張紅梅，蔣 葉，李大千，夏文穎，陳 丹，荊俊鵬，王 悅，楊大恒，徐 建，潘世揚(yáng)

0 引 言

循環(huán)DNA主要存在于人血漿和血清等體液中，大量研究表明，血漿DNA水平與腫瘤負(fù)荷相關(guān)，與腫瘤的診斷、治療療效、病程監(jiān)測(cè)及預(yù)后密切相關(guān)［1-6］，但在血液系統(tǒng)腫瘤中的研究報(bào)道相對(duì)較少。慢性白血病是一組異質(zhì)性造血系統(tǒng)腫瘤，慢性白血病細(xì)胞具有一定的分化成熟能力，多為較成熟的幼稚細(xì)胞和成熟細(xì)胞，其病情發(fā)展慢，自然病程可為數(shù)年，其中常見的是慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)、慢性淋巴細(xì)胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)和毛細(xì)胞白血病(hairy cell leukemia，HCL)。目前慢性白血病的診斷、療效判斷及病程監(jiān)測(cè)在臨床上多依賴骨髓組織細(xì)胞學(xué)檢查。有研究報(bào)道，白血病患者外周血中循環(huán)DNA的異常增高早于骨髓檢查，認(rèn)為血漿循環(huán)DNA可代替骨髓細(xì)胞用于白血病的輔助診斷［7］。因此，本研究以慢性白血病患者為研究對(duì)象，初步探討探討血漿循環(huán)DNA定量檢測(cè)在慢性白血病療效評(píng)估中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2008年5月至2014年8月南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院和南京市江寧醫(yī)院血液科住院患者CML52例、CLL85例和HCL患者4例。男性99例，女性42例。CML患者中位年齡48歲，其中慢性期33例、急變期12例、加速期7例，經(jīng)酪氨酸酶抑制劑TKI聯(lián)合化療后部分患者達(dá)完全血液學(xué)緩解或細(xì)胞遺傳學(xué)緩解;CLL患者中位年齡61歲，在FC方案或FCR等方案化療后，經(jīng)CLL療效標(biāo)準(zhǔn)判斷［8］，28例患者達(dá)到完全緩解(complete remission，CR)，27例部分緩解(partial remission，PR)，30例未緩解(non-remission，NR)，分別為 CR組、PR組、NR組;HCL中位年齡62歲。選擇南京市江寧醫(yī)院80例體檢健康者作為對(duì)照組，男性43例，女性37例，中位年齡45歲。

1.2 試劑與儀器 磁珠法提取DNA試劑盒(上海浩源公司)，PCR擴(kuò)增試劑(TaKaRa公司)。目的基因βactin和標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參照物重組質(zhì)粒DNA的引物及TaqMan探針由Invitrogen公司合成，序列參見文獻(xiàn)［9］。7500型熒光定量基因擴(kuò)增儀(Applied Biosystems公司)。

1.3 標(biāo)本處理 采集靜脈血2 mL，EDTA-K2抗凝，于室溫1 600×g離心10min，小心轉(zhuǎn)移上層血漿，再于4℃、16 000×g離心10 min，上層無細(xì)胞血漿每管200 μL分裝于加入人工重組質(zhì)粒樣品保存管中，渦旋混勻后置-70℃待測(cè)。

1.4 血漿DNA定量檢測(cè) 用磁珠法對(duì)血漿DNA和重組質(zhì)粒DNA同步提取，再對(duì)人β-actin基因和內(nèi)參照質(zhì)粒DNA進(jìn)行雙重?zé)晒舛縋CR，具體操作及計(jì)算參照文獻(xiàn)［9-10］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Stata/SE 9.2統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。血漿DNA定量結(jié)果資料呈非正態(tài)分布，以中位數(shù)［M(P25，P75)］表示，成組設(shè)計(jì)組間比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)，兩兩比較采用Whitney秩和檢驗(yàn);化療前后比較采用Wilcoxon配對(duì)秩和檢驗(yàn)。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 慢性白血病患者診斷時(shí)血漿DNA含量的測(cè)定診斷時(shí)，CML和CLL患者血漿DNA含量均顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。而HCL患者血漿DNA含量與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.200)，CML、CLL 和 HCL 患者之間血漿 DNA含量差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

2.2 CML患者不同階段血漿DNA含量測(cè)定 CML慢性期患者血漿DNA含量顯著高于急變期患者和加速期患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。但加速期患者和急變期患者血漿DNA含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。見表1。

2.3 CML患者在化療前后DNA含量測(cè)定 CML患者化療后血漿DNA含量顯著低于化療前血漿DNA含量，且顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。見表1。

2.4 CLL患者不同化療療效組血漿DNA含量測(cè)定CLL患者CR組血漿DNA含量顯著低于PR組和NR組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.001);與對(duì)照組血漿DNA含量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P=0.125)。PR組、NR組血漿DNA含量顯著高于對(duì)照組 (P＜0.001)。見表1。

表1 慢性白血病患者不同時(shí)期血漿DNA含量的結(jié)果［M(p25，p75)，ng/mL)］Table 1 The level of plasma DNA in patients with chronic leukemia ［(M(p25，p75)，ng/mL］

