趙 麗 , 彭一良, 康 天, 蔡偉民

(1. 哈爾濱工業(yè)大學(xué) 市政環(huán)境工程學(xué)院, 黑龍江 哈爾濱 150080； 2. 哈爾濱師范大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150025)

雙水相(Aqueous two-phase systems, ATPS)是一種新型的分離純化技術(shù)[1]。體系中的兩相都是水溶液,操作條件溫和[2], 系統(tǒng)的含水量高達(dá) 75%～90%, 為親水性很強(qiáng)的生物物質(zhì)提供了適宜的環(huán)境, 而且不會(huì)引起生物物質(zhì)的失活和變性。因此, 雙水相技術(shù)已廣泛的應(yīng)用于生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化工等物質(zhì)分離提純領(lǐng)域[3-4]。但由于傳統(tǒng)雙水相的原料聚乙二醇和葡聚糖成本太高, 目前真正工業(yè)化的例子還很少。

藻藍(lán)蛋白(C-phycocyanin, C-PC )是一種水溶性藍(lán)色熒光蛋白, 廣泛存在于藍(lán)藻中。C-PC一般由等摩爾的α 和β亞基聚合構(gòu)成, 每個(gè)α亞基或β亞基含有至少 1個(gè)直鏈四吡咯化合物的藻膽素(Phycobilins)發(fā)色團(tuán)[5], 使C-PC呈現(xiàn)鮮亮的藍(lán)色, 因此C-PC常作為天然色素應(yīng)用于食品、添加劑和化妝品領(lǐng)域[6]。此外, 由于C-PC還具有高效的熒光特性,也廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥保健領(lǐng)域、化學(xué)光敏劑, 以及熒光分析等領(lǐng)域[7]。藻藍(lán)蛋白純化工藝復(fù)雜、成本高、步驟繁多、回收低, 導(dǎo)致天然藻藍(lán)蛋白的市場(chǎng)價(jià)格高達(dá)50美元/mg[8]。螺旋藻是國內(nèi)外的一種經(jīng)濟(jì)型藍(lán)藻,年產(chǎn)高于2 000 t。螺旋藻的蛋白質(zhì)含量可達(dá)干重的70%以上, 其中, 藻藍(lán)蛋白的含量超過 20%[9], 因此,常被作為提取C-PC的首選藍(lán)藻。國內(nèi)、外通常采用新鮮的螺旋藻作為提取原料。近年來, 國內(nèi)已開始選用干藻粉作為提取C-PC原料。

分離純化藻蛋藍(lán)白的主要方法是進(jìn)行多級(jí)色譜柱層析[10-11]。其操作步驟繁多、產(chǎn)量少[12-13], 不適合于工業(yè)化生產(chǎn)。近年來, 雙水相萃取分離技術(shù)已開始被應(yīng)用于藻藍(lán)蛋白的分離純化。國外學(xué)者應(yīng)用PEG4000/磷酸鉀體系[14], 獲得了藻藍(lán)蛋白的高純度。但 PEG4000黏度較高, 分相時(shí)間較長, 而且C-PC富集于 PEG4000中, 高黏度增加了PEG去除的難度。國內(nèi)學(xué)者應(yīng)用PEG2000/硫酸銨雙水相體系獲得藻藍(lán)蛋白[15], 但最終純度較低僅達(dá)到1.2。

本文采用廉價(jià)的PEG1000/酒石酸鉀鈉雙水相體系, 分離純化 C-PC, 有效降低了體系黏度。研究雙水相分離純化規(guī)律, 分析分離萃取過程中, 各種條件因素的影響情況及相互作用關(guān)系, 從而優(yōu)化雙水相體系參數(shù)。實(shí)現(xiàn)高效、低成本、易操作的藻藍(lán)蛋白提取, 為藻藍(lán)蛋白能夠得到廣泛應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

干螺旋藻藻粉購買于中國海洋大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院。

聚乙二醇、磷酸鹽、硫酸銨、酒石酸鉀鈉等(分析純)購買于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。UV-2102 PC型紫外-可見光分光光度計(jì), 中國上海尤尼克公司； 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(TGL-16MI)長沙湘麓離心機(jī)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 藻藍(lán)蛋白的粗提液

