田會芹, 李 賢, 傅松哲, 任 香, 王順奎, 王先平, 宋協(xié)法, 劉 鷹

(1. 中國海洋大學, 山東 青島 266100; 2. 中國科學院海洋研究所, 山東 青島 266071; 3. 南昌市疾病預防控制中心, 江西 南昌 330038; 4. 山東東方海洋科技股份有限公司, 山東 煙臺 264003)

殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicha)屬于Aeromonadacea科、氣單胞菌屬(Aeromonas)。它分布范圍廣, 能引起鮭鱒魚類患癤瘡病[1]。同時它也是一些其他水生動物疾病的原發(fā)性病原菌, 可感染大菱鲆[2]、石鰈[3]、刺參[4]等。近幾年, 隨著中國鮭鱒魚養(yǎng)殖產業(yè)的不斷擴大, 殺鮭氣單胞菌引起的病害問題隨之出現(xiàn)。2007年10月至2008年3月在成都市都江堰虹口深溪溝通威大西洋鮭流水養(yǎng)殖廠發(fā)生了大規(guī)模大西洋鮭體表皮膚肌肉潰瘍病, 對養(yǎng)殖業(yè)者造成了嚴重損失[5]。山東東方海洋科技股份有限公司工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖的大西洋鮭也出現(xiàn)了不同程度的病害情況, 并從病魚體內分離得到了殺鮭氣單胞菌。為降低該菌對鮭鱒魚類的危害, 有必要對其生長特性進行研究, 但目前相關研究尚未見報道[6-7]。作者選擇從養(yǎng)殖生產系統(tǒng)分離出的殺鮭氣單胞菌菌株,進行了不同溫度及pH條件下的生長實驗研究, 繪制了不同條件下殺鮭氣單胞菌的生長曲線, 闡明了溫度及pH對其生長的影響, 為在養(yǎng)殖生產過程中通過調控水體溫度及pH等環(huán)境因子, 抑制殺鮭氣單胞菌生長, 降低養(yǎng)殖魚類發(fā)病率提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicha), 從山東東方海洋科技股份有限公司養(yǎng)殖的大西洋鮭患病個體分離得到, 保藏于中國科學院海洋研究所實驗室,保藏編號是CGMCC No. 7335。

1.2 培養(yǎng)基制備

(1) LB液體培養(yǎng)基: 蛋白胨 10 g, 酵母粉 5 g,氯化鈉10 g, 蒸餾水1 L, 121 ℃, 15 min滅菌。

(2) 2216E瓊脂: 青島海博生物技術有限公司生產, 按配制說明配制。

1.3 實驗方法

1.3.1 殺鮭氣單胞菌的活化培養(yǎng)

將保藏的殺鮭氣單胞菌接種于 2216E瓊脂平板上, 28℃恒溫培養(yǎng), 長出菌落后, 將單菌落接種于100 mL滅菌LB液體培養(yǎng)基中180 r/min、28 ℃恒溫培養(yǎng)18 h作為種子液。

1.3.2 不同溫度下殺鮭氣單胞菌生長實驗

取1.3.1中所述種子液, 按5%接種量接種于300 mL無菌LB液體培養(yǎng)基中, 充分搖勻后分裝成3份, 于28 ℃下靜置培養(yǎng), 每隔2 h取樣, 以無菌LB液體培養(yǎng)基作對照, 用紫外分光光度計檢測菌液A600值, 同時另取菌液進行梯度稀釋, 于 2216E瓊脂平板涂布計數(shù), 統(tǒng)計數(shù)據(jù), 繪制其在該溫度下的生長曲線。其他溫度(15、10、5℃)梯度條件下實驗方法類同。

1.3.3 不同pH條件下殺鮭氣單胞菌生長實驗

取5瓶200 mL滅菌LB液體培養(yǎng)基, 無菌操作,用1.0 mol/L NaOH調節(jié)pH值分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0, 以 5%接種量各接入相同濃度的種子液(同1.3.1), 混勻后分裝到已滅菌的試管中, 每支 10 mL,做好標記, 置于180 r/min、28 ℃恒溫培養(yǎng), 每隔2 h取出對應的試管, 測定菌液A600, 并在實驗過程中定時檢測菌液pH值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)實驗測得的A600值及平板計數(shù)得到的細菌對數(shù)值, 繪制不同溫度及pH條件下殺鮭氣單胞菌生長曲線。用SPSS18.0軟件對不同溫度或pH值條件下培養(yǎng)相同時間的細菌數(shù)進行單因素方差分析(Oneway ANOVA), 比較不同溫度或pH條件對該菌生長的影響差異。