3 討 論

慢性白血病起病緩慢，病程長(zhǎng)，早期多無明顯癥狀，患者多在體格檢查或其他疾病就診時(shí)發(fā)現(xiàn)。95%的慢性白血病為CML，CML以慢性期起病，發(fā)病年齡在20～60歲，臨床病程可分為慢性期、加速期及急變期。CLL主要見于老年人，病程進(jìn)展緩慢，中位生存期＞10年。HCL較為少見，白血病細(xì)胞胞質(zhì)形成細(xì)長(zhǎng)的突起，形似絨毛，平均發(fā)病年齡50歲，預(yù)后多不良。目前，臨床使用的最直接的判斷慢性白血病化療療效的檢測(cè)手段為骨髓穿刺和活檢，但骨髓穿刺為有創(chuàng)檢測(cè)。相關(guān)文獻(xiàn)表明，循環(huán)血漿DNA可以作為早期監(jiān)測(cè)腫瘤的分子生物標(biāo)記［11-13］，并且可以評(píng)判腫瘤化療療效［14］。

循環(huán)DNA為主要存在于血液、滑膜液、腦脊液等體液中的細(xì)胞外DNA。Leon等［15］首先發(fā)現(xiàn)腫瘤患者血漿DNA水平明顯增高，且與患者的預(yù)后及療效有關(guān);Stroun等［16］首先對(duì)腫瘤患者體內(nèi)的游離循環(huán)DNA的序列進(jìn)行了檢測(cè)，在腫瘤患者體內(nèi)的游離循環(huán) DNA 上相繼檢測(cè)到了 K-ras、N-ras、P53、APC等基因的突變［2，4，17-19］。同時(shí)發(fā)現(xiàn)癌癥患者在接受化療后，其體內(nèi)游離循環(huán) DNA的濃度會(huì)降低到90%［20］，而正常人體內(nèi)的游離循環(huán)DNA的水平就相對(duì)穩(wěn)定。隨后在肺癌、乳腺癌、消化道腫瘤等多種實(shí)體腫瘤中發(fā)現(xiàn)血漿DNA具有腫瘤相關(guān)的特征性改變［21-23］，提示循環(huán)DNA有望成為新的腫瘤分子標(biāo)志物。

本研究結(jié)果顯示，診斷時(shí)由于大量白血病細(xì)胞的存在，CML和CLL患者血漿DNA含量均明顯高于對(duì)照組;HCL患者血漿DNA含量亦高于對(duì)照組但無差異，這可能是樣本數(shù)偏少所致。由此推斷慢性白血病患者體內(nèi)大量腫瘤細(xì)胞釋放DNA導(dǎo)致血漿DNA水平升高，Stroun等［23］證實(shí)游離循環(huán)DNA先是在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制合成，然后釋放出細(xì)胞，新合成的DNA被優(yōu)先釋放。在CML患者中，慢性期患者血漿DNA含量明顯高于急變期和加速期患者。原因是CML慢性期白細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著增高，釋放大量DNA，而進(jìn)入加速期和急變期后，由于降白細(xì)胞治療，白細(xì)胞數(shù)量相比慢性期顯著降低;其血漿DNA水平亦相應(yīng)降低。

本研究前期已證實(shí)，血漿DNA定量檢測(cè)在AML和ALL的的化療療效評(píng)估中均具有重要意義［24-25］。本研究對(duì) CML患者進(jìn)行化療后血漿DNA的定量檢測(cè)，其血漿DNA水平顯著低于化療前但顯著高于對(duì)照組，結(jié)果表明CML患者在接受化療后病情得到有效控制，但因?yàn)榧膊∵M(jìn)展緩慢，故而病情恢復(fù)亦緩慢。對(duì)CLL患者化療后不同療效組血漿DNA水平研究結(jié)果顯示，CR組與對(duì)照組之間無差異，提示患者化療效果良好，病情得到有效控制。PR組血漿DNA水平顯著高于對(duì)照組及CR組，但顯著低于NR組，結(jié)果提示患者化療后病情有所控制，但治療效果并不理想;或者患者化療前病情嚴(yán)重于CR組患者;抑或患者因個(gè)體差異導(dǎo)致治療效果差異。NR組患者化療后血漿DNA水平顯著高于對(duì)照組、CR組及PR組，結(jié)果提示該組患者化療效果無效或者治療效果不好，需要進(jìn)一步化療或者更改化療方案。

本研究結(jié)果表明，血漿DNA的定量檢測(cè)在慢性白血病的化療療效評(píng)價(jià)中具有重要的臨床意義。盡管CML已經(jīng)有非常好的分子生物學(xué)療效評(píng)估指標(biāo)BCR/ABL，但是BCR/ABL檢測(cè)需要通過骨髓穿刺獲得患者的骨髓標(biāo)本，此項(xiàng)檢測(cè)為有創(chuàng)檢測(cè)。血漿循環(huán)DNA檢測(cè)僅需要患者血液，為無創(chuàng)檢測(cè)。血漿DNA定量檢測(cè)具有取樣方便、無創(chuàng)、敏感性高、重復(fù)性好等優(yōu)勢(shì)，可減少患者反復(fù)骨髓穿刺的創(chuàng)傷，方便臨床醫(yī)師對(duì)隨訪患者的病情進(jìn)展及療效進(jìn)行監(jiān)測(cè)［26］。

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