唐 雋劉 川都 偉王 軍

1.吉林大學(xué)（長春，130021）；2.中國醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院；3.沈翔705醫(yī)院；4.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院

葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白（GRP）是細(xì)胞為了適應(yīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)所產(chǎn)生的一類應(yīng)激蛋白，與熱休克蛋白（HSP）有較高同源性［1-2］。研究表明，GRP78在某些腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，對腫瘤細(xì)胞抗傳統(tǒng)放化療治療具有重要意義［3-5］。蛋白酶體抑制劑是一類新型抗腫瘤制劑，對多種腫瘤具有治療作用［6-9］。但不同腫瘤細(xì)胞對蛋白酶體抑制劑表現(xiàn)出不同敏感性。在前期研究中發(fā)現(xiàn)蛋白酶體抑制劑誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，本研究進(jìn)一步在不同卵巢癌細(xì)胞中檢測GRP78表達(dá)水平，并利用小干擾RNA（siRNA）技術(shù)特異性下調(diào)GRP78，以探討GRP78在蛋白酶體抑制劑誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 人卵巢癌細(xì)胞的培養(yǎng)

SKOV3、A2870、CAOV3三種卵巢癌細(xì)胞采用DMEM加10%的胎牛血清、100U／mL青霉素和100μg／mL鏈霉素的培養(yǎng)液，置于37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2～3d傳代1次，選用對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗。

1.2 細(xì)胞分組及干預(yù)

對3種V細(xì)胞系分別設(shè)空白對照組和不同蛋白酶體抑制劑處理組。蛋白酶體抑制劑MG132、PSI、EPOX處理濃度為5μmol／L、20nmol／L、10 nmol／L，作用24h。為明確沉默GRP78對MG132抗卵巢癌活性的影響，采用siRNA技術(shù)。分別設(shè)空白對照、siGRP78組（3種GRP78的特異siRNA組）和隨機(jī)序列核酸對照siRNA組。

1.3 MTT比色法檢測細(xì)胞活力

用不同蛋白酶體抑制劑處理細(xì)胞24h后，加入0.5mg／ml的MTT繼續(xù)培養(yǎng)4h，觀察藍(lán)紫色沉淀析出；加甲基亞砜（DMSO）后放置于搖床搖15 min，用酶標(biāo)儀（波長為492nm）檢測每孔吸光值（A）來反映細(xì)胞活力。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡率

收集細(xì)胞，以PBS清洗2次，加入膜聯(lián)蛋白V和碘化丙啶雙標(biāo)記試劑（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司），按試劑盒說明書對樣本進(jìn)行處理后，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，每組至少檢測5000個細(xì)胞，試驗重復(fù)3次。

1.5 實(shí)時定量（RT）PCR法檢測GRP78mRNA

采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，參照說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用熒光探針混合物（SYBR Green PCR Master mix）在 ABI 7500RTPCR系統(tǒng)（Biosystems）中進(jìn)行分析，每個樣本重復(fù)3次。

1.6 Western Blot法檢測GRP78蛋白表達(dá)

采用裂解破碎離心提取各組細(xì)胞總蛋白，等量蛋白用12%SDS-PAGE電泳分離后，采用電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，以含5%脫脂奶粉的TBST封閉30min后，用小鼠抗人GRP78一抗4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的小鼠二抗室溫孵育1h，進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光顯像。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 13.0軟件。結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）及獨(dú)立樣本t檢驗。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蛋白酶體抑制劑誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞中GRP78的蛋白和mRNA表達(dá)

2.1.1 GRP78的mRNA表達(dá) 不同蛋白酶體抑制劑處理SKOV3、A2870、CAOV3細(xì)胞，RT-PCR檢測結(jié)果見圖1。與空白對照組比較，蛋白酶體抑制劑 MG132、PSI、EPOX 作用 24h 后，SKOV3、A2870和CAOV3細(xì)胞中GRP78mRNA水平均增加，為空白對照組的3～7倍（圖1）。3種蛋白酶體抑制劑處理組SKVO3細(xì)胞與空白對照組比較的P值分別為0.002、0.008、0.003，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。3種蛋白酶體抑制劑處理組A2870細(xì)胞與空白對照比較的P值分別為0.002、0.004、0.002，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。3種蛋白酶體抑制劑處理組CAOV3細(xì)胞與空白對照比較的P值分別為0.001、0.001、＜0.001，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 實(shí)時定量PCR檢測蛋白酶體抑制劑對卵巢癌細(xì)胞GRP78mRNA表達(dá)的影響