準(zhǔn)確稱取6 g干螺旋藻藻粉, 溶于0.01mol/L磷酸鹽緩沖液, 混合均勻。采用反復(fù)凍融法： -20℃冷凍,室溫融化, 反復(fù)凍融6次。10 000 r /min 離心10 min,收集上清液, 4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 雙水相體系

選擇PEG /鹽雙水相體系。其中鹽溶液分別為磷酸鉀, 磷酸鈉, 硫酸銨, 酒石酸鉀鈉。繪制體系相圖,根據(jù)相圖計(jì)算配比, 選取不同體系組成。將不同配比與粗提液混合均勻, 4℃靜置, 分別記錄上、下相分層情況, 上、下相體積, 取少量待測(cè)。

1.2.3 雙水相系統(tǒng)參數(shù)

純度[12-14,16-17](P)： 目的蛋白在620 nm處的特征吸光值和總蛋白在280 nm處吸光值的比值。

純化因子(F)： 目的產(chǎn)物提純后的純度與粗提液純度的比值。

分配系數(shù)(K)： 目的蛋白在上相和下相濃度的比值。C-PC易富集于上相PEG中。實(shí)驗(yàn)證明它在上相的濃度為0.1 g/L時(shí), 在下相濃度是接近0.0 001 g/L。因此下相C-PC的濃度可忽略。

系線長(TLL)： 雙水相系統(tǒng)的上相和下相的濃度總組成的關(guān)系。它通常反應(yīng)了ATPS系統(tǒng)構(gòu)成對(duì)分離材料的影響效果。

體積比(Vr)： 體系上相和下相的體積比。

1.2.4 多次雙水相

取一定量的上一次 ATPS獲得的 PEG溶液, 按照一定的配比與一定量的同種鹽溶液混合均勻, 4℃靜置, 分別記錄上、下相分層情況, 上、下相體積, 取少量待測(cè)。其他參數(shù)保持和一次ATPS一致。

1.2.5 分析方法

采用紫外-可見光分光光度計(jì)對(duì)上相溶液進(jìn)行全波長掃描, 起始波長260 nm, 終止波長700 nm。記錄不同波長處的吸光值。

采用熒光發(fā)射光譜測(cè)定C-PC的活性。熒光發(fā)射光譜的激發(fā)波長為560 nm。掃描范圍由580 nm到770 nm。

數(shù)據(jù)分析運(yùn)用ORIGN 8.5, MATLAB R2008a。

2 結(jié)果與分析

2.1 螺旋藻藻粉的細(xì)胞學(xué)形態(tài)

光學(xué)顯微鏡下觀察螺旋藻的細(xì)胞學(xué)形態(tài)(10倍)見圖1?？梢娫宥纬事菪隣睢-PC粗提液純度為0.42。

圖1 螺旋藻藻粉的細(xì)胞學(xué)形態(tài)Fig. 1 The morphology of the dry spirulina platensis powder

2.2 不同鹽相對(duì)C-PC純度的影響

在TLL為27%±1%、Vr為1, PEG分子質(zhì)量一定的情況下, 比較不同的鹽相(磷酸鈉、磷酸鉀、酒石酸鉀鈉、硫酸銨)對(duì)C-PC純度的影響, 結(jié)果見圖2。C-PC的等電點(diǎn)為 4.0。硫酸銨、磷酸鈉、磷酸鉀、酒石酸鉀鈉構(gòu)成的雙水相體系的 pH均超過等電點(diǎn)(pH分別為 4.80、5.85、6.80、8.06)[16], 理論上這四種鹽都適合C-PC的提取。因?yàn)辂}相中正負(fù)離子的存在, 對(duì)體系中分子具有不同的親和力, 并產(chǎn)生電位差, 因此, 選擇最佳的鹽相對(duì) C-PC的提純非常重要。PEG分子質(zhì)量從1 000到4 000的各雙水相體系中, 酒石酸鉀鈉構(gòu)成的雙水相體系對(duì)C-PC提取效果最好?？赡苁且?yàn)榫剖徕涒c可以更好的改變蛋白質(zhì)的疏水性和相間電位的程度, 從而影響蛋白質(zhì)解離基團(tuán)的解離度, 提高了 C-PC在上相 PEG中的富集。所以選擇酒石酸鉀鈉作為鹽相, 進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖2 不同鹽相對(duì)C-PC純度的影響Fig. 2 The influence of different salts phase on the purity of C-PC

