劉 杰, 卜蒙蒙, 孫 景, 王延鵬, 李慧鵬, 張德超

(1. 青島科技大學 生物工程與技術系, 山東 青島 266042； 2. 中國科學院 海洋研究所 海洋生物分類與系統(tǒng)演化實驗室, 山東 青島 266071)

庫頁島屬俄羅斯最大的島嶼, 面積 7.64萬 km2,大陸性氣候, 冬季氣候寒冷, 夏季涼爽多霧。該島地處北太平洋, 位于我國黑龍江出?？诘臇|部, 東、北面臨鄂霍次克海, 西隔韃靼海峽及涅韋爾斯科伊海峽并與俄羅斯哈巴羅夫斯克邊疆區(qū)相望, 南隔宗谷海峽與日本北海道宗谷岬相對。庫頁島上現(xiàn)有6 000多條河流和1 600余個湖泊, 其自然生態(tài)環(huán)境受人類活動干擾較少,同時來自鄂霍次克海西岸的沉積物源, 其形成速率、厚度和有機碳含量等均為各類微生物生長提供了良好而獨特的生存環(huán)境。一般來說, 特殊生態(tài)環(huán)境是獲取微生物新種質(zhì)資源的有效途徑, 也是進行微生物新型生物活性物質(zhì)研發(fā)的基礎。而庫頁島區(qū)域(包括潮間帶)這類特殊生境的微生物多樣性狀況如何, 至今尚未見報道過。

本研究于2013年9月份從庫頁島潮間帶的4個采樣點采集了沉積物樣本若干份, 然后利用2216E、R2A、M1三種常規(guī)、寡營養(yǎng)海洋細菌培養(yǎng)基, 對其可培養(yǎng)細菌進行分離、純化和基于 16S rRNA 基因序列測定的系統(tǒng)發(fā)育分析, 目的在于了解庫頁島特殊生態(tài)區(qū)潮間帶沉積物可培養(yǎng)細菌的多樣性狀況,尋找和發(fā)現(xiàn)新的物種或分類單元。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

4份沉積物樣品分別于 2013年 9月 6日—11日采集于俄羅斯庫頁島潮間帶, 地理坐標分別是：R-1 (47°08'30.1”N/142°03'30.1”E), R-2(46°56'39.3”N/143°05'46.7”E), R-3 (46°25'3.3”N/141°51'0.7”E) 和R-4(48°00'48.6”N/142°82'14.3”E)。去掉樣品表層約5 cm, 采集5～20 cm處沉積物樣品, 用滅菌的50 mL離心管 4℃暫時保存, 帶回實驗室后立即進行菌株分離。所有采樣工具均事先經(jīng)過無菌消毒。

1.1.2 分離培養(yǎng)基

2216E培養(yǎng)基(H)： 蛋白胨5 g, 酵母提取物1 g,瓊脂15 g。用1 000 mL 海水配制, pH 7.5。

R2A培養(yǎng)基(R)： 蛋白胨0.5 g, 酵母提取物0.5 g,葡萄糖0.5 g, 淀粉0.5 g, K2HPO40.3 g, MgSO40.05 g,丙酮酸鈉0.3 g , 瓊脂15 g。用1 000 mL 海水配制,pH 7.0。

M1培養(yǎng)基(M)： 蛋白胨2 g, 酵母提取物1 g, 可溶性淀粉10 g , 瓊脂15 g。用1 000 mL海水配制, pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 海洋細菌的分離

分別稱取沉積物樣品2 g, 加入到無菌的0.1%焦磷酸鈉溶液中, 在25 ℃、150 r/min條件下振蕩20 min。用生理鹽水(0.9%, NaCl)對樣品進行10倍系列稀釋,涂布在三種不同的固體培養(yǎng)基上, 25℃培養(yǎng) 7 d, 根據(jù)菌落形態(tài)、顏色等特征挑取不同單菌落, 每個菌落純化至少 2次。鏡檢合格后進行革蘭氏染色和菌體形態(tài)觀察拍照, 用 25%甘油將純化菌株保存于-80℃超低溫冰箱。所有步驟均按無菌操作進行。