2.1.2 GRP78蛋白的表達(dá) 與GRP78的mRNA水平變化一致，蛋白酶體抑制劑作用后，GRP78蛋白水平在SKOV3（圖2A）、A2870（圖2B）和CAOV3（圖2C）細(xì)胞系中均顯著增高。

2.2 GRP78siRNA（siGRP78）對 GRP78mRNA和蛋白表達(dá)的影響

2.2.1 siRNA對GRP78mRNA表達(dá)的影響 任意序列對照siRNA及3種不同GRP78特異性siRNA（siGRP78＃1、＃2、＃3）轉(zhuǎn)染細(xì)胞24h后，RT-PCR檢測結(jié)果見圖3。與未轉(zhuǎn)染組比較，siGRP78＃1和siGRP78＃2明顯降低GRP78mRNA的表達(dá)（P均＜0.001）；而任意序列對照siRNA和siGRP78＃3對GRP78mRNA的表達(dá)無明顯影響，P值分別為0.110和0.390（圖3）。

圖2 Western blot解析蛋白酶體抑制劑對SKVO3，A2870，CAOV3細(xì)胞GRP78蛋白表達(dá)的影響

圖3 實(shí)時定量PCR解析GRP78siRNA對GRP78mRNA表達(dá)的干擾效率

2.2.2 siRNA對GRP78蛋白表達(dá)的影響 與mRNA水平變化一致，siGRP78＃1和siGRP78＃2明顯降低GRP78的蛋白表達(dá)水平，而任意序列對照siRNA及siGRP78＃3對GRP78蛋白表達(dá)水平無明顯影響（圖4）。

圖4 Western Blot解析GRP78siRNA對GRP78蛋白表達(dá)的干擾效率

2.3 敲低GRP78的表達(dá)增加MG1.2 抗卵巢癌活力

MTT檢測結(jié)果見表1。與未轉(zhuǎn)染組比較，MG132作用后，siGRP78＃1和siGRP78＃2轉(zhuǎn)染細(xì)胞的活力明顯降低（P＜0.05），而隨機(jī)序列siRNA及siGRP78＃3轉(zhuǎn)染細(xì)胞的活力無明顯變化（P＞0.05）。

表1 各組SKOV3細(xì)胞活力變化結(jié)果（±s）

表1 各組SKOV3細(xì)胞活力變化結(jié)果（±s）

＊與空白組比較P＜0.05

組 別 凋亡率（%）未轉(zhuǎn)染組 0.409±0.017隨即序列siRNA轉(zhuǎn)染組 0.415±0.021 siGRP78＃1轉(zhuǎn)染組 0.274±0.020＊siGRP78＃2轉(zhuǎn)染組 0.248±0.024＊siGRP78＃3轉(zhuǎn)染組 0.438±0.022

3 討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是哺乳動物細(xì)胞中蛋白質(zhì)翻譯后修飾、多肽鏈正確折疊與裝配的重要場所。低氧、高血糖、化學(xué)毒物等均可導(dǎo)致在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)未折疊或錯誤折疊蛋白質(zhì)的大量蓄積，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和未折疊蛋白應(yīng)答反應(yīng)。GRP78的誘導(dǎo)表達(dá)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和未折疊蛋白應(yīng)答反應(yīng)的標(biāo)志分子，作為一種自我保護(hù)性機(jī)制維持應(yīng)激狀態(tài)下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)，有利于細(xì)胞存活［10］。研究表明在許多實(shí)體腫瘤中GRP78表達(dá)增加，在腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展和耐藥性產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用［11-12］。越來越多的證據(jù)表明，蛋白酶體抑制劑誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在蛋白酶體抑制劑抗癌活性中發(fā)揮重要作用［13］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)一方面誘導(dǎo)GRP78等分子伴侶的表達(dá)，以對抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激帶來的細(xì)胞穩(wěn)態(tài)失衡。另一方面，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激程度嚴(yán)重或持續(xù)時間足夠長，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)凋亡細(xì)胞信號亦被激活［14-16］。本研究發(fā)現(xiàn)不同蛋白酶體抑制劑均增加卵巢癌細(xì)胞中GRP78的表達(dá)，提示在卵巢癌細(xì)胞中蛋白酶體抑制劑確實(shí)誘導(dǎo)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。為了明確GRP78誘導(dǎo)表達(dá)在蛋白酶體抑制劑抗卵巢癌活性中是否具有細(xì)胞保護(hù)作用，本研究利用siRNA封閉了GRP78基因的表達(dá)。結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)染組比較，2個不同序列的siRNA成功封閉了GRP78基因的表達(dá)，重要的是這2個siRNA明顯增加了MG132誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用，提示siGRP78在降低GRP78表達(dá)的同時，亦相應(yīng)消弱了應(yīng)激時GRP78蛋白的細(xì)胞保護(hù)功能，從而有利于凋亡信號通路的激活。

總之，本研究證實(shí)了蛋白酶體抑制劑普遍性誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并證實(shí)了干擾GRP78表達(dá)可能增加卵巢癌細(xì)胞對蛋白酶體抑制劑的反應(yīng)性。隨著相關(guān)研究的深入，相信GRP78小分子抑制劑聯(lián)合蛋白酶體抑制劑的應(yīng)用，可能成為卵巢癌治療的潛在新策略。

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