2.3 不同PEG分子質(zhì)量對(duì)C-PC純度的影響

在Vr為1,TLL為21.65% 的PEG /酒石酸鉀鈉雙水相體系中, 比較不同的PEG分子質(zhì)量(1 000、1 500、2 000、4 000), 對(duì)C-PC純度的影響, 以C-PC純度為縱坐標(biāo), PEG分子質(zhì)量為橫坐標(biāo), 結(jié)果見圖3。PEG 1 000體系提取效果最好。在圖 2中,TLL為27%±1%時(shí), 也得到同樣的結(jié)果： PEG 1000體系提取效果最好。PEG分子端具有很多游離的具有一定親水性的羥基。在PEG相組成一定時(shí), PEG分子質(zhì)量的增加, 分子鏈長增加, 雙水相體系中游離羥基的數(shù)量減少, 分子內(nèi)極性基團(tuán)的比重相對(duì)降低, 極性減小, 從而富含PEG的上相的親水性減小。C-PC是一種高親水性蛋白, 低分子質(zhì)量的 PEG有利于親水性的C-PC到達(dá)富含PEG的上相。此外, PEG分子質(zhì)量的減小, 會(huì)使體系黏度降低, 空間阻力減小, 界面張力減小, 蛋白在相間的傳遞及在相中的擴(kuò)散阻力大大減小, C-PC分子遠(yuǎn)離界面, 更易進(jìn)入上相PEG, 從而導(dǎo)致C-PC純度增加。PEG 1 000的提取效果最好, 基本符合了分子質(zhì)量越低越利于蛋白質(zhì)富集的規(guī)律。

圖3 體系PEG分子質(zhì)量對(duì)C-PC純度的影響Fig. 3 The influence of PEG molecular weight on the purity of C-PC

2.4 TLL對(duì)C-PC純度的影響

TLL是雙水相體系組成的關(guān)鍵因素, 其中的每個(gè)點(diǎn)都代表著不同 PEG和鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的組成成分。分子質(zhì)量高于10 000 親水性蛋白, 比較容易進(jìn)入TLL小于 40%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的雙水相體系[18]。因此在PEG1 000和酒石酸鉀鈉雙水相體系中, 選擇中、短的TLL(質(zhì)量分?jǐn)?shù))： 14.66%、21.65%、26.51%、30.26%、33.47%。在Vr一定的情況下, 比較不同TLL對(duì)C-PC純度的影響, 以C-PC純度為縱坐標(biāo),Vr為橫坐標(biāo), 結(jié)果見圖4。C-PC的純度與TLL呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。當(dāng)Vr一定時(shí), C-PC的純度隨TLL的增加, 呈下降趨勢(shì),即TLL越大, C-PC的純度越低。TLL為14.66%時(shí), 其C-PC的純度雖然最高, 但其相分離的時(shí)間很長, 因?yàn)門LL越小, 越接近雙結(jié)線, 越接近臨界值。TLL為21.65%時(shí), 其C-PC的純度僅略低于TLL為14.66%, 但相分離的時(shí)間較短, 因此, 選擇TLL為21.65%繼續(xù)試驗(yàn)。

圖4 TLL對(duì)C-PC純度的影響Fig. 4 The influence of TLL on the purity of C-PC

2.5 不同Vr對(duì)C-PC純度的影響

Vr對(duì)C-PC純度的影響非常顯著。在TLL一定的情況下, 比較不同的上、下相體積比Vr對(duì) C-PC純度的影響。以C-PC純度為Z軸坐標(biāo),Vr為Y軸坐標(biāo),TLL為X軸坐標(biāo), 結(jié)果見圖5。C-PC的純度與Vr呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。當(dāng)TLL一定時(shí), C-PC的純度隨著Vr的減少, 呈上升趨勢(shì)即Vr越小, C-PC的純度越高。在TLL為21.65%,Vr為 0.22時(shí), C-PC的純度最高達(dá)到1.27。Vr變小, 即上相體積減少, 使上相可利用空間減少, 總蛋白的空間變小, 非目的蛋白隨著下相體積的增大, 更多分配到下相, 目的蛋白C-PC的純度提高。其他藻也表現(xiàn)出相同的分離行為[8]。但是與PEG4000提取新鮮螺旋藻[14]表現(xiàn)出行為正好相反?？赡苁且?yàn)?PEG的分子質(zhì)量的增大, 影響了雙水相體系的疏水性。

