥渣后對(duì)小鼠的繁殖性能具有一定的促進(jìn)作用．酵母菌是一些單細(xì)胞真菌，是人類(lèi)文明史中被應(yīng)用得最早的微生物．該菌種因分布廣泛，培養(yǎng)簡(jiǎn)單，易于分離，耐熱，抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)而成為微生物發(fā)酵研究的熱點(diǎn)［7-8］，同時(shí)酵母菌也是腸道微生態(tài)的調(diào)節(jié)劑．腸道微生態(tài)一直被認(rèn)為廣泛地參與了宿主營(yíng)養(yǎng)吸收，腸道與免疫系統(tǒng)的發(fā)育等重要的生理過(guò)程，其變化與多種疾病的發(fā)生，發(fā)展和轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)．劉艷艷等研究表明灌胃人參皂苷后小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，熒光假單胞菌和丁酸梭菌數(shù)量明顯增加［9］．但有關(guān)于人參藥渣對(duì)腸道黏膜保護(hù)作用的研究的尚未有報(bào)道．

該研究采用環(huán)磷酰胺腹腔注射小鼠，構(gòu)建腸道黏膜損傷的動(dòng)物模型，研究酵母菌發(fā)酵人參藥渣后的產(chǎn)物對(duì)腸道黏膜免疫保護(hù)作用．以期為開(kāi)發(fā)動(dòng)物腸道黏膜損傷性疾病的功能性飼料及中藥渣發(fā)酵產(chǎn)物的再利用提供依據(jù)．

1 材料和方法

1．1 材料

1．1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

BALB/c小鼠(健康，體重18～22 g，6～8周齡)，購(gòu)自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心．

1．1．2 實(shí)驗(yàn)藥品

酵母菌(Bacillussubtilis，由長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué)制藥教研室提供);人參中藥渣(由吉林省人參科學(xué)院提供);環(huán)磷酰胺購(gòu)自吉林省藥品監(jiān)督所;，Mouse SIgA ELISA Kit，小鼠單克隆β-actin-HRP，羊抗鼠IgA-HRP等購(gòu)自北京寶泰克公司．

牛肉浸膏、蛋白胨、氯化鈉、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉SDS、甘氨酸、過(guò)硫酸銨(APS)等購(gòu)自上海浩然生物制品有限公司．

1．1．3 主要儀器

電子天平(上海卓精電子科技有限公司);高壓滅菌鍋(德國(guó)IRM公司);電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海典晟試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)儀器廠);粉碎機(jī)(濰坊設(shè)備廠);XSP-35TV光學(xué)顯微鏡(深圳博士達(dá)光學(xué)儀器有限公司);ELx808酶標(biāo)儀(美國(guó)伯騰公司;Gel Doc XR+凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)伯樂(lè));臥式恒溫?fù)u床(上海典晟試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)儀器廠)．

1．2 方法

1．2．1 液體培養(yǎng)基制備

分別稱取牛肉浸膏 5．0 g、蛋白胨 10．0 g、氯化鈉5．0 g置于 1000 mL燒杯，加入蒸餾水800 mL，加熱攪拌至混勻．靜置冷卻至室溫，加入氫氧化鈉溶液調(diào) pH=7．2～7．4后加水至1000 mL．將制備好的液體培養(yǎng)基平均分裝于3個(gè)錐形瓶，于121℃、0．1MP條件下滅菌30 min．

1．2．2 種子液制備

取適量酵母菌接種于上述培養(yǎng)基中，置于搖床中震蕩培養(yǎng)過(guò)夜(37℃﹑160 r/min)．采用麥?zhǔn)媳葷岱y(cè)定菌液濃度，菌液濃度達(dá)1×109cfu/mL可用于發(fā)酵試驗(yàn)．

