石鑫 張皓 孫穎 朱文宇 王書全

(遼寧省醫(yī)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院 121001)

豬水皰病RT-nPCR方法的建立及初步應(yīng)用

石鑫 張皓 孫穎 朱文宇 王書全*

(遼寧省醫(yī)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院 121001)

為了建立豬水皰病RT-PCR檢測(cè)方法并初步應(yīng)用于臨床檢測(cè)。根據(jù)GenBank上發(fā)表的豬水皰病16SrRNA基因序列，設(shè)計(jì)內(nèi)、外2對(duì)特異性引物，進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)方法研究。結(jié)果表明，能夠擴(kuò)增的基因片段大小為687bp，與GenBank收錄的相關(guān)序列同源性高達(dá)93.2%，對(duì)62份樣品進(jìn)行了檢測(cè)，陽(yáng)性率為22.58%。

豬水皰病;RT-PCR;建立;應(yīng)用

豬水皰病 （Swinevesiculardisease，SVD）病原是豬水皰病病毒（SVDV）為小RNA病毒科腸道病毒屬的成員。豬水皰病是豬的一種急性傳染病，其臨床表現(xiàn)以口鼻腔粘膜、蹄部出現(xiàn)水皰或潰爛為特征。目前，常用的SVDV實(shí)驗(yàn)室診斷方法無(wú)法快速準(zhǔn)確的對(duì)該病進(jìn)行確診，以致錯(cuò)過(guò)最佳的預(yù)防治療時(shí)機(jī)，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本研究通過(guò)建立SVDV反轉(zhuǎn)錄-巢式PCR（RT-nPCR）方法，開(kāi)展對(duì)SVD的快速診斷研究，為豬水皰病的防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品與對(duì)照病毒株

采自遼寧省錦州地區(qū)養(yǎng)豬戶或養(yǎng)豬場(chǎng)水皰性疾病的水皰液或水皰皮62份；對(duì)照毒株為口蹄疫病毒、水皰性口炎均由遼寧醫(yī)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室保存，豬水皰性疹病毒基因片段質(zhì)粒由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心惠贈(zèng)。

1.2 主要試劑與儀器

全血基因組RNA提取試劑盒，反轉(zhuǎn)錄試劑盒，質(zhì)粒小量制備試劑盒、DH5α 感受態(tài)菌和 pMDl8-TVector、TakaraExTaq聚合酶等均購(gòu)于大連寶生物公司、DNA純化回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；PCR擴(kuò)增儀（BIO-RAD公司）；PCA300型電泳儀（Bio-RAD公司）。

1.3 引物的設(shè)計(jì)合成

根據(jù)GenBank上發(fā)表的豬SVDV VP1基因序列，利用分子生物學(xué)軟件對(duì)序列比對(duì)分析后，利用Primer5.0設(shè)計(jì)出下列引物，設(shè)計(jì)內(nèi)、外2對(duì)特異性引物，能夠擴(kuò)增出681bp基因片段：

外引物：P1-GACTCCGATGGCGACAACTT；P2-TTGCTTGTCAAACCT GGC。

內(nèi)引物：P3-ACTTGGGAGCGGAC CAGTTA；P4-GAGCAACTTGCCGTGTGT。

1.4 樣本基因RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

按照提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.5 反應(yīng)條件的建立與優(yōu)化

通過(guò)試驗(yàn)，建立并優(yōu)化RT-nPCR反應(yīng)條件和反應(yīng)體系，最佳反應(yīng)條件和反應(yīng)體系為：

總 體 系 為 25μl： 模 板 1μl，2.5mmol/LdNTP2μl， 50pmol/L 的 P1和 P2各 0.2μl， 100pmol/L的 P3和 P4各 3μl， 10xPCRbuffer2.5μl， ExTaq 聚合酶 1μl， ddH2O13.6μl。

