劉 肅 何華紅 戚莉莉

廣州市藥品檢驗(yàn)所，廣東廣州510160

紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)檢測化妝品眼刺激性的初步研究

劉 肅 何華紅 戚莉莉

廣州市藥品檢驗(yàn)所，廣東廣州510160

目的 探討紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)在化妝品眼刺激性檢測中的適用性。 方法 選用9種化妝品產(chǎn)品進(jìn)行眼刺激試驗(yàn)，確定家兔紅細(xì)胞50%發(fā)生溶血時(shí)的化妝品濃度（HD50值）和血紅蛋白變性指數(shù)（DI，%），計(jì)算刺激指數(shù)IP= HD50/DI，以IP=HD50/DI值作為評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行眼刺激性分級。將紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)刺激性分級結(jié)果與家兔眼刺激試驗(yàn)（Draize eye test）結(jié)果進(jìn)行分級一致性比較，初步分析體外試驗(yàn)的適用性。 結(jié)果 紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較中，9種樣品中有7種結(jié)果一致，一致率為77.8%（相關(guān)性為0.4962）。 結(jié)論 雖然實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明兩者有一定的相關(guān)性，但多方面而言，紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)?zāi)芊裾嬲〈鷦?dòng)物實(shí)驗(yàn)還有待商榷。

化妝品；眼刺激性試驗(yàn)；替代方法；紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)

眼刺激性是指動(dòng)物的眼睛表面（包括角膜，鞏膜及結(jié)膜部分）接觸到化學(xué)物質(zhì)從而產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的過程，這個(gè)過程有可逆的，也有不可逆的?；瘖y品眼刺激性安全評價(jià)方法目前多用家兔試驗(yàn)即兔的眼刺激性試驗(yàn)（Draize eye test），該實(shí)驗(yàn)方法于1944年建立，目前仍是測定急性眼毒性的國際標(biāo)準(zhǔn)，但由于該試驗(yàn)依靠實(shí)驗(yàn)人員肉眼觀察評分給出結(jié)果，存在一定的主觀性；同時(shí)實(shí)驗(yàn)室與實(shí)驗(yàn)室之間的變異性也使該試驗(yàn)存在一定誤差。而且近年來從動(dòng)物保護(hù)和動(dòng)物福利的角度出發(fā)，國際上多種替代動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)建立并被驗(yàn)證成為檢測標(biāo)準(zhǔn)[1-4]。

紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)已經(jīng)被納入到歐洲委員會(huì)/英國內(nèi)務(wù)府開展的替代家兔眼刺激試驗(yàn)之一，日本（Japanese ministry of health and welfare，MHW）/JCIA也已經(jīng)在6～9個(gè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了類似試驗(yàn)，結(jié)果顯示[1]，紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室間的重復(fù)性較好。盡管它與兔眼刺激性試驗(yàn)中的MAS值的相關(guān)性不夠強(qiáng)（-0.631）但仍可比較確定的從樣品中分辨出強(qiáng)刺激物。

我國已建立了紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)方法， 并得出紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)的結(jié)果與兔眼刺激性試驗(yàn)具有較好相關(guān)性這一結(jié)論。張文改等[4-6]認(rèn)為該實(shí)驗(yàn)方法適合評價(jià)洗發(fā)護(hù)發(fā)類化妝品的眼刺激性，能正確區(qū)分眼刺激性級別為輕刺激性及其以下刺激級別的化妝品；廖艷等[7]的研究結(jié)果也表明紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)可用于替代兔眼刺激性試驗(yàn)。

本研究擬在我所建立兔紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯⑵鋺?yīng)用于化妝品原料和產(chǎn)品眼刺激性的檢測與評價(jià)，以考察它替代動(dòng)物眼刺激性試驗(yàn)用于化妝品安全性評價(jià)的可能性及應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 樣品及試驗(yàn)動(dòng)物

全部樣品均來源于廣州市藥品檢驗(yàn)所藥理室2014年1～9月送檢的部分化妝品產(chǎn)品，共9個(gè)批次樣品，其中面膜類2個(gè)，洗發(fā)類1個(gè)，去角質(zhì)類2個(gè)，潔面類4個(gè)。全部樣品均于密閉﹑室溫（22℃）下保存。

試驗(yàn)用家兔來自廣州市藥品檢驗(yàn)所動(dòng)物房，經(jīng)檢疫后選用健康成年白色家兔，性別不限，雌性不孕。

1.2 主要儀器及試劑

主要儀器：日立U-3900紫外分光光度計(jì)，低溫高速28RS離心機(jī)（Biofuge），電子天平AB204-S，六孔水浴TW12。

主要試劑：十二烷基硫酸鈉（SDS），廣州學(xué)友生物科技有限公司；二甲亞砜（DMSO），美國AR公司；草酸鉀，廣州化學(xué)試劑廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 紅細(xì)胞溶血試驗(yàn) 紅細(xì)胞懸液的制備：健康家兔心臟取血7mL，加2%草酸鉀溶液1mL，制備成新鮮抗凝兔血，加PBS 10mL稀釋，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

