孫宗紅 , 劉志剛 , 歐燕燕 , 朱曉聞 劉 超 , 劉錦上

(1. 廣東海洋大學 水產(chǎn)學院, 廣東 湛江 524025; 2. 廣東高校熱帶海產(chǎn)無脊椎動物養(yǎng)殖工程研究中心, 廣東 湛江 524025; 3. 湛江銀浪海洋生物技術(shù)有限公司, 廣東 湛江 524025)

擴增片段長度多態(tài)性(Amplified Fragment Length Polymorhism, AFLP)是1993年由荷蘭Keygene公司科學家發(fā)明的一種 DNA分子標記技術(shù)[1], 該技術(shù)既繼承了RFLP的穩(wěn)定性, 又具有PCR反應快速、靈敏的特點, 同時克服了RFLP和RAPD的缺點, 且擴增的帶紋多(50～100條)。AFLP的擴增片段與基因組的單一位置相對應, 且該標記為孟德爾式遺傳, 可以作為聯(lián)系遺傳圖譜和物理圖譜的一個橋梁。

貝類殼色作為一個可遺傳的質(zhì)量性狀, 已經(jīng)被相關學者[2]成功應用到實際工作中。華貴櫛孔扇貝是我國南方海域重要經(jīng)濟貝類, 近年來, 一些學者[3-7]對其生理和育種進行了大量研究。但相對于其他經(jīng)濟貝類如馬氏珠母貝來講, 采用分子標記來對華貴櫛孔扇貝輔助育種的研究則非常少[8-9], 而對其不同殼色選育系 AFLP分析的研究尚未見報道。本文應用 AFLP標記技術(shù)對華貴櫛孔扇貝四種殼色家系進行了遺傳多樣性分析, 旨在為該貝殼色的定向選育提供遺傳理論基礎, 加快從家系到殼色品系的建立, 并期望以此為基礎, 篩選出與華貴櫛孔扇貝顏色性狀連鎖的基因, 為華貴櫛孔扇貝遺傳圖譜的構(gòu)建提供參考。

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

實驗材料為本實驗室選育的紫頂棗褐殼色(PBB)、棗褐殼色(BB)、紫白殼色(PW)和橘黃殼色(O)4種殼色選育系F1代(見圖1)。隨機挑選以上4種殼色華貴櫛孔扇貝選育系F1代個體各30只, 清洗干凈, 取少量閉殼肌(約 50 mg)用于基因組 DNA的提取, 剩余部分閉殼肌分裝浸泡于無水乙醇中, –80℃保存。

1.1.2 引物及主要藥品

本試驗所用引物(表1)均由上海生工生物工程有限公司合成; Taq 酶、T4 DNA連接酶、EcoRⅠ內(nèi)切酶、MseⅠ內(nèi)切酶、DNA Maker DL2000、100 bp等均購自Takara公司; DNA提取試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司。

1.2 AFLP實驗步驟

1.2.1 基因組DNA的提取、酶切及連接反應

本實驗使用DNA提取試劑盒提取基因組DNA,1%的瓊脂糖凝膠檢測, 用 Eppendorf核酸蛋白測定儀測定其純度, 將DNA提取物稀釋至300 ng/μL左右, 4℃保存。采用EcoRⅠ和MseⅠ雙酶切方法酶切基因組 DNA, 37℃條件下EcoR I酶切 3 h, 65℃30 min終止反應, 將酶切產(chǎn)物65℃MseⅠ酶切3 h, 80℃30 min終止反應后馬上進行連接反應, 16℃過夜, 65℃處理10 min終止反應。