1.2.2 海洋細菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

分離純化菌株用酚/氯仿抽提和乙醇沉淀法[1]進行細菌總DNA的提取。PCR采用細菌16S rRNA基因擴增通用引物, 27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3′), 1541r(5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)。PCR 反應條件(30 個循環(huán))： 94 ℃預變性, 4 min； 94 ℃變性 1 min； 55 ℃復性 1 min； 72 ℃延伸 1 min, 共 30個循環(huán)； 最后 72 ℃延伸 10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳, 獲得約 1.5 Kb的單一條帶,再經(jīng)切膠和試劑盒(天根生化科技有限公司產(chǎn)品)純化后, 送深圳華大基因科技有限公司進行雙向全長序列測定。序列通過在 NCBI網(wǎng)站 GenBank進行Blastn比對, 找到相似性最高且是有效發(fā)表的典型菌株序列, 用 Clustal X 和 Mega 5.0軟件(采用Neighbor-joining方法)構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

本研究首先采用 27f單向引物對分離菌株進行16S rRNA基因的PCR擴增和測序, 然后根據(jù)測序結果比對后進行排重, 剩余菌株再進行 27f、1541r雙向引物的全長序列測定。

2 結果與分析

2.1 分離菌株的測序結果與比對

本研究從采集樣品中共分離得到82株可培養(yǎng)細菌菌株。經(jīng)菌前期菌落、菌體形態(tài)觀察、革蘭氏染色、以及27f單引物初步測序后進行排重, 最終合并選取其中45株代表性菌進行雙向全長16S rRNA基因(1.4～1.5 kb)測序。測序結果經(jīng)在NCBI的GenBank中比對后, 發(fā)現(xiàn)它們主要分布在4個門、6個綱、27個屬、44個種之中(表1)。其中變形桿菌門(Proteobacteria)為優(yōu)勢菌群(19株), 占所選45株代表菌比對種類的42.2%； 放 線 菌 門 (Actinobacteria)、 厚 壁 菌 門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)分別占總體的20.0%、20.0% 和 17.8%。從45株代表性菌的分離培養(yǎng)基來看, 有28株是2216E培養(yǎng)基分離得到的, 剩余17株菌是R2A、M1寡營養(yǎng)培養(yǎng)基分離得到的。

2.2 菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析

將 45株代表菌的 16S rRNA基因序列提交GenBank進行注冊(序列號為： KJ456596, KJ456597,KM362864-KM362906), 同時參考 Genbank和韓國EzTaxon 網(wǎng)站的比對結果及相關典型菌株序列, 利用軟件 Clustal X 和 Mega 5.0并采用 Neighborjoining方法, 分別構建了變形桿菌門和擬桿菌門、厚壁菌門和放線菌門細菌的系統(tǒng)發(fā)育樹。分別見圖1、圖2。從圖1和表1可以看出, 本研究分離的優(yōu)勢菌為變形桿菌門(19株, 占45株代表菌比對種類的42.2%), 分布于α- Proteobacteria和γ- Proteobacteria兩個綱。分布于α- Proteobacteria的菌株主要包括紅細菌目(Rhodobacterales)和鞘脂單胞菌目(Sphingomonadales)。

其中屬于紅細菌目的有： 副球菌屬(Paracoccus)、簡納西氏菌屬(Jannaschia)、熱帶單胞屬(Tropicimonas)、十八桿菌屬(Octadecabacter)、淺玫瑰色洛克氏菌屬(Loktanella)、居黃海屬(Seohaeicola)和亞硫酸鹽桿菌屬(Sulfitobacter)。從16S rDNA 序列相似性來看, 菌株R-1-M-3同分離自日本海Chazhma Bay沉積物的淺玫瑰色洛克氏菌(L.rosea)[2]的相似性為 99.7%；菌株 R-3-M-5-3同來自韓國東海海水的海亞硫酸鹽桿菌(Sulfitobacter marinus)[3]的相似性為 99.8%； 菌株R-3-H-5同來自日本海Troitza Bay海草的可疑亞硫酸鹽桿菌(S.dubius)[4]的相似性為99.6%； 而菌株R-1-H-3、R-4-M-3、R-1-R-9和R-2-R-1同它們系統(tǒng)發(fā)育關系最近的模式菌株相似性均在97.3 %～98.1%之間, 以相似性大于98.5%作為同一個物種來估算[5-6](前提是 DNA-DNA雜交同源性≥70%, 且有獨特生理生化等表型性狀), 這 4株細菌有可能分別代表著副球菌屬、熱帶單胞屬、十八桿菌屬和居黃海屬內(nèi)的潛在新種。在鞘脂單胞菌目中只有 R-1-M-12、R-1-R-17和 R-1-M-4-1 這 3株菌, 均屬于色桿菌屬(Erythrobacter)。其中菌株R-1-M-12與分離自日本神奈川的Aburatsubo內(nèi)灣海藻的長紅色桿菌(Erythrobacter longus)[7]的16S rRNA基因序列相似性為99.7 %； 菌株 R-1-M-4-1 與潮汐紅色桿菌的模式菌株E. gaetbuliSW-161T系統(tǒng)發(fā)育關系最近[8], 16S rRNA基因序列相似性僅為97.7%, 依據(jù)上述定種原則, 該菌株也可能是色桿菌屬內(nèi)的一個潛在新種。

