薛琳琳（黑龍江省雙城市黑龍江職業(yè)學(xué)院 150111）

抑制素α-亞基成熟區(qū)基因在大腸桿菌中的原核表達(dá)

薛琳琳（黑龍江省雙城市黑龍江職業(yè)學(xué)院 150111）

本試驗(yàn)成功獲得抑制素α-亞基編碼序列的克隆載體后，從陽(yáng)性細(xì)菌中提取質(zhì)粒，經(jīng)SacI和XhoI酶切，回收354bp目的片段，與表達(dá)載體pET-32a連接，將構(gòu)建好的pET32a（+）-INH-α原核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到受體菌E.coli BL21（DE3）中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，Tricine-SDS-PAGP電泳鑒定，檢測(cè)到仔鵝與東北白鵝抑制素-α成熟區(qū)基因的表達(dá)。

抑制素；α-亞基；原核表達(dá)；試驗(yàn)

1 材料與主要試劑

仔鵝與東北白鵝的抑制素α-亞基（INH-α）編碼序列的克隆載體、BL21（DE3）大腸桿菌和表達(dá)載體pET-32a Vector，均由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker：大連寶生物有限公司；T4 DNA Ligase：大連寶生物有限公司；IPTG、DMSO：大連寶生物有限公司；三羥甲基氨基甘氨酸（Tricine），Tris堿，SDS：鼎國(guó)試劑有限公司；甘油，巰基乙醇、PEG、DTT為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

2 方法

2.1 仔鵝和東北白鵝抑制素α-亞基成熟區(qū)基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建

2.1.1 重組克隆載體的酶切消化

使用限制性內(nèi)切酶SacI和XhoI同時(shí)雙酶切重組克隆質(zhì)粒pMD18-TSimple-INHα和pET-32a質(zhì)粒，并回收目的片段。

2.1.2 酶切產(chǎn)物的連接

將目的片段與表達(dá)載體pET-32a連接。連接體系見(jiàn)表1。

表1 目的基因與質(zhì)粒載體的連接反應(yīng)體系

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，取100μl轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布在含Amp（60μg/ml）的LB平板上，倒置培養(yǎng)，于37℃培養(yǎng)，12～16h后可出現(xiàn)菌落。挑取單個(gè)菌落（2～3mm直徑）接種于含Amp（50μg/ml）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃置于搖床（200rpm/min）培養(yǎng)過(guò)夜，試劑盒法提取質(zhì)粒。

將所提取的質(zhì)粒DNA在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，紫外燈下觀察結(jié)果，選取質(zhì)粒進(jìn)一步進(jìn)行PCR擴(kuò)增和限制性內(nèi)切酶消化分離DNA片段鑒定。

2.1.3 重組質(zhì)粒的鑒定

擴(kuò)增體系按照表2質(zhì)粒PCR體系操作，將重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切。將PCR擴(kuò)增和雙酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒送上海生物工程有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

表2 質(zhì)粒PCR擴(kuò)增體系

PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸30sec，30個(gè)循環(huán)；72℃后延伸10min。

2.2 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

對(duì)表達(dá)菌株分別用不同濃度的IPTG（終濃度0.5、1、2、4、8mmol/L）和不同誘導(dǎo)時(shí)間（1、2、3、4、5h）進(jìn)行表達(dá)條件的優(yōu)化。

2.3 表達(dá)產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳（Trision-SDSPAGE）檢測(cè)

鑒定為陽(yáng)性的菌液，經(jīng)IPTG3.5h誘導(dǎo)后，進(jìn)行Trision-SDS-PAGE電泳[1，2]。

3 結(jié)果與討論

（1）經(jīng)PCR擴(kuò)增和雙酶切鑒定，如圖1所示，結(jié)果在約354bp和5900bp處見(jiàn)到明顯的條帶，與預(yù)期目的帶大小相符。

圖1 酶切鑒定表達(dá)載體重組質(zhì)粒pET32a-INH-α

（2）取超聲波破碎處理的誘導(dǎo)菌液沉淀和上清進(jìn)行Trision-SDS-PAGE分析。結(jié)果如圖2，融合蛋白大部分以包涵體的形式存在，在32.8kDa位置有一明顯符合預(yù)期大小的條帶。

圖2 包涵體的鑒定

（3）加入IPTG誘導(dǎo)1～5h后，經(jīng)Trision-SDS-PAGE分析，通過(guò)Imagemaster totallab v1.11軟件進(jìn)行凝膠自動(dòng)掃描分析，融合蛋白的表達(dá)量約占菌體總蛋白的28.96%。在約3.5h達(dá)到最大表達(dá)量，如圖3。

圖3 INH-α基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

4 結(jié)論

構(gòu)建了仔鵝和東北白鵝INH-α亞基成熟區(qū)cDNA的原核表達(dá)載體pET32a（+）-INH-α，為進(jìn)一步進(jìn)行鵝INH-α亞基的真核表達(dá)打下重要的理論基礎(chǔ)、提供重要的參考數(shù)據(jù)。

將構(gòu)建好的ET32a（+）-INH-α原核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到受體菌E.coli BL21（DE3）中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，Tricine-SDSPAGP電泳鑒定，檢測(cè)到INH-α外源基因的表達(dá)。而且，本研究構(gòu)建的融合蛋白表達(dá)量很高（約占菌體總蛋白的30%），是一種較實(shí)用的原核表達(dá)系統(tǒng)。

[1]曹佐武.小分子肽的Tricine-SDS-PAGP分離方法.生物學(xué)通報(bào)[J].2003,38（3）:55-56.

[2]J Sambrook,DW Russell.Expression of cloned genes in E.coil using the bacteriophage T7 promoter[M].Molecular cloning,a laboratory Manual,third edition.2001,Cold Spring Harbor Laboratory Express,New York.Pp15.20-15.24.

薛琳琳（1980-），女，碩士，副教授，主要從事家禽飼養(yǎng)繁育及動(dòng)物解剖生理教學(xué)及科研工作。