2 結果

2.1 不同溫度下殺鮭氣單胞菌的生長曲線

本實驗采用了A值法與平板計數(shù)法相結合的方式, 對殺鮭氣單胞菌生長曲線進行測定。結果顯示,在細菌對數(shù)生長期, 兩種方法測得的生長曲線變化趨勢基本一致, 但在細菌對數(shù)生長期之后, 菌液A值會繼續(xù)增加, 而平板計數(shù)法顯示細菌生長已進入穩(wěn)定期甚至已經開始衰亡(圖1)。對兩種方法進行比較發(fā)現(xiàn), 在細菌生長對數(shù)期之后, 平板計數(shù)法更能真實反映細菌生長狀態(tài)(詳見 3.2)。實驗發(fā)現(xiàn), 不同溫度下殺鮭氣單胞菌生長曲線差異較大(圖2)。隨著培養(yǎng)溫度的降低, 殺鮭氣單胞菌生長速率下降。當培養(yǎng)溫度為28 ℃時, 殺鮭氣單胞菌在2h后就進入了對數(shù)生長期, 并在 8 h左右達到數(shù)量高峰期, 為 6.6×108CFU/mL。20 h之后, CFU對數(shù)值顯示其數(shù)量開始下降(圖1a)。培養(yǎng)溫度為15℃時, 該菌在6 h之后進入快速增長期, 從CFU對數(shù)值可以看出, 在48 h左右細菌生長進入穩(wěn)定期(圖1b)。當溫度降低到10℃時,其生長速率進一步降低(圖1c), 14 h左右生長速率加快, 54 h趨于穩(wěn)定。而當溫度降低到5℃時, 在36 h之內, 殺鮭氣單胞菌數(shù)量無顯著變化。經統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn), 在實驗第24小時和第48小時, 各溫度組殺鮭氣單胞菌數(shù)量均出現(xiàn)顯著差異(P<0.05); 在第 72小時,15℃及 5℃條件下殺鮭氣單胞菌數(shù)量差異顯著(P<0.05), 說明隨溫度降低, 殺鮭氣單胞菌生長速率顯著降低(圖3)。

圖1 不同溫度下殺鮭氣單胞菌生長曲線Fig. 1 Growth curves of Aeromonas salmonicida under different temperatures

圖2 不同溫度下殺鮭氣單胞菌生長曲線的比較Fig.2 Comparison of Aeromonas salmonicida growth curves under different temperatures

圖3 殺鮭氣單胞菌在不同溫度下培養(yǎng)24、48、72h的細菌對數(shù)值Fig. 3 Logarithm of Aeromonas salmonicida cultivated under different temperatures for 24, 48and 72 h

2.2 不同 pH 條件下殺鮭氣單胞菌的生長曲線

pH是影響細菌生長的一個重要因素。實驗結果表明, 培養(yǎng)液pH不同, 殺鮭氣單胞菌生長速率差異顯著, 且其在 pH6.0～8.0范圍內均可生長(圖 4)。從生長曲線來看, 當初始pH為7.5時, 殺鮭氣單胞菌在6 h左右進入對數(shù)生長期, 20 h基本穩(wěn)定, 菌液A600值為 0.293。初始pH為 7.0時細菌生長趨勢與上述基本相同, 菌液A600略低。當培養(yǎng)液初始 pH為 8.0時, 殺鮭氣單胞菌生長速率及菌液A600值均有所降低, 20 h的A600值為0.245。當培養(yǎng)液顯酸性, 即初始pH為6或6.5時, 細菌生長速率明顯下降, 對數(shù)增長期延緩, 在14 h之后菌液A600值才快速增加。對12 h及24 h時菌液A600值進行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn), 在第12小時, 初始pH為6.0和6.5兩組菌液A600值與其他各組相比差異顯著(P<0.05); 且在第 24小時, 初始pH為7.0及7.5的兩組菌液A600值與其他各組有顯著性差異(P<0.05)(圖 5)。通過統(tǒng)計分析結果可知,pH7.0～8.0是殺鮭氣單胞菌生長較適宜的范圍。