樣品懸液的制備：根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，選擇合適的終濃度，配制樣品系列溶液。每種樣品均設(shè)立5個(gè)試驗(yàn)劑量。首選PBS為溶劑，對于不溶于PBS的樣品選用DMSO為溶劑（終濃度≤0.5%）。必須保證各稀釋樣品懸液充分混勻。

溶血及蛋白變性測定：樣品組每個(gè)濃度2支具塞試管，每管加入樣品懸液10mL；陰性對照組2支具塞試管，每管加入PBS 10mL；陽性對照組2支具塞試管，每管加入蒸餾水 10mL。每支試管加入0.2mL稀釋兔血，輕輕混勻，37℃孵育30min。結(jié)束后，離心10min，2000r/min，吸取上清液移入比色皿內(nèi)，于分光光度計(jì)540nm，560nm及575nm測其吸光度（A）值。按公式①計(jì)算溶血率（%），公式②計(jì)算血紅蛋白變性指數(shù)（DI，%）。

R1為空白對照蒸餾水的離心上清液A575/A540值；R2為樣品離心上清液A575/A540值；R3為陽性對照SDS離心上清液A575/A540值[2]

主要觀察指標(biāo)：50%紅細(xì)胞發(fā)生溶血時(shí)的樣品濃度（HD50）﹑蛋白質(zhì)變性指數(shù)（DI）﹑HD50與變性變性指數(shù)DI的比值（IP=HD50/DI）。

陽性對照：以十二烷基硫酸鈉（SDS）為陽性對照，最終實(shí)驗(yàn)濃度為100mg/L。

1.3.2 家兔眼刺激試驗(yàn)（Draize eye test） 樣品按不同劑量滴入每只試驗(yàn)動(dòng)物一側(cè)眼結(jié)膜囊內(nèi)，另一側(cè)為自身對照，在規(guī)定的時(shí)間間隔內(nèi)，觀察角膜﹑虹膜和結(jié)膜的反應(yīng)并評分，以評價(jià)樣品對眼睛的刺激作用[6]。

試驗(yàn)操作：輕輕拉開家兔一側(cè)眼睛的下眼瞼，將樣品0.1mL或0.1g迅速滴入眼結(jié)膜囊中，令眼瞼被動(dòng)閉合2～3s，以防止樣品丟失，另一側(cè)眼睛不作任何處理以作自身對照。滴入樣品后24h內(nèi)不沖洗眼睛。若試驗(yàn)結(jié)果顯示樣品有刺激性，則另選用3只家兔進(jìn)行沖洗效果試驗(yàn)，即給家兔眼滴入樣品后30s，用生理鹽水輕柔快速?zèng)_洗至少30s。在滴入樣品后1﹑24﹑48﹑72h以及第4天和第7天對動(dòng)物眼睛進(jìn)行檢查，觀察結(jié)膜﹑角膜及虹膜的反應(yīng)，并在24h時(shí)進(jìn)行熒光素鈉（1%，生理鹽水配制）檢查。如果在72h刺激反應(yīng)消失，即終止試驗(yàn)。如有累及角膜或有其他眼刺激作用，7d內(nèi)不恢復(fù)者，則繼續(xù)觀察至21 天。每次檢查時(shí)均按《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》（2007）中眼損害的評分標(biāo)準(zhǔn)記錄眼刺激反應(yīng)的積分，最后按分級標(biāo)準(zhǔn)對受試樣品進(jìn)行眼刺激性分級[4，6]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用STATA統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。采用秩和檢驗(yàn)法進(jìn)行紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)刺激性分級結(jié)果和動(dòng)物試驗(yàn)分級結(jié)果進(jìn)行比較，判斷兩種試驗(yàn)結(jié)果分級的頻數(shù)差別是否存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)結(jié)果

溶血率與樣品濃度存在一定的線性關(guān)系，以樣品濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)，溶血率為縱坐標(biāo)可求得HD50值（R2≥0.95）。進(jìn)而，根據(jù)公式可求得DI及IP=HD50/DI。見表1。

表1 化妝品產(chǎn)品紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)結(jié)果

2.2 眼刺激試驗(yàn)與紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)的分級結(jié)果比較

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以分為無刺激性（Ⅰ級）﹑微弱刺激性（Ⅱ級）﹑輕度刺激性（Ⅲ級）和嚴(yán)重刺激性（Ⅳ級）4個(gè)級別。

紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)的眼刺激分級為：L/D≥10﹑1≤L/D＜10 ﹑0.1 ≤L/D＜1和L/D＜0.1分別表示無刺激性（Ⅰ級）﹑微弱刺激性（Ⅱ級）﹑輕度刺激性（Ⅲ級）和嚴(yán)重刺激性（Ⅳ級）4個(gè)級別。

本次實(shí)驗(yàn)測得，9種化妝品樣品中，有7種動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)分級結(jié)果一致，1種不相符，還有一種無法獲得結(jié)果。見表2。