1．2．3 人參藥渣的發(fā)酵

將醇提過(guò)的人參藥渣烘干后粉碎過(guò)篩，取20 g藥渣于100 mL錐形瓶，加入12 mL的蒸餾水(W/V=0．6放于高壓滅菌鍋內(nèi)121℃滅菌30 min．冷卻至37℃后，接種培養(yǎng)好的酵母菌菌液(接種量約為5%)．將接種后的錐形瓶中液體混勻置于37℃下發(fā)酵培養(yǎng)5～7d后烘干(25～30℃)．

1．2．4 陽(yáng)性對(duì)照藥品用量確定

人參皂苷Rg3具有提高人體免疫力的功能，臨床上常用來(lái)輔助治療腫瘤．根據(jù)關(guān)于人參皂苷Rg3提高免疫力的相關(guān)報(bào)道［10-12］，經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明選取Rg3的劑量為15 mg/kg(與體重比)為陽(yáng)性對(duì)照藥的用藥劑量．

1．2．5 人參藥渣發(fā)酵產(chǎn)物最佳添加比例的確定

選取24只BALB/c小鼠飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)分成4組，每組6只．依次按1%﹑3%﹑5%的比例在飼料中添加發(fā)酵后的人參藥渣，并設(shè)置空白對(duì)照組．在保證次日投料有剩余的前提下，相同飼喂量飼喂一周．觀察各組采食，飲水，排便及體重變化，比較料重比及日增重得出藥渣最佳添加比例．

1．2．6 動(dòng)物模型的建立及飼喂試驗(yàn)

選取32只BALB/c小鼠，適應(yīng)性應(yīng)性飼喂一周后，隨機(jī)分為4組，每組8只．分別按照表1進(jìn)行小鼠的飼喂試驗(yàn)．發(fā)酵人參藥渣按試驗(yàn)1．2．5得出的最佳添加的比例與飼料混合．在相同的條件下飼喂各組小鼠，每天定時(shí)記錄各組小鼠的飼料消耗，計(jì)算平均日采食量．飼喂一周后對(duì)各組小鼠進(jìn)行體重測(cè)定，計(jì)算各組小鼠平均的日增重及料重比．分別將模型組，陽(yáng)性對(duì)照組及人參藥渣組的小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺(5 mg/g)，正常組注射等體積的滅菌生理鹽水．相同條件下連續(xù)飼養(yǎng)三周后，將小鼠禁食不禁水24 h，進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)．

表1 小鼠分組飼喂情況

1．2．7 小腸黏膜SIgA含量測(cè)定

參照文獻(xiàn)［13］申金雁等方法剪取空腸段約5 cm，輕輕去除內(nèi)容物后，用滅菌的生理鹽水沖洗．縱向剪開(kāi)腸壁，用載玻片刮取腸黏膜．準(zhǔn)確稱取1g的黏膜液，加入18 mL PBS(pH=7．4)漂洗冰浴勻漿，5000 r/min離心10 min．收集上清液即為10%的黏膜液，按鼠SIgA-ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)，測(cè)定單位質(zhì)量小腸SIgA的含量．

1．2．8 Western-blotting檢測(cè)小腸 IgA 的表達(dá)量

在腸道分泌物中存在大量的分泌型的IgA(SIgA)，約占IgA總量的60%以上，在粘膜免疫中發(fā)揮重要作用．為進(jìn)一步研究發(fā)酵人參藥渣對(duì)小腸黏膜IgA抗體表的影響及與小腸SIgA的相關(guān)性，對(duì)各組小鼠中IgA抗體含量進(jìn)行檢測(cè)．按1．2．7方法取出約0．2g小腸，用生理鹽水反復(fù)沖洗腸腔至無(wú)血跡，用組織剪剪碎．按每100mg組織加入1 mL的含0．01 mmol/L PMSF的RIPA組織裂解液．用組織勻漿機(jī)混勻，置于冰浴中裂解20 min后，12000 r/min離心取上清(10min)．BCA法測(cè)定蛋白樣品濃度并將蛋白濃度調(diào)節(jié)至10 mg/mL．將按文獻(xiàn)方法［14］進(jìn)行的蛋白質(zhì) SDS-PAGE電泳及 Western-blotting檢測(cè)．選用5%的脫脂奶粉為封閉2液，抗稀釋比分別IgA為1∶3000;β -actin 為 1∶2000．ECL 顯色，暗室中壓片曝光．將膠片掃描拍照后，利用灰度掃描比對(duì)軟件進(jìn)行比對(duì)．記錄各試驗(yàn)組的IgA條帶與β-actin條帶的積分光密度值，每個(gè)蛋白重復(fù)3次．用兩者平均值的比值表示該樣本IgA的相對(duì)表達(dá)量．

