段亞飛, 董宏標, 王 蕓, 劉青松, 李 華, 張家松

(中國水產(chǎn)科學研究院 南海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室, 廣東 廣州 510300)

斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)俗稱草蝦、虎蝦等,隸屬于甲殼綱(Crustacea)、十足目(Decapoda)、對蝦科(Penaeidae)、對蝦屬(Penaeus), 是世界三大養(yǎng)殖對蝦之一。因其個體大、食性雜、肉質鮮美和生長速度快等特點, 已成為中國沿海地區(qū)重要的經(jīng)濟養(yǎng)殖蝦類[1-2]。近年來, 由弧菌(Vibriospp.)引起的蝦類疾病頻發(fā), 給蝦類養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失, 制約了其產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[3-4]。因此, 蝦類弧菌病及其免疫機制的研究顯得尤為重要。

鰻弧菌(Vibrio anguillarum)屬于革蘭氏陰性菌,是一種常見的水產(chǎn)動物致病菌, 其能引起魚類體表潰爛出血、腸黏膜脫落和肝臟壞死等癥狀[5-6], 還會導致蝦類黃鰓病的發(fā)生[7], 且具有對蝦發(fā)病率和死亡率高、傳播范圍廣、危害大等特點, 與以往報道的弧菌引起的病害有所不同。對蝦缺乏獲得性免疫系統(tǒng), 其依靠各種類型的非特異性免疫因子來識別異己, 抵抗各種病原的感染[8]?？偪寡趸芰?T-AOC)是衡量機體抗氧化防御系統(tǒng)功能狀況的綜合性指標[9]。溶菌酶(LSZ)是甲殼動物體內重要的抗菌蛋白, 其活性的變化可以作為衡量機體免疫功能狀態(tài)的重要指標[10]。一氧化氮(NO)是一種新型免疫調節(jié)分子, 參與機體多種重要的生理病理過程； 誘導型一氧化氮合酶(iNOS)可以催化 L-精氨酸與 O2反應產(chǎn)生 NO,其活性可由測定的 NO合成量來決定[11-12], 因此兩者配合使用對疾病的深入研究具有重要意義。

然而, 目前關于鰻弧菌感染引起斑節(jié)對蝦免疫指標變化特征的研究相對較少, 而對蝦弧菌病監(jiān)測指標的篩選對其疾病及免疫機制的研究具有重要意義。本研究通過對斑節(jié)對蝦進行鰻弧菌注射感染, 測定不同時間點免疫指標 T-AOC、LSZ和 iNOS活性以及 NO含量的變化, 初步探討鰻弧菌感染對斑節(jié)對蝦免疫指標的影響, 并篩選蝦類弧菌病的監(jiān)測指標, 以期為斑節(jié)對蝦應答弧菌感染的免疫機制研究提供基本的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用斑節(jié)對蝦取自中山衍生水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司, 體質健康活潑, 平均體長(10.81±0.45)cm,體質量(5.65±0.34) g； 于 PVC 桶(200 L)中暫養(yǎng) 1 周,每桶30尾。實驗期間, 水溫25 ℃, 鹽度15, pH 8.5,不間斷充氣, 每天換水1/3, 并投喂對蝦配合飼料。

實驗用鰻弧菌為中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所育種室所贈。感染實驗前1 d, 2611E平板上活化菌種； 然后利用液體培養(yǎng)基進行擴大培養(yǎng), 4 ℃2 000 r/min離心取沉淀, 用0.86%無菌生理鹽水稀釋至1×108cfu/mL的菌懸液, 4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 鰻弧菌感染實驗

將暫養(yǎng)1周的斑節(jié)對蝦隨機分為兩組, 即： 對照組和感染組, 每組3個平行, 每個平行30尾。感染組對蝦平均每尾注射鰻弧菌菌懸液20 μL (約2×106cfu), 對照組注射0.86%無菌生理鹽水20 μL, 注射部位均為對蝦第2腹節(jié)。分別于注射后0、1.5、3、6、12、24和48 h, 取瀕臨死亡或活力較弱個體的肝胰腺和鰓組織, 用于酶活性的測定。同一時間點每個平行組分別取2尾蝦, 將組織混合, 作為一組樣品, 即每個時間點感染組或對照組共有3組樣品。