表2 樣品紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

根據(jù)STATA統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果，probability= 0.4962，故按單向有序RC表資料進(jìn)行秩和檢驗(yàn)，結(jié)果顯示這兩種試驗(yàn)分類等級的頻數(shù)的差別不顯著，即在一定程度上紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)可取代動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果相關(guān)性：9種物質(zhì)中有7種分級結(jié)果一致。

3 討論

紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)作為動(dòng)物眼刺激試驗(yàn)的替代方法，問世已有20多年，科學(xué)家們研究了這兩種方法的相關(guān)性﹑一致性和可靠性等，結(jié)論是基本確認(rèn)紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)可以用于眼刺激性的評價(jià)，并有較好的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。遺憾的是，公認(rèn)的眼刺激性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)一直未有確定。紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)的基本原理是化學(xué)物質(zhì)對紅細(xì)胞膜的破壞從而產(chǎn)生胞質(zhì)內(nèi)蛋白的變性繼而引起一系列的炎性反應(yīng)[3，8-12]。不同化學(xué)物質(zhì)損傷紅細(xì)胞的具體機(jī)制可能存在差異，如表面活性劑可破壞膜的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致膜脆性增加和溶解，而某些酸﹑堿或有機(jī)溶劑可引起大分子蛋白質(zhì)的沉淀/變性，而某些漂白劑和過氧化物對蛋白質(zhì)的烷化和氧化攻擊有可能并不表現(xiàn)為細(xì)胞膜溶解。通常大多數(shù)“無或弱的刺激物”不引起溶血和蛋白變性：“中度或嚴(yán)重刺激物”僅引起溶血而較少引起蛋白變性；“強(qiáng)或腐蝕性物質(zhì)”易造成嚴(yán)重溶血及蛋白變性。當(dāng)前較為合理的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)替代方案是首先通過物理化學(xué)特性預(yù)判物質(zhì)的刺激性程度而后采用多步體外實(shí)驗(yàn)“自下而上（首先進(jìn)行非刺激性試驗(yàn)）”方式準(zhǔn)確識別非刺激物，采用“自上而下（首先進(jìn)行刺激性試驗(yàn)）”方式準(zhǔn)確識別嚴(yán)重刺激物[13]因此，本實(shí)驗(yàn)選擇膜溶解（溶血）和血紅蛋白變性兩個(gè)檢測終點(diǎn)，與僅用單一終點(diǎn)的替代方法相比，本實(shí)驗(yàn)?zāi)芨采w不同損傷機(jī)制，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更具有代表性。

也有研究表明，溶血實(shí)驗(yàn)中，選用小型豬紅細(xì)胞和大鼠紅細(xì)胞檢測，前者更容易得出嚴(yán)重刺激性物質(zhì)的分類結(jié)果，提示大型哺乳動(dòng)物可能比嚙齒類紅細(xì)胞更接近人類而適宜進(jìn)行溶血實(shí)驗(yàn)[14]，我們的實(shí)驗(yàn)選用家兔，更有代表性。

我們同時(shí)也看到了局限性：一方面，溶血試驗(yàn)過程中存在太多不穩(wěn)定因素，而且實(shí)驗(yàn)中樣品種類有限，未能代表性地反應(yīng)所屬種類的結(jié)果；另一方面，在實(shí)驗(yàn)過程中，樣品的配制有一定干擾性：磨砂膏等難溶于溶劑或者是混合不均勻；樣品中色素影響吸光度的測定，從而可影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。酸性物質(zhì)本身會(huì)產(chǎn)生蛋白變性作用，所以對于酸性物質(zhì)的評價(jià)也應(yīng)謹(jǐn)慎[11]。另外有報(bào)道顯示，溶血試驗(yàn)對于鏈烷醇胺和酒精類物質(zhì)的檢測陽性率較低，可出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

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Preliminary study on Red blood cell hemolysis test of draize alternatives

LIU Su HE Huahong QI Lili
Guangzhou Institute for Drugs,Guangzhou 510160, China

Objective To study the red blood cell hemolysis test on the applicability of the cosmetic eye irritation test. Methods 9 kinds of cosmetic products are chosen as the subjects, and determine the subjects of rabbit red blood cell hemolysis occurs in 50% subjects (HD50) and the initial concentration of hemoglobin denaturation index (DI, %), the calculation of IP=HD50/DI, with IP=HD50/DI value as evaluation standard, make eye irritant grading. Results excitant grading erythrocyte hemolysis test and animal experiment results are compared, and grading consistency preliminary analysis the applicability of the in vitro. Results: Red blood cell hemolysis test and animal experiment result comparison, seven of nine subjects content is consistent, consistent rate was 77.8%(probability=0.4962). Conclusion Though the experiment results show that both have certain relevance, but many ways, red blood cell hemolysis test failed to truly replace animal testing.

Cosmetics; Eye irritation trial; Alternative methods; Red blood cell hemolysis test

R115

B

2095-0616（2015）16-188-04

2015-04-16）