圖5 Vr對(duì)C-PC純度的影響Fig. 5 The influence of Vr on the purity of C-PC

2.6 不同TLL和Vr對(duì)C-PC回收率的影響

不同的TLL和不同的Vr對(duì)C-PC回收率的影響。以C-PC回收率為Z軸坐標(biāo),Vr為Y軸坐標(biāo),TLL為X軸坐標(biāo), 結(jié)果見圖6。Vr對(duì)C-PC回收率的影響非常顯著。在不同的TLL中, 回收率和Vr呈現(xiàn)明顯的正相關(guān), 隨Vr的減少, 回收率呈下降趨勢(shì)。在TLL33.47%,Vr 2.11處C-PC的回收率最高達(dá)到95.64%。在體系獲得最高純度 1.27, 回收率為 85.11%。雖然體系對(duì)C-PC的最大回收率在TLL為33.47%處獲得,但當(dāng)Vr一定時(shí),TLL對(duì)回收率的影響并不顯著。所有配比的回收率均高于85%。

圖6 系統(tǒng)TLL和Vr對(duì)C-PC回收率的影響Fig. 6 The influence of TLL and Vr on the yield of C-PC

2.7 不同相組成質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì) C-PC純度的影響

分別在不同TLL上選取不同PEG1 000和酒石酸鉀鈉相組成配比建立雙水相體系, 確定最優(yōu)組成。以C-PC純度為Z軸坐標(biāo), PEG1 000質(zhì)量分?jǐn)?shù)為Y軸坐標(biāo), 酒石酸鉀鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為X軸坐標(biāo), 結(jié)果見圖7。PEG1000和酒石酸鉀鈉構(gòu)建的雙水相體系的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為7.76%和21%, pH 8.06, 系線長21.65%、體積比 0.22純化效果最佳, 純度由 0.42提高到 1.27,純化因子3.04, 回收率85.11%。

圖7 相組成濃度對(duì)純度的影響Fig. 7 The influence of components in the ATPS on the purity of C-PC

2.8 多次ATPS對(duì)純度的影響

硫酸銨鹽析法, 提高粗提液純度達(dá)到1.46。選擇上述最優(yōu)條件, 建立 PEG/酒石酸鉀鈉雙水相體系。按照一次ATPS配比, 建立多次ATPS。以純度作為Z軸坐標(biāo), 雙水相體系萃取(ATPE)的次數(shù)作為X軸坐標(biāo), 結(jié)果見圖8。2次ATPE萃取獲得最高純度3.28,明顯高于1次、3次和4次ATPE的萃取結(jié)果。

2.9 C-PC的吸收光譜

圖8 多次ATPS對(duì)C-PC純化因子的影響Fig. 8 The influence of multiple ATPE stages on the purity of C-PC

采用紫外-可見光分光光度計(jì)對(duì)硫酸銨鹽析、2次 ATPS提取的 C-PC進(jìn)行全波長掃描, 起始波長260 nm, 終止波長700 nm, 結(jié)果見圖9。

圖9 C-PC的吸收光譜Fig. 9 The absorption spectrum of the recovery C-PC

2.10 C-PC的熒光測(cè)定

測(cè)定2次ATPS提取的C-PC的熒光光譜, 結(jié)果見圖10。C-PC具有熒光, 峰值在643 nm獲得。經(jīng)過ATPS萃取提純的C-PC, 具有熒光, 在643 nm處獲得峰值, 相對(duì)熒光強(qiáng)度 155.5, 具有的很好的生物活性。

圖10 C-PC的熒光發(fā)射光譜Fig. 10 The fluorescence emission spectrum of the recovery C-PC

3 結(jié)論

采用廉價(jià)的 PEG1000/酒石酸鉀鈉雙水相體系,從干螺旋藻中分離純化 C-PC。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 雙水相體系濃度為 7.76% (w/w)的 PEG1000、21%(w/w)的酒石酸鉀鈉、TLL為21.65%、Vr為0.22, pH為 8.06時(shí), 蛋白的純度為1.27, 回收率為85.11%。硫酸銨鹽析法提高粗提液純度, 經(jīng)過2次ATPS, C-PC純度可提高到3.28, 高于藥品級(jí)3.0。獲得的 C-PC具有熒光, 生物活性良好。

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