另取60尾對蝦分為兩組, 分別注射等體積鰻弧菌菌懸液和 0.86%無菌生理鹽水, 用于統(tǒng)計對蝦累計存活率, 整個過程不取樣。注射劑量和方法如上所述。

1.3 樣品制備

使用預冷的 0.86%生理鹽水對所取的肝胰腺和鰓組織進行漂洗, 去除組織液, 濾紙拭干, 稱重后置于離心管中。按照1∶10 (W/V)加入預冷的0.86%生理鹽水進行超聲粉碎。將制備好的 10%組織勻漿液于4 ℃ 2000 r/min離心10 min, 取上清液于-80 ℃保存?zhèn)溆? 用于免疫指標的測定。

1.4 免疫指標的測定

使用南京建成生物工程研究所試劑盒分別測定T-AOC、LSZ和iNOS活性以及NO與組織蛋白含量,相關操作按說明書進行, 未做任何調整。各項指標測定所用試劑盒均為同批次試劑。

37℃時, 每分鐘每毫克組織蛋白, 使反應體系的吸光度(OD)值每增加0.01時, 定義為1個T-AOC單位； LSZ活性測定采用比濁法； NO含量測定采用硝酸還原法, 利用硝酸鹽顯色劑生成紅色偶氮化合物來間接測定； iNOS活性主要利用其催化L-精氨酸與O2反應生成NO, NO與親核性物質作用生成有色化合物從而通過測定530 nm吸光度進行定量； 組織蛋白含量測定采用考馬斯亮藍法。

1.5 數(shù)據(jù)分析

實驗所得數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示, 用 SPSS 11.0軟件進行單因素方差分析,P＜0.05表示差異顯著。

2 結果

2.1 鰻弧菌感染對斑節(jié)對蝦存活的影響

與對照組相比, 感染組斑節(jié)對蝦于3 h出現(xiàn)死亡,6 h時死亡率明顯升高, 累積存活率為88.3%(圖1)。感染鰻弧菌后, 對蝦攝食量明顯減少, 活動不頻繁； 瀕臨死亡時, 對蝦肌肉乳白狀, 尾肢和胃部輕微發(fā)紅。而對照組對蝦實驗全程無死亡, 攝食、活動等無異?，F(xiàn)象。

圖1 斑節(jié)對蝦感染鰻弧菌后的累積存活率Fig. 1 Cumulative survival of P. monodon after V. anguillarum challenge

2.2 鰻弧菌感染對斑節(jié)對蝦T-AOC活性的影響

與對照組相比, 斑節(jié)對蝦感染鰻弧菌后6 h, 肝胰腺中 T-AOC活性顯著上升至最大值, 為對照組的3.80倍(P＜0.05)； 隨后 T-AOC 活性逐漸下降, 但 12和24 h活性仍高于對照組(P＜0.05), 最后于48 h降至對照組水平(圖 2a)。鰓中 T-AOC活性于感染后 3 h上升至較高值； 感染后 6 h, T-AOC活性有所下降,但于 12 h再次達到最大值, 為對照組的 3.71倍(P＜0.05)； 隨后T-AOC活性逐漸下降, 并于48 h顯著低于對照組(P＜0.05)(圖 2b)。

2.3 鰻弧菌感染對斑節(jié)對蝦LSZ活性的影響

與對照組相比, 斑節(jié)對蝦肝胰腺和鰓中 LSZ活性于感染鰻弧菌后3 h顯著上升, 并分別于6和12 h達到最大值, 為對照組的4.90和2.91倍(P＜0.05)； 隨后LSZ活性均于24 h顯著下降至最小值, 分別為對照組的0.42和0.53倍(P＜0.05)。感染鰻弧菌后48 h,肝胰腺和鰓中 LSZ活性雖低于對照組, 但差異不顯著(P＞0.05)(圖 3)。

2.4 鰻弧菌感染對斑節(jié)對蝦 NO含量的影響

與對照組相比, 感染鰻弧菌后 3 h, 肝胰腺中NO含量顯著上升, 并于6 h達到最大值, 為對照組的2.75倍(P＜0.05)； 隨后NO含量逐漸下降, 并于24 h顯著低于對照組(P＜0.05)(圖 4a)。感染組對蝦鰓中NO含量于3 h逐漸上升至最大值, 為對照組的1.71倍(P＜0.05), 隨后NO含量逐漸下降, 于48 h顯著低于對照組(P＜0.05)； 而6和24 h的NO含量仍顯著高于對照組(圖4b)。

2.5 鰻弧菌感染對斑節(jié)對蝦 iNOS活性的影響

圖2 斑節(jié)對蝦感染鰻弧菌后肝胰腺(a)和鰓(b)中總抗氧化能力(T-AOC)的活性變化Fig. 2 Activity of T-AOC in P. monodon hepatopancreas (a) and gills (b) after V. anguillarum challenge