圖1 四種不同殼色華貴櫛孔扇貝Fig. 1 Four kinds of Chlamys nobilis with different shell colors

表1 實驗所使用的引物Tab. 1 All the primers used in the experiment

1.2.2 預擴增及選擇性擴增反應

將連接產(chǎn)物進行預擴增反應, 94℃預變性2 min;94℃ 30 s, 56℃ 30 s, 72℃ 2 min, 共 23 個循環(huán); 60℃延伸30 min, 產(chǎn)物4℃保存, 將產(chǎn)物稀釋20倍進行選擇性擴增反應, 選擇擴增反應體系: 1.5μL10×PCR Buffer(含 Mg2+), 1.2 μL dNTPs(2.5 mmol/L), 1.0 μLEcoRⅠ引物 E (5 μmol/L), 1.0 μL MseⅠ引物 M(5 μmol/L), 0.1 μL Taq 酶(5 U/μL), 1.0 μL 預擴增稀釋產(chǎn)物, 9.2 μL dd H2O。94℃預變性 2 min; 94℃ 20 s,66℃ 30 s, 72℃ 2 min, 然后每個循環(huán)降低1℃, 經(jīng)10個循環(huán)后退火溫度降低到 56℃, 再進行 20個循環(huán), 條件為94℃ 20 s, 56℃ 30 s, 72℃ 2 min; 60℃延伸30 min。

1.2.3 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

選擇性擴增產(chǎn)物用 5%的聚丙稀烯酰胺凝膠進行電泳分離、銀染, 然后統(tǒng)計擴增位點數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析處理

將圖譜條帶按有記為“1”, 無記為“0”, 轉(zhuǎn)換成 0, 1矩陣, 本實驗按照顯隱性將擴增位點上有帶的視為顯性基因型, 無帶的視為隱性純合基因型。利用Popgene1.31軟件[10]計算多態(tài)位點比例、Shannon多樣性指數(shù)、群體間遺傳分化系數(shù)和遺傳距離, 用MEGA4.1作圖, UPGMA法進行聚類分析, 用SPSS17.0軟件, ANOVA法進行方差分析。

2 結(jié)果

2.1 AFLP擴增結(jié)果

本實驗擴增片段主要集中在150～1 000 bp之間。根據(jù)引物的篩選條件在64個引物組合中選出擴增條帶數(shù)較多且清晰的10對AFLP引物組合, 在100～1 100 bp范圍共擴增出414個位點, 四種殼色的華貴櫛孔扇貝均在62個位點上出現(xiàn)擴增帶, 多態(tài)位點數(shù)為 352個, 引物的多態(tài)性比例分布為79.31%～89.47%,平均為 85.02%, 多態(tài)信息含量較高。平均每個引物組合得到41個擴增位點, 但不同引物組合得到的擴增位點總數(shù)也存在很大差異, 比如 E3M5組合只得到 27個擴增位點(圖 2、表 2), 而 E1M8得到 62個擴增位點(表2)。

表2 實驗選用的10對AFLP引物及擴增結(jié)果Tab. 2 The amplification results of selected ten pairs AFLP primers

圖2 引物E3M5在4種殼色華貴櫛孔扇貝群體中的選擇性擴增結(jié)果Fig. 2 The selective amplification results with primer E3M5 in 4 populations of the Chlamys nobilis

2.2 四種殼色華貴櫛孔扇貝群體內(nèi)遺傳多樣性

表3顯示棗褐群體的多態(tài)性最大為86.04%, 橘黃群體的多態(tài)性最小為67.35%; 10對引物共擴增出414個位點, 而每個群體的總擴增條帶數(shù)都小于414,與總條帶數(shù)相比, 橘黃群體相差最多(71個), 而棗褐群最少(27個)。四個群體的Nei’s(H)指數(shù)在0.307 1～0.349 4之間, 其中, 棗褐群體的遺傳變異最大, 其次是紫白、橘黃, 最小是紫頂棗褐群體。有效等位基因數(shù)(Ne)在1.519 1～1.616 6。Shannon(I)指數(shù)分布在0.452 5～0.513 9之間。四個群體的平均等位基因數(shù)和Shannon(I)與多態(tài)位點比例具有相同的變化趨勢, 均為棗褐群體>紫白群體>紫頂棗褐群體>橘黃群體;平均有效等位基因和Nei’s基因多樣性則是棗褐群體>紫白群體>橘黃群體>紫頂棗褐群體。遺傳參數(shù)顯示,Ht為0.395 4;Hs為0.326 6,Gst為 0.173 9,Nm為2.374 4(表 4), 說明群體間有一定分化, 不同群體間存在遺傳差異, 各種群間存在一定的基因流動。