分布于 γ-Proteobacteria的菌株主要包括交替單胞菌目(Alteromonadales)、海洋螺菌目(Oceanospirillales)和假單胞菌目(Pseudomonadales)。其中菌株R-4-R-4與分離自俄羅斯西伯利亞凍土的鹽晶嗜冷桿菌Psychrobacter cryohalolentis的16S rRNA基因序列近乎相同(99.9%)[9]； 菌株R-3-M-11同分離自韓國南海海水的快生嗜冷桿菌Psychrobacter celer[10]的16S rRNA基因序列相似性為 99.2%； 菌株 R-2-H-2-1同分離自韓國濟州島黑沙灘的玄武巖希瓦氏菌Shewanella basaltis的16S rRNA基因序列相似性為99.1%； 而菌株 R-2-M-13 同解脂海桿狀菌(Marinobacter lipolyticus)模式菌株的16S rRNA基因序列相似性為 97.9%[11], 亦可初步判定可能為海桿狀菌屬內(nèi)的一個潛在新種。

表1 俄羅斯庫頁島潮間帶沉積物可培養(yǎng)細菌的分布Tab.1 Distribution of culturable bacteria isolated from intertidal sediments samples of Russian Sakhalin Island

圖1 變形細菌門細菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 1 Phylogenetic relationships of culturable bacterial strains related to the Proteobacteria.

從圖 2和表 1看出, 有 9株菌分布于放線菌門(Actinobacteria)的放線菌綱(Actinobacteria C)。其中菌株 R-1-R-13-1與分離自韓國濟州島海水的海水微桿菌Microbacterium aquimaris的系統(tǒng)發(fā)育關系最近, 16S rRNA 基因序列近乎相同(99.9%)； 菌株R-3-M-4-1與分離自韓國東海阿穆爾斯克灣海水的阿穆爾斯克灣鹽地桿菌Salinibacterium amurskyense的 16S rRNA基因序列也近乎相同(99.9%), 推測菌株 R-1-R-13-1和 R-3-M-4-1分別與M.aquimaris和S.amurskyense為同一物種或菌株。而菌株 R-4-M-5和 R-4-H-33與相似性最高的、分離自日本 Shinjiko湖泊近岸沉積物的湖泊微桿菌(M.lacus)和法國利摩日高鈾土壤的利摩日微桿菌(M. lemovicicum)[12]的 16S rRNA基因序列相似性分別為98.3%和98.1%, 推測有可能是微桿菌屬內(nèi)的2個潛在新種。剩余5株菌中, 除R-4-H-3與Demequina flavaHR08-7T的相似性為98.8%外, 其他菌株與最近標準菌株的相似性均大于98.3%。

圖2 擬桿菌門、厚壁菌門和放線菌門細菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic relationships of culturable bacterial strains related to Actinobacteria, Firmicutes and Bacteroidetes.

厚壁菌門(Firmicutes)細菌在近海和淺海沉積物中較為常見[13]。本研究表明, 分布于厚壁菌門的 9株菌均屬于桿菌綱(Bacilli)。其中菌株 R-1-R-2A與分離自韓國黃海的 Daepo海灘灘涂的海微小桿菌Exiguobacterium marinum的16S rRNA基因序列幾乎相同(99.9%)； 菌株R-1-R-7-1和R-4-H-7同分離自韓國黃海灘涂的近海游動球菌Planococcus maritimus系統(tǒng)發(fā)育關系最近(相似性分別是 99.64%, 99.58%)；菌株R-1-R-11同分離自韓國東海Hwajinpo海灘海水的花津灘芽孢桿菌(Bacillus hwajinpoensis)的 16S rRNA基因序列相似性為99.6%[14]。