圖4 不同pH條件下殺鮭氣單胞菌生長曲線Fig. 4 Growth curves of Aeromonas salmonicida under different pH

圖5 殺鮭氣單胞菌在不同pH條件下培養(yǎng)12h、24h菌液A600值Fig. 5 A600 of Aeromonas salmonicida cultivated under different pH for 24 h and 48 h

另外, 實驗中發(fā)現(xiàn), 隨著殺鮭氣單胞菌的生長,菌液pH會發(fā)生變化(表1), 總體呈下降趨勢。實驗前后pH變化范圍為0.101～0.207, pH下降說明殺鮭氣單胞菌在生長過程中會產生酸性代謝產物。

3 討論

3.1 不同溫度對殺鮭氣單胞菌生長的影響

從本實驗研究結果可以看出, 殺鮭氣單胞菌適宜生長溫度為28℃, 這與Statner B等[8]的研究結果一致。在實際生產當中, 殺鮭氣單胞菌主要感染對象為鮭科魚類, 而鮭魚屬于冷水性魚類, 其最適生長水溫一般為 12～18℃, 根據(jù)品種不同而有所差別, 陸封型大西洋鮭(Atlantic Salmon)最佳生長溫度為12～16℃[9], 高白鮭(Coregonus Peled)為 12～16℃[10],虹鱒(Oncorhynchus mykiss)為 12～18℃[11], 因此在工廠化養(yǎng)殖過程中, 為抑制殺鮭氣單胞菌在系統(tǒng)中的生長繁殖, 可將水溫調節(jié)為適宜魚類生長的最低溫度, 從而降低養(yǎng)殖過程中殺鮭氣單胞菌大量繁殖導致魚類疾病暴發(fā)的風險。但在低溫條件下, 細菌生長速率的降低主要是由于酶活性降低, 酶促過程減緩,而不是由于蛋白質變性或細胞死亡[12]引起的。因此,降低溫度只能起到抑制作用, 而不能徹底消滅殺鮭氣單胞菌的危害。在實際生產當中, 降低養(yǎng)殖水體溫度也只能作為一種減少病害的預防手段, 為降低殺鮭氣單胞菌對養(yǎng)殖魚類的威脅還需與其他檢測及防治手段相結合。

表1 實驗過程中菌液pH的變化Tab.1 Bacterium liquid pH changes during the experimental process

3.2 A值法與平板計數(shù)法的比較

用于細菌計數(shù)的常規(guī)方法有很多, 包括平板計數(shù)法、MTT法、A值法、血細胞計數(shù)板法、濁度法等, 目前為止最為穩(wěn)定可靠的是平板計數(shù)法[13]。經實驗發(fā)現(xiàn),A值法與平板計數(shù)法測得的結果有一定的差別。A值法不能區(qū)分死亡細菌, 其測得的是活菌及死亡細菌總數(shù)。在細菌生長的對數(shù)期, 死亡細菌很少可忽略不計, 穩(wěn)定期會有大量細菌死亡, 因而在實驗后期測得的A值并不能真實的反映細菌的數(shù)量, 這與前人關于嗜水氣單胞菌生長的研究結果相似[14]。另外, 因測量儀器量程等的限制, 在測較低或過高濃度病原菌數(shù)量變化情況時, 該方法會存在局限性[15]。從實驗操作方面來看, 平板計數(shù)法耗時長, 勞動強度大, 無菌操作要求嚴格, 而A值法操作簡便快捷,在一定程度上也可反映細菌數(shù)量變化趨勢, 因此在細菌生長參數(shù)的檢測中A值法常被廣泛應用。針對本實驗結果進行分析, 由于該菌在低溫條件下生長較慢, 菌液濃度較低, 為保證測量結果的準確性, 建議采用平板計數(shù)法進行檢測。