2.3 四種殼色華貴櫛孔扇貝群體間的遺傳多樣性分析

2.3.1 四個群體間的遺傳距離

四個群體間 Nei’s遺傳距離(表 5)。由表可知,華貴櫛孔扇貝四個群體間之間遺傳距離(D)的變異范圍在0.119 4～0.172 0之間。遺傳距離最遠的是紫頂棗褐群體和紫白群體, 最近的是棗褐群體和紫白群體。

表3 四種不同殼色華貴櫛孔扇貝群體的遺傳結(jié)構(gòu)Tab. 3 Genetic structures of 4 populations of Chlamys nobilis with different shell colors

表4 四個群體內(nèi)的基因多樣性和基因流Tab. 4 Gene diversity and gene flow of four populations

利用UPGMA法構(gòu)建4個群體間的遺傳關系聚類圖(圖 3)。聚類系統(tǒng)發(fā)生樹均分為兩個大支, 其中紫頂棗褐群體聚為一支, 其他三個群體聚為一支,以棗褐和紫白群體遺傳關系最近, 紫頂棗褐群體與其他三個群體遺傳關系最遠。親緣關系由近及遠順次為紫白殼色(PW)、棗褐殼色(BB)、橘黃殼色(O)和紫頂棗褐殼色(PBB)。

2.3.2 群體遺傳多樣性來源的分子方差(AMOVA)分析

應用分子方差分析(AMOVA)方法對4個群體的遺傳多樣性來源進行分析(表6)。由表可知群體內(nèi)的變異占80.16%, 群體間的變異占19.84%。Nei’s遺傳多樣性分析方法與分子方差分析(AMOVA)得出的結(jié)論一致, 群體內(nèi)遺傳變異大于群體間。

表5 華貴櫛孔扇貝群體間的遺傳距離及兩兩種群的遺傳分化指數(shù)Tab. 5 Nei’s genetic distance and pairwise Fst among the stocks of Chlamys nobilis

圖3 四種不同殼色華貴櫛孔扇貝群體間的聚類關系Fig. 3 Phylogenesis of four kinds of Chlamys nobilis with different shell colors

表6 四個群體的AMOVA分析Tab. 6 AMOVA analysis of four populations

3 討論

3.1 四種殼色華貴櫛孔扇貝種群內(nèi)遺傳多樣性分析

薛欽昭等[11]的研究表明海洋貝類具有較高的遺傳變異, 多態(tài)位點比例平均為 46%, 脊椎動物多態(tài)性平均值為24.7%, 且AFLP分子標記很適用于對親緣關系及遺傳上區(qū)別不大的種類的檢測。本實驗就是通過 AFLP檢測分析出華貴櫛孔扇貝物種水平上的多態(tài)位點比例達85.02%(表2、表3), 群體內(nèi)總體的遺傳分化Ht為0.3954(表4), 說明了群體多態(tài)性較高, 群體間存在一定的遺傳分化。從歐燕燕等[12]的研究可知, 橘黃殼色群體本身較多, 同時因市場需求及其經(jīng)濟價值較高, 人們普遍留選橘黃色個體做繁殖親本, 這可能是導致其遺傳多樣性低于其他群體的原因。而大量研究[13-15]也證實, 選育群體的遺傳多樣性會低于自然群體或野生群體。同時也有研究[15-16]證實, 只要保證親本數(shù)量, 選育群體仍可保持較高的遺傳多樣性。本實驗的樣本是來自實驗室培育的4種殼色的華貴櫛孔扇貝選育系F1代, 通過遺傳多樣性分析表明了群體內(nèi)的遺傳多樣性是較為豐富的,均具有較高的遺傳多樣性。