反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性 5min；94℃變性 45s； 58℃退火 45s， 72℃延伸45s， 5個(gè)循環(huán)； 94℃， 5min； 94℃變性20s； 54℃退火 30s， 72℃延伸 30s， 30個(gè)循環(huán)；72℃，5min。

1.6 最佳退火溫度的確定

外引物最佳退火溫度確定：在其他反應(yīng)條件不變，對(duì)第一輪PCR的退火溫度進(jìn)行溫度梯度PCR，退火溫度范圍為56～70℃；外引物最佳退火溫度確定：在確定外引物最佳退火溫度后，使用內(nèi)引物進(jìn)行溫度梯度PCR，退火溫度范圍為51～55℃，其他反應(yīng)條件不變。內(nèi)外引物的最佳退火溫度均根據(jù)目的條帶的亮度確定。

1.7 PCR產(chǎn)物的克隆和測(cè)序

在PCR之后，在1%瓊脂糖凝膠中電泳進(jìn)行檢測(cè)，將目的條帶使用膠回收試劑盒回收，與pMD18-T載體于4℃連接過(guò)夜后，然后轉(zhuǎn)化進(jìn)感受態(tài)大腸埃希菌DH5α，挑取具有氨芐抗性的陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒，進(jìn)行測(cè)序。

1.8 特異性試驗(yàn)

分別提取口蹄疫病毒、豬水皰性口炎、豬水皰性疹的反轉(zhuǎn)錄DNA作為模版，稀釋至標(biāo)準(zhǔn)濃度，按l.5所述的反應(yīng)體系和條件進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。

1.9 敏感性檢測(cè)

提取陽(yáng)性豬水皰病病毒反轉(zhuǎn)錄DNA，測(cè)定其OD值，計(jì)算出DNA濃度，然后進(jìn)行10倍倍比稀釋后，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。

1.10RT-nPCR的臨床應(yīng)用

應(yīng)用建立的檢測(cè)方法對(duì)來(lái)自錦州地區(qū)62份樣本進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 PT-PCR擴(kuò)增結(jié)果及目的基因的測(cè)序

測(cè)序結(jié)果表明，獲得基因片段的大小為681bp。同Genbank中所列相關(guān)基因進(jìn)行比較，基因同源性在93.2%。圖1為可樣品檢測(cè)結(jié)果。

圖1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 最佳退火溫度的選擇

圖2表明，使用外引物P1、P2時(shí)，退火溫度在59℃目的條帶最亮，因此確定最佳外引物退火溫度為59℃；圖3表明，退火溫度在52℃時(shí)條帶最亮，所以確定最佳內(nèi)引物退火溫度為52℃。

圖2 外引物溫度梯度PCR結(jié)果

2.3 特異性檢測(cè)

結(jié)果顯示，以SVDV陽(yáng)性全血作為模板進(jìn)行RT-nPCR反應(yīng)可以擴(kuò)增得到大小為687bp的特異性條帶，而以口蹄疫病毒、豬水皰性口炎、豬水皰性疹的反轉(zhuǎn)錄DNA作為模版則均未見(jiàn)特異性條帶。

2.4 敏感性檢測(cè)

圖3 內(nèi)引物溫度梯度PCR結(jié)果

結(jié)果顯示，當(dāng)樣本反轉(zhuǎn)錄基因組DNA稀釋到105倍時(shí)RT-PCR還能見(jiàn)到清晰的條帶，說(shuō)明該豬水皰病RTPCR方法有較高的敏感性。

2.5 臨床樣本檢測(cè)

應(yīng)用所建立的檢測(cè)方法對(duì)來(lái)自錦州地區(qū)62份樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果檢測(cè)出陽(yáng)性樣本14例，陽(yáng)性率22.58%。

2013年遼寧省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目：豬水皰病RT-nPCR方法的建立及初步應(yīng)用（201310160025）。

石鑫（1991-），女，遼寧省海城市人，本科學(xué)生，動(dòng)物醫(yī)學(xué)專業(yè)。