3.3 不同pH對殺鮭氣單胞菌生長的影響

環(huán)境pH會對細菌的生命活動產生重要影響, pH的改變會引起細胞膜電荷變化, 進而影響細菌對營養(yǎng)物質的吸收, 影響代謝過程中酶的活性; 改變生長環(huán)境中營養(yǎng)物質的可給性以及有害物質的毒性。多數(shù)病原菌的最適 pH為中性或弱堿性(pH7.0～7.6),部分病原菌最適pH為酸性, 如乳本鄉(xiāng)桿菌(pH5.5)。個別病原菌在堿性條件下生長良好, 如霍亂孤菌在pH8.4～9.2時生長最好。張國軍等[16]報道香港海鷗型菌最適生長 pH為 5.5～6.0。陳向敏等[17]報道創(chuàng)傷弧菌在pH8.0～8.5的條件下細菌的濃度能達到最高。本實驗研究結果表明, 殺鮭氣單胞菌最適pH為中性或弱堿性(7.0～8.0)。統(tǒng)計分析結果顯示, 在酸性與堿性條件下其生長差異性顯著(P<0.05), 說明酸性條件能明顯抑制其生長。在實際養(yǎng)殖生產中, 殺鮭氣單胞菌主要感染鮭鱒魚類, 不同品種的鮭鱒魚對養(yǎng)殖水體pH要求不同, 如高白鮭(Coregonus peled)的pH6～9[10]、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)的 pH6.5～7.5[11]。因此, 在養(yǎng)殖過程中可根據(jù)養(yǎng)殖魚品種的不同, 合理調控水體 pH, 在保證魚正常生長條件下, 抑制殺鮭氣單胞菌在系統(tǒng)中的生長繁殖, 從而降低魚類發(fā)病率。

4 結論

殺鮭氣單胞菌會對大西洋鮭魚的健康養(yǎng)殖造成威脅。作者以養(yǎng)殖生產系統(tǒng)中分離得到的殺鮭氣單胞菌為實驗對象, 研究了不同溫度及pH對殺鮭氣單胞菌生長的影響, 并繪制了其在不同條件下的生長曲線。通過本實驗研究得到以下結論。

(1) 在本實驗條件下, 殺鮭氣單胞菌生長速率隨溫度降低逐漸下降;

(2) 在 pH6.0～8.0時, 酸性條件下能明顯抑制殺鮭氣單胞菌的生長;

(3) 28℃、pH7.5為殺鮭氣單胞菌生長的最佳條件, 在此條件下殺鮭氣單胞菌生長速率最快, 達到穩(wěn)定期時細菌數(shù)量也最多。

(4) 建議在不影響魚類正常生長的條件下, 盡量降低養(yǎng)殖水體溫度并合理控制水體 pH, 對抑制魚類養(yǎng)殖過程中殺鮭氣單胞菌的生長繁殖, 降低養(yǎng)殖魚類發(fā)病率具有一定的理論指導意義。

近幾年, 一些地區(qū)將鮭鱒魚類養(yǎng)殖作為特色產業(yè)和重要漁業(yè)經濟支持其發(fā)展[18], 工廠化養(yǎng)殖規(guī)模也逐步擴大, 環(huán)境條件可控性逐步增強。但隨之也出現(xiàn)了一系列的病害問題, 其中殺鮭氣單胞菌的危害十分嚴重, 死亡率高達70%以上[19]。因此, 在鮭鱒魚實際養(yǎng)殖過程中, 可以根據(jù)殺鮭氣單胞菌生長特點,合理控制養(yǎng)殖水體溫度或 pH, 抑制殺鮭氣單胞菌的生長繁殖, 從而減少養(yǎng)殖魚類感染該致病菌的可能性, 降低發(fā)病率。

為促進鮭鱒魚類的健康養(yǎng)殖, 針對其主要病原菌殺鮭氣單胞菌的研究需繼續(xù)深入開展。在將來的工作中, 可選擇其他環(huán)境因子, 包括C/N比、鹽度等作為影響因素進一步探討殺鮭氣單胞菌的生長特點, 深入研究其生物學特性, 建立其在不同條件下的生長動力學模型, 為合理預測殺鮭氣單胞菌在魚類養(yǎng)殖水體中的生長動態(tài)變化, 建立病害預警機制提供理論依據(jù)。

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