華貴櫛孔扇貝的遺傳多樣性應該是怎樣的水平才算合理, 迄今沒有系統(tǒng)的研究, 也沒有參考的標準, 本研究的數(shù)據(jù)可以作為衡量華貴櫛孔扇貝各群體遺傳變異的一個相對指標。

3.2 四種殼色華貴櫛孔扇貝種群間遺傳多樣性分析

在分子生物學研究方面, 張濤[17]用5個SSR多態(tài)性位點對 3種殼色華貴櫛孔扇貝分析發(fā)現(xiàn)各殼色間具有較高的遺傳多態(tài)性, 存在一定分化。Yuan等[18]對華貴櫛孔扇貝的養(yǎng)殖和野生群體的線粒體 16S rRNA和COI基因片段序列進行了研究, 表明了野生群體的基因差異水平高于養(yǎng)殖群體; Yuan等[9]用373個AFLP和9個微衛(wèi)星標記, 通過擬測交策略分別構(gòu)建了華貴櫛孔扇貝雌性和雄性的遺傳連鎖圖譜。

劉廣緒[19]對櫛孔扇貝、華貴櫛孔扇貝及其二者的種間雜交子代、種內(nèi)近交子代進行了遺傳關系的分析, 發(fā)現(xiàn)雜交子代群體具有較高的遺傳多樣性,且兩種雜交子代間也具有巨大的差異。鄧岳文等[20]研究發(fā)現(xiàn)華貴櫛孔扇貝桔黃殼色群體的各經(jīng)濟性狀均值均顯著大于紫頂棗褐殼色群體。

本研究在 4種殼色華貴櫛孔扇貝群體中, 用 10對選擇性擴增引物共擴增得到 414個位點, 其中多態(tài)性位點 352個, 多態(tài)性比例為 85.02%, 通過計算分析, 其群體間遺傳分化系數(shù)(Gst)為 0.173 9, 基因流動系數(shù)(Nm)2.374 4親緣關系依次為紫白殼色>棗褐殼色>橘黃殼色>紫頂棗褐殼色, 具有較高的遺傳多樣性, 表明了 AFLP技術(shù)適合用于華貴櫛孔扇貝種群的遺傳多樣性研究。盧建峰等[21]對大口黑鱸選育群體遺傳多樣性進行了AFLP分析, 92.48%的遺傳變異來自于群體內(nèi), 表明了大口黑鱸在遺傳上的穩(wěn)定性, 其群體具有一定選育潛力。而本實驗應用分子方差分析方法對 4個群體的遺傳多樣性來源進行分析, 結(jié)果顯示群體內(nèi)遺傳變異占 80.16%,說明各殼色群體具有一定選育潛力, 可繼續(xù)進行人工選育。

3.3 殼色可作為貝類育種標記

在海洋貝類殼色的分子研究方面, 陳靜, 朱曉聞, 代悅等[22-24]各自對馬氏珠母貝 4種殼色的不同選育系進行了研究, 為其定向選育奠定了理論基礎。程鵬[25]研究表明了華貴櫛孔扇貝群體內(nèi)遺傳結(jié)構(gòu)的差異, 造成了不同殼色家系在幼蟲階段生長性狀上的不同。上述研究證實了在海洋貝類的選育中, 利用殼色作為依據(jù)可行, 且在實際應用中也得到了驗證[2]。陳金濤[26]研究表明了華貴櫛孔扇貝不同殼色子代在生長、存活率、出柱率(AP)及性狀參數(shù)間的相關性方面存在顯著差異。本實驗也是以華貴櫛孔扇貝的 4種殼色作為育種標記, 從分子水平上闡明了這 4種殼色選育系 F1代間存在遺傳差異, 群體內(nèi)的遺傳多樣性較高, 群體間存在一定分化, 可繼續(xù)進行選育,為其定向選育提供了理論基礎。

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