1．2．9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 SPSS 20．0統(tǒng)計(jì)軟件分析進(jìn)行單因素方差分析，F(xiàn)檢驗(yàn)比較組間差異．(P＜0．05為差異顯著，P ＜0．01為差異極顯著)．

2 結(jié)果與分析

2．1 小鼠體質(zhì)量變化

由圖1可知，未注射環(huán)磷酰前，各組小鼠體質(zhì)量(相對(duì)體重的百分比)變化不大，增加緩慢．一周后進(jìn)行腹腔注射環(huán)磷酰胺造模藥物后，模型組、陽(yáng)性對(duì)照組及藥渣組小鼠于三周后(第26天)體質(zhì)量均出現(xiàn)顯著下降．提示酰胺對(duì)正常小鼠腸道黏膜造成損傷，影響了腸道正?；展δ埽瑥亩鴮?dǎo)致小鼠體質(zhì)量下降．由圖2可知造模前后各組小鼠體質(zhì)量的相對(duì)變化率，結(jié)果表明與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組及藥渣組體質(zhì)量降低率低，但未呈現(xiàn)顯著性差異．

圖1 小鼠體質(zhì)量的變化情況(±S，n=8)

圖2 造模后小鼠體質(zhì)量的變化±s，n=8)

2．2 腸黏膜SIgA含量

腸道黏膜免疫系統(tǒng)損傷時(shí)一些密切相關(guān)的免疫因子如SIgA也會(huì)有所變化．由圖3數(shù)據(jù)可知，模型組與正常組小鼠腸道SIgA的含量相比差異極顯著(P＜0．01)且降低了32．81%，表明成功構(gòu)建了腸黏膜免疫屏障損傷的小鼠模型．發(fā)酵人參藥渣組SIgA含量相比模型組差異極顯著(P＜0．01)且提高了43．43%，與陽(yáng)性對(duì)照組和正常組相比差異不顯著．陽(yáng)性對(duì)照組與模型組相比，其SIgA含量含量提高了47．57%．投喂發(fā)酵人參藥渣后小鼠黏膜SIgA的相對(duì)含量顯著升高，表明發(fā)酵的人參藥渣對(duì)腸黏膜損傷小鼠具有促進(jìn)SIgA分泌的作用，SIgA分泌量的變化揭示了腸道免疫屏的改變．因此，該試驗(yàn)結(jié)果表明發(fā)酵人參藥渣對(duì)腸道免疫屏障起到一定保護(hù)作用．

圖3 腸黏膜SIgA含量±s，n=8)

2．3 小腸IgA蛋白表達(dá)量

小腸IgA蛋白表達(dá)水平揭示了腸道免疫水平．由圖4可知，在造模后模型組腸道內(nèi)IgA蛋白表達(dá)量與正常組相比顯著降低，差異極顯著(P＜0．01)．在進(jìn)行飼喂試驗(yàn)后，投喂人參藥渣組與模型組相比表達(dá)量顯著提高，兩組間差異顯著(P＜0．05)，而與陽(yáng)性對(duì)照組相比差異不顯著．表明發(fā)酵人參藥渣組可提高IgA蛋白表達(dá)量，從而提高腸道粘膜免疫的水平．不同試驗(yàn)組中IgA蛋白表達(dá)量的變化與小鼠腸道黏膜SIgA抗體變化一致，表明兩者之間正相關(guān)．該試驗(yàn)結(jié)果表明，投喂人參藥渣可以促進(jìn)小鼠腸道黏膜SIgA分泌，這可能與小腸IgA的表達(dá)量上升相關(guān)．