擬桿菌門(Bacteroidetes)細菌在海洋中分布也十分廣泛, 并且在很多水體和海洋沉積物中有較高的豐度, 很多擬桿菌能產(chǎn)生各種各樣的胞外水解酶,經(jīng)常與藻類形成共生關系, 還可以在大型海洋生物表面或內(nèi)部生長[15]。本研究發(fā)現(xiàn)共有 8個菌株屬于擬桿菌門, 其中R-3-M-5-2屬于圓桿菌科(Cyclobacteriaceae)的食冷菌屬(Algoriphagus), 它同分離自日本海綠藻Acrosiphonia sonderi的維氏嗜冷菌Algoriphagus winogradskyi[16]的16S rRNA基因序列相似性為100%, 可能為同一菌株。其余7株菌均屬于黃桿菌科(Flavobacteriaceae), 其中菌株 R-1-M-5A同分離自日本海紅藻(Polysiphonia japonica)的多管藻海狀桿菌(Maribacter polysiphoniae)[17]的系統(tǒng)發(fā)育關系最近, 16S rRNA基因序列相似性為99.9%； 菌株 R-4-R-7同分離自日本海海水樣品的居水海菌(Maribacter aquivivus)的16S rRNA基因序列相似性為99.4%； 菌株R-3-M-8同分離自韓國褐藻的水域華美菌(Formosa undariae)的16S rRNA基因序列相似性為 99.2%； 菌株 R-1-R-2同分離自日本海 Troitsa灣海膽(Strongylocentrotus intermedius)的米氏海藻桿菌(Algibacter mikhailovii)的16S rRNA基因序列相似性為99.6%； 而菌株R-2-R-3-1同分離自韓國Gangjin灣海水的港津極地桿菌(Polaribacter gangjinensis)的16S rRNA基因序列的相似性只有94.2%, 依據(jù)現(xiàn)行國際細菌分類規(guī)則, 極有可能是不同于極地桿菌屬(Polaribacter)的一個潛在新屬。

3 討論

各種特殊生態(tài)環(huán)境是獲取微生物新種質(zhì)資源的有效途徑, 也是進行微生物新型生物活性物質(zhì)研發(fā)的基礎。本研究采用常規(guī)2216E培養(yǎng)基以及R2A、M1兩種寡營養(yǎng)培養(yǎng)基, 首次對俄羅斯庫頁島潮間帶沉積物的可培養(yǎng)細菌進行了分離, 并做了基于 16S rRNA基因序列分析的系統(tǒng)發(fā)育多樣性研究。從培養(yǎng)分離效果來看, 常規(guī) 2216E培養(yǎng)基所分離菌株的多樣性要稍高于R2A和M1寡營養(yǎng)培養(yǎng)基。從系統(tǒng)發(fā)育分析結果來看, 所選擇的45株菌共分布于6個綱、27個屬、44個種。其中以變形菌門為優(yōu)勢菌群, 占45株代表菌株的 42.2%； 而分布于放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)的細菌所占比例基本相當, 分別20.0%、20.0% 和 17.8%。這些菌株大部分與分離自日本和韓國近海的細菌在系統(tǒng)發(fā)育關系上非常接近,推測它們有可能是通過海水環(huán)流等因素在太平洋北部海域之間進行擴散所致。另外我們還從分離菌株中發(fā)現(xiàn)有 8株菌(R-1-H-3、R-4-M-3、R-1-R-9、R-2-R-1、R-1-M-4-1、R-2-M-13、R-4-M-5、R-4-H-33)與相應關系最近的標準模式菌株的 16S rRNA基因序列相似度在97.3%～98.3%, 1個菌株(R-2-R-3-1)的相似度為 94.2%。按照以往國際細菌分類通用規(guī)則,16S rRNA基因序列相似度＜97.0%和＜95.0%分別是確定新種群與新屬的必要前提之一[18]。然而由于16S rRNA基因序列的局限性, 在某些特殊情況下(如菌株具有比較明顯的生理、生化、生態(tài)特征,DNA-DNA雜交結果與16S rRNA基因序列比對結果互不相符等情況), 這一規(guī)則被人們進行不同程度地重新考量[5-6]。綜合近些年IJSEM上發(fā)表的新種、屬文獻, 并根據(jù)Mincheol Kim等人[19]2014年對細菌種間 16SrDNA序列相似性的最新研究標準(即 16S rRNA 基因序列相似度＜98.5%的菌株均具有成為新種的可能)。我們認為上述8株菌有成為潛在新種的可能, 而菌株R-2-R-3-1也已滿足成為新屬的必要條件之一, 當然這尚需DNA-DNA雜交、G+C mol%、生理生化表性特征等多項分類數(shù)據(jù)進行相互印證后方可確定。本研究表明俄羅斯庫頁島潮間帶沉積物中細菌具有非常高的物種多樣性, 該結果可為進一步研究海洋細菌的區(qū)域性生物地理學提供有益參考。

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