圖3 斑節(jié)對蝦感染鰻弧菌后肝胰腺(a)和鰓(b)中溶菌酶(LSZ)的活性變化Fig. 3 Activity of LSZ in P. monodon hepatopancreas (a) and gills (b) after V. anguillarum challenge

圖4 斑節(jié)對蝦感染鰻弧菌后肝胰腺(a)和鰓(b)中一氧化氮(NO)的含量變化Fig. 4 Concentration of NO in P. monodon hepatopancreas (a) and gills (b) after V. anguillarum challenge

與對照組相比, 斑節(jié)對蝦感染鰻弧菌后3 h, 肝胰腺中 iNOS活性逐漸上升至最大值, 為對照組的3.27倍(P＜0.05)； 隨后活性逐漸下降, 于24 h顯著低于對照組, 為對照組的0.53倍(P＜0.05)(圖5a)。鰓中iNOS活性于感染后6 h開始顯著上升, 12 h時達到最大值, 為對照組的 3.80倍(P＜0.05)； 隨后 iNOS活性逐漸降低, 并于48 h顯著低于對照組(P＜0.05)(圖5b)。

圖5 斑節(jié)對蝦感染鰻弧菌后肝胰腺(a)和鰓(b)中誘導型一氧化氮合酶(iNOS)的活性變化Fig. 5 Activity of iNOS in P. monodon hepatopancreas (a) and gills (b) after V. anguillarum challenge

3 討論

3.1 鰻弧菌對斑節(jié)對蝦T-AOC活性的影響

弧菌是蝦類養(yǎng)殖中危害嚴重的傳染性病原, 其能導致患病蝦類機體生理功能紊亂, 出現(xiàn)大量死亡[13]。外界病原入侵動物機體時, 會誘發(fā)機體免疫反應產(chǎn)生大量活性氧(ROS), 如超氧陰離子自由基、羥自由基和過氧化氫等, 用于殺滅病原； 但過量的 ROS會破壞宿主細胞, 造成機體抗氧化系統(tǒng)功能紊亂, 從而導致生理機能和免疫功能受損[14]。在長期進化過程中, 動物機體形成了一套抗氧化酶防御系統(tǒng), 主要包括過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)等, 可以有效地將機體多余的活性氧清除, 保護機體免受氧化損傷[15]。T-AOC是評價機體抗氧化酶系統(tǒng)和非酶促系統(tǒng)功能的綜合性指標[16], 可以代表和反映機體抗氧化防御系統(tǒng)的狀態(tài)。

研究表明, 副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus)感染導致斑節(jié)對蝦組織T-AOC活性呈先升高后下降的變化趨勢[8]； 感染鰻弧菌后的中國對蝦(Fenneropenaeus chinensis)血淋巴SOD酶活性于1 h顯著升高至最大值, 隨后呈先升高再降低的趨勢[17]。陳萍等[18]用溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)對三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)進行感染, 發(fā)現(xiàn)其機體內升高的脂質過氧化物水平導致其抗氧化酶活性降低, 抗氧化防御能力顯著下降。本研究中, 感染鰻弧菌初期, 斑節(jié)對蝦肝胰腺和鰓中 T-AOC活性呈上升趨勢, 表明鰻弧菌感染誘導對蝦機體免疫反應產(chǎn)生ROS以殺滅病原菌, 從而激活機體抗氧化酶系統(tǒng), 使得 T-AOC酶活性顯著升高； 感染鰻弧菌后期, 肝胰腺和鰓中T-AOC活性逐漸下降, 可能弧菌的大量繁殖抑制了機體抗氧化酶活性, 機體因累積大量 ROS而導致組織細胞受損, 抗氧化防御系統(tǒng)下降。此外有研究表明,ROS在機體過度積累可能會導致細胞呼吸障礙, 引發(fā)細胞凋亡或壞死[15]。但本研究中鰻弧菌感染是否會造成斑節(jié)對蝦組織細胞凋亡或壞死, 可能需要通過組織切片以及細胞凋亡相關基因如 Caspase等的表達變化進行分析。

3.2 鰻弧菌對斑節(jié)對蝦LSZ活性的影響

LSZ能夠水解細菌細胞壁肽聚糖中N-乙酰葡萄糖胺與N-乙酰胞壁酸之間的 β-1, 4-糖苷鍵, 從而殺滅病原菌[19-20]。王雷等[21]對中國對蝦血淋巴溶菌活力的研究表明, 溶菌活力可以作為衡量對蝦機體的免疫功能狀態(tài)的監(jiān)測指標。陳萍等[13]研究表明, 三疣梭子蟹感染溶藻弧菌24h, 其血淋巴和肝胰腺中LSZ活性顯著高于對照組, 48和72 h活性顯著下降。此外, 弧菌還可顯著誘導 LSZ基因的表達。斑節(jié)對蝦感染哈維弧菌(Vibrio harvyi)后, 其血細胞中LSZ基因表達量于12和24 h顯著升高[22]。羅詞興等[23]用不同劑量的溶藻弧菌感染凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei), 發(fā)現(xiàn)高劑量組對蝦鰓中LSZ基因表達上調時間較早, 且表達量顯著高于低劑量組。