圖4 小腸IgA蛋白相對(duì)表達(dá)量±s，n=3)

3 討論

腸黏膜免疫屏障是機(jī)體抵制外來(lái)病原微生物侵?jǐn)_的重要防線，當(dāng)其損傷等應(yīng)激情況下，腸黏膜結(jié)構(gòu)及免疫功能會(huì)受到損傷，如SIgA含量減少等［15］．環(huán)磷酰胺(cyclophosvnamide，CTX)是一種化療藥物，在殺傷癌癥細(xì)胞的同時(shí)，可對(duì)腸粘膜屏障造成損傷，并損傷免疫功能．周華等詳細(xì)闡明了環(huán)磷酸酰胺對(duì)小鼠腸黏膜免疫功能的影響［16］．目前利用該藥物已成為首選的藥物被應(yīng)用于構(gòu)建小鼠腸黏膜損傷的模型．該研究采用常規(guī)方法，腹腔注射環(huán)磷酰胺構(gòu)建小鼠腸道粘膜損傷模型．通過(guò)檢測(cè)不同試驗(yàn)組中SIgA含量及IgA蛋白的表達(dá)量，比較分析發(fā)酵人參藥渣對(duì)小鼠腸道粘膜免疫的作用．該研究結(jié)果表明，投喂發(fā)酵人參藥渣組小鼠腸道SIgA含量與模型組相比顯著升高(p＜0．01)，與陽(yáng)性對(duì)照組相比差異不顯著．SIgA是腸黏膜免疫屏障的主要效應(yīng)因子，不但有防御和清除病原體和毒素的作用，還能減弱免疫耐受的形成［17-18］．腸道內(nèi)SIgA主要由腸黏膜中的成熟漿細(xì)胞分泌，筆者認(rèn)為發(fā)酵人參藥渣可同通過(guò)非特異性的免疫刺激，刺激了漿細(xì)胞分泌SIgA，使腸道SlgA維持在一個(gè)較高的水平，改善腸道局部免疫功能．

研究表明，sIgA介導(dǎo)的腸黏膜免疫應(yīng)答在很大程度上依賴于細(xì)胞因子的參與如GALT的T細(xì)胞和白細(xì)胞介素、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子等［19］．但關(guān)于SIgA與IgA含量在相同環(huán)境中的變化及相關(guān)性的報(bào)道很少，該研究進(jìn)一步表明發(fā)酵人參藥渣不但促進(jìn)SIgA分泌量，還可以顯著提高小腸組織的IgA蛋白表達(dá)量．提示發(fā)酵藥渣可能通過(guò)促進(jìn)腸道漿細(xì)胞分泌IgA蛋白的同時(shí)促進(jìn)sIgA的分泌，但是IgA的含量變化與SIgA的增加量并未呈現(xiàn)線性關(guān)系，推測(cè)SIgA的分泌可能受多方面因素的影響，除了受IgA含量的影響外，還可能與其它蛋白(pIgR)及細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)功能有關(guān)．

該研究結(jié)果表明發(fā)酵人參藥渣可增強(qiáng)腸道免疫機(jī)能，提高腸道粘膜免疫能力，進(jìn)而可改善環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的小鼠腸黏膜損傷．其作用機(jī)理是促進(jìn)了腸道分泌IgA和SIgA蛋白．該研究為人參藥渣的綜合利用提供了技術(shù)支撐和理論依據(jù)，同時(shí)為腸道分泌IgA和SIgA蛋白的機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)．

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