石鑫 張皓 孫穎 朱文宇 王書全

(遼寧省醫(yī)學院畜牧獸醫(yī)學院 121001)

豬水皰病RT-nPCR方法的建立及初步應用

石鑫 張皓 孫穎 朱文宇 王書全*

(遼寧省醫(yī)學院畜牧獸醫(yī)學院 121001)

為了建立豬水皰病RT-PCR檢測方法并初步應用于臨床檢測。根據(jù)GenBank上發(fā)表的豬水皰病16SrRNA基因序列，設計內、外2對特異性引物，進行RT-PCR檢測方法研究。結果表明，能夠擴增的基因片段大小為687bp，與GenBank收錄的相關序列同源性高達93.2%，對62份樣品進行了檢測，陽性率為22.58%。

豬水皰病;RT-PCR;建立;應用

豬水皰病 （Swinevesiculardisease，SVD）病原是豬水皰病病毒（SVDV）為小RNA病毒科腸道病毒屬的成員。豬水皰病是豬的一種急性傳染病，其臨床表現(xiàn)以口鼻腔粘膜、蹄部出現(xiàn)水皰或潰爛為特征。目前，常用的SVDV實驗室診斷方法無法快速準確的對該病進行確診，以致錯過最佳的預防治療時機，造成嚴重的經濟損失。本研究通過建立SVDV反轉錄-巢式PCR（RT-nPCR）方法，開展對SVD的快速診斷研究，為豬水皰病的防治奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品與對照病毒株

采自遼寧省錦州地區(qū)養(yǎng)豬戶或養(yǎng)豬場水皰性疾病的水皰液或水皰皮62份；對照毒株為口蹄疫病毒、水皰性口炎均由遼寧醫(yī)學院預防獸醫(yī)實驗室保存，豬水皰性疹病毒基因片段質粒由遼寧醫(yī)學院實驗動物中心惠贈。

1.2 主要試劑與儀器

全血基因組RNA提取試劑盒，反轉錄試劑盒，質粒小量制備試劑盒、DH5α 感受態(tài)菌和 pMDl8-TVector、TakaraExTaq聚合酶等均購于大連寶生物公司、DNA純化回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；PCR擴增儀（BIO-RAD公司）；PCA300型電泳儀（Bio-RAD公司）。

1.3 引物的設計合成

根據(jù)GenBank上發(fā)表的豬SVDV VP1基因序列，利用分子生物學軟件對序列比對分析后，利用Primer5.0設計出下列引物，設計內、外2對特異性引物，能夠擴增出681bp基因片段：

外引物：P1-GACTCCGATGGCGACAACTT；P2-TTGCTTGTCAAACCT GGC。

內引物：P3-ACTTGGGAGCGGAC CAGTTA；P4-GAGCAACTTGCCGTGTGT。

1.4 樣本基因RNA的提取及反轉錄

按照提取試劑盒說明書進行操作。

1.5 反應條件的建立與優(yōu)化

通過試驗，建立并優(yōu)化RT-nPCR反應條件和反應體系，最佳反應條件和反應體系為：

總 體 系 為 25μl： 模 板 1μl，2.5mmol/LdNTP2μl， 50pmol/L 的 P1和 P2各 0.2μl， 100pmol/L的 P3和 P4各 3μl， 10xPCRbuffer2.5μl， ExTaq 聚合酶 1μl， ddH2O13.6μl。

反應條件：94℃預變性 5min；94℃變性 45s； 58℃退火 45s， 72℃延伸45s， 5個循環(huán)； 94℃， 5min； 94℃變性20s； 54℃退火 30s， 72℃延伸 30s， 30個循環(huán)；72℃，5min。

1.6 最佳退火溫度的確定

外引物最佳退火溫度確定：在其他反應條件不變，對第一輪PCR的退火溫度進行溫度梯度PCR，退火溫度范圍為56～70℃；外引物最佳退火溫度確定：在確定外引物最佳退火溫度后，使用內引物進行溫度梯度PCR，退火溫度范圍為51～55℃，其他反應條件不變。內外引物的最佳退火溫度均根據(jù)目的條帶的亮度確定。

1.7 PCR產物的克隆和測序

在PCR之后，在1%瓊脂糖凝膠中電泳進行檢測，將目的條帶使用膠回收試劑盒回收，與pMD18-T載體于4℃連接過夜后，然后轉化進感受態(tài)大腸埃希菌DH5α，挑取具有氨芐抗性的陽性克隆，提取質粒，進行測序。

1.8 特異性試驗

分別提取口蹄疫病毒、豬水皰性口炎、豬水皰性疹的反轉錄DNA作為模版，稀釋至標準濃度，按l.5所述的反應體系和條件進行RT-PCR擴增。

1.9 敏感性檢測

提取陽性豬水皰病病毒反轉錄DNA，測定其OD值，計算出DNA濃度，然后進行10倍倍比稀釋后，進行RT-PCR擴增。

1.10RT-nPCR的臨床應用

應用建立的檢測方法對來自錦州地區(qū)62份樣本進行檢測。

2 結果

2.1 PT-PCR擴增結果及目的基因的測序

測序結果表明，獲得基因片段的大小為681bp。同Genbank中所列相關基因進行比較，基因同源性在93.2%。圖1為可樣品檢測結果。

圖1 PCR擴增結果

2.2 最佳退火溫度的選擇

圖2表明，使用外引物P1、P2時，退火溫度在59℃目的條帶最亮，因此確定最佳外引物退火溫度為59℃；圖3表明，退火溫度在52℃時條帶最亮，所以確定最佳內引物退火溫度為52℃。

圖2 外引物溫度梯度PCR結果

2.3 特異性檢測

結果顯示，以SVDV陽性全血作為模板進行RT-nPCR反應可以擴增得到大小為687bp的特異性條帶，而以口蹄疫病毒、豬水皰性口炎、豬水皰性疹的反轉錄DNA作為模版則均未見特異性條帶。

2.4 敏感性檢測

圖3 內引物溫度梯度PCR結果

結果顯示，當樣本反轉錄基因組DNA稀釋到105倍時RT-PCR還能見到清晰的條帶，說明該豬水皰病RTPCR方法有較高的敏感性。

2.5 臨床樣本檢測

應用所建立的檢測方法對來自錦州地區(qū)62份樣本進行檢測，結果檢測出陽性樣本14例，陽性率22.58%。

2013年遼寧省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目：豬水皰病RT-nPCR方法的建立及初步應用（201310160025）。

石鑫（1991-），女，遼寧省海城市人，本科學生，動物醫(yī)學專業(yè)。