本研究中, 感染鰻弧菌后的斑節(jié)對蝦肝胰腺和鰓中LSZ活性分別于6和12 h上升至最大值, 可能是鰻弧菌感染誘導對蝦非特異性免疫反應合成大量抗菌蛋白和溶菌蛋白, 用于清除侵入機體的鰻弧菌,使得溶菌酶活性升高, 表明 LSZ活性升高是對蝦機體應對病原菌侵染的一種防御機制。但是, 感染鰻弧菌后24 h, 斑節(jié)對蝦肝胰腺和鰓中LSZ活性均顯著低于對照組, 可能是該時期對蝦處于感染后的恢復期, 而弧菌大量繁殖導致機體細胞受到損傷, 抑制了 LSZ活性。因而推測, 適量的低劑量鰻弧菌滅活或減毒疫苗可以提高對蝦的抗弧菌感染能力, 但仍需進一步的驗證。

3.3 鰻弧菌對斑節(jié)對蝦NO含量和iNOS活性的影響

NO是一種生物自由基, 其主要由一氧化氮合酶(NOS)催化產(chǎn)生, 具有抑制脂質過氧化、清除氧自由基的作用[24]。NO能夠通過抑制代謝酶活性或使其失活、與氧自由基結合生成強氧化劑等方式殺死病原體[25]。根據(jù)免疫克隆和對鈣離子的依賴性, NOS主要包括 3種： 神經(jīng)型(nNOS)、結構型(cNOS)和誘導型(iNOS)。iNOS主要存在于吞噬細胞中, 可以被多種細胞因子(干擾素、白介素和腫瘤壞死因子等)、病原體(細菌和病毒等)及免疫刺激物(脂多糖)等激活, 催化L-精氨酸產(chǎn)生NO以及不同類型的活性氮中間體,起到免疫防御作用[11]。

研究表明, NO與iNOS在蝦類免疫反應中具有重要作用。姜建國等[26-27]證明對蝦血細胞中存在NOS活性, 并利用 WSSV對中國對蝦進行感染, 發(fā)現(xiàn)其能顯著誘導中國對蝦血細胞iNOS活性升高, 隨著WSSV在機體內的大量增殖導致iNOS活性顯著降低, 對蝦趨于死亡, 由此認為iNOS可以作為對蝦健康狀況的監(jiān)測指標。冀培豐[25]研究表明, 凡納濱對蝦感染副溶血弧菌和WSSV后, 其組織NOS的基因表達量和酶活性均顯著降低, 表明NOS可能在對蝦抵抗病原入侵的免疫防御中發(fā)揮重要作用。本研究中, 斑節(jié)對蝦肝胰腺和鰓中NO含量與iNOS活性于感染鰻弧菌后12 h顯著升高, 表明鰻弧菌感染誘導iNOS活性提高, 產(chǎn)生大量NO以抵抗鰻弧菌對機體的感染； 感染后期 NO含量與 iNOS活性顯著降低,可能與機體免疫系統(tǒng)受損有關。此外, 有相關報道表明, NO和iNOS的作用發(fā)揮不具有特異性, 可以與超氧陰離子生成強氧化劑, 長時間的高含量會對機體自身產(chǎn)生毒害作用[28-29]。本研究中, 鰻弧菌感染后期T-AOC活性的降低可能與機體活性氧不能及時完全清除有關, 而 NO是否與機體活性氧一起加速損壞斑節(jié)對蝦免疫系統(tǒng), 有待更深入的研究進行闡明。

綜上所述, 鰻弧菌感染對斑節(jié)對蝦免疫相關指標T-AOC、LSZ和iNOS活性和NO含量的影響顯著；斑節(jié)對蝦T-AOC、LSZ、iNOS和NO對鰻弧菌感染反應較為敏感, 可以作為斑節(jié)對蝦弧菌病誘發(fā)的監(jiān)測指標； 不同免疫指標對鰻弧菌感染的應答反應有所差異, 主要與其功能有關。本研究可以為對蝦應答弧菌感染的免疫機制研究提供重要的理論參考。

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