任小林　宋珍　楊斌盛

(山西大學分子科學研究所，化學生物學與分子工程教育部重點實驗室，太原030006)

2，6-吡啶二甲酰肼2-羥基萘甲醛酰腙-Cu(Ⅱ)-CopC三元配合物的光譜研究

任小林宋珍楊斌盛＊

(山西大學分子科學研究所，化學生物學與分子工程教育部重點實驗室，太原030006)

以2，6-吡啶二甲酸為原料，經?；Ⅴセ?、胺解、親和加成合成2,6-吡啶二甲酰肼-2-羥基萘甲酰腙(L1)。用紫外-可見吸收光譜、熒光光譜、熒光壽命方法研究了酸堿對L1互變異構的影響及L1、Cu(Ⅱ)、銅運輸?shù)鞍?copper trafficking protein，apoCopC)三者的相互結合。結果表明，在pH=7.4、50 mmol·L-1Tris-HCl緩沖條件下，L1可分別與Cu(Ⅱ)、apoCopC結合形成1∶1的配合物，條件結合常數(shù)分別為3.32×106mol-1·L和4.01×105mol-1·L；而Cu(Ⅱ)-L1與apoCopC結合形成1∶1復合物的條件結合常數(shù)為8.09× 105mol-1·L。熒光共振能量轉移、分子對接模擬表明，L1結合在apoCopC的N端，光譜滴定證實L1、Cu(Ⅱ)、apoCopC可形成以Cu (Ⅱ)為中心的三元配合物。

2，6-吡啶二甲酰肼2-羥基萘甲醛酰腙；Cu(Ⅱ)；銅運輸?shù)鞍?；配合物；光譜

CopC蛋白是革蘭氏陰性菌(Pseudomnas syringae)抗銅操縱子cop所編碼的4個蛋白(CopA、CopB、CopC、CopD)之一[1-2]，其溶液結構呈現(xiàn)由“l(fā)oop”相連β折疊疏水桶狀結構，相距大約3 nm的2個金屬離子結合位點位于疏水桶的兩端，其中位于蛋白C端的Met殘基(40，43，46，51)中的2或3個及His48與Cu(Ⅱ)配位，而位于蛋白N端的His1、Asp89、Glu27和His91與Cu(Ⅱ)配位[3-5]。Cu(Ⅱ)-CopC的氧化或Cu(Ⅱ)-CopC的還原能使得銅離子從一個位點遷移到另一個位點[1-2]，即CopC在銅離子調控中起著重要的作用。研究有機小分子對CopC結合銅的影響、探討CopC銅調控的分子機理具有重要意義[6]。

本工作基于溶液中2，6-吡啶二甲酰肼2-羥基萘甲醛酰腙(L1)分別與Cu(Ⅱ)、apoCopC的結合性質，研究了L1-Cu(Ⅱ)-apoCopC三元配合物的形成。

1　實驗部分

1.1試劑和儀器

2，6-吡啶二甲酸，99%，aladdin產品；2-羥基-1-萘甲醛，99%，北京百靈威；二氯亞砜、無水甲醇，分析純，天津市化學試劑三廠；水合肼，分析純，天津市天大化工實驗廠；乙二胺四乙酸(EDTA)為沈陽試劑四廠產品；三羥甲基氨基甲烷(Tris)為上海化學試劑廠產品，其它試劑均為分析純。

Varian-Cray Eclipse熒光光譜儀；Edinburgh Analytical Instrument type nF-900熒光壽命儀；Cary 50 Bio UV-Visible吸收光譜儀；德國產VarioELⅢ型元素分析儀；Shimadin-FTIR-8400S紅外光譜儀；Bruker DRX-300 MHz核磁共振儀；Eppendorf移液槍。

1.2實驗方法

配體L1的合成：使用2，6-吡啶-二甲酸、2-羥基1-萘甲醛、SOCl2、水合肼(80%)為原料，按照文獻方法[7]由圖示1所示路線合成2，6-吡啶二甲酰肼2-羥基萘甲醛酰腙。

圖示1配體的合成路線Scheme 1Synthetic route of L1

取2，6-吡啶-二甲酸3.34 g和SOCl211 mL置于圓底燒瓶中，加熱回流2 h，冷卻后在冰水浴攪拌條件下緩慢滴加甲醇并繼續(xù)加熱1 h。靜置、冷卻、洗滌得白色2，6-吡啶二甲酸二甲酯沉淀。將3.90 g 2，6-吡啶-二甲酸二甲酯用無水甲醇30 mL溶于圓底燒瓶中，加入6 mL水合肼(80%)，加熱回流片刻，靜置、冷卻、過濾、洗滌得到白色2，6-吡啶二甲酰肼固體。干燥后測得其熔程為123～124℃。稱取0.20 g 2，6-吡啶二甲酰肼加入到100 mL圓底燒瓶中，再加入約20 mL水，加熱至體系全部溶解。加入適量2-羥基-1-萘甲醛乙醇溶液，加熱回流2 h，冷卻，過濾、洗滌并收集生成的黃色2，6-吡啶二甲酰肼2-羥基萘甲醛酰腙固體。熔點>300℃。

元素分析實測(理論)值(%)為：C，69.15(69.18)；H，4.22(4.20)；N，4.22(4.20)。1H NMR(DMSO)：δ為12.50(s，2H，-OH)，12.50(s，2H，-NH)，9.80(s，2H，-CH =N)，8.51～7.65(m，6H，萘環(huán))，7.46～7.24(m，3H，吡啶環(huán))。IR(KBr壓片)：ν為3 462(O-H…O)，3 229(NH), 1 682 cm-1(C=O)。

apoCopC的制備按照文獻[5]方法，通過吸收光譜測定其在278 nm處的吸光度值計算其濃度。

1.3光譜測定

紫外-可見吸收光譜在Cary 50 Bio UV-Vis吸收光譜儀上測定，室溫條件下用1 cm吸收池測量。熒光光譜在Cary Varian Eclipse熒光分光光度計上測量，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm。實驗過程通過循環(huán)水浴控制溫度，所有測定均恒定在25℃。

熒光壽命的測定在Edinburgh Analytical Instrument type nF-900熒光儀上進行，用時間關聯(lián)單光子計數(shù)法測定。激發(fā)光源為EPLED-280，用Ludox HS-30硅溶膠散射液為儀器響應(IR)，根據(jù)(1)式由其最大熒光發(fā)射波長處的熒光衰減曲線非線性擬合得出樣品的熒光壽命值。

2　結果與討論

2.1配體L1的性質

2.1.1酸度對L1光譜性質的影響

圖1是L1在不同pH值條件下的紫外-可見吸收光譜(A)和熒光光譜(B)?？梢?，當pH<9.0時L1的最大吸收峰位于375 nm附近，隨著pH值的增大，L1在375 nm處的最大吸收峰逐漸減小，同時在430 nm附近出現(xiàn)新的吸收峰，即L1的最大吸收峰由375 nm(pH=7.4)紅移為約430 nm(pH=11.0)，且在400 nm處出現(xiàn)等吸收點；與酸度對L1紫外-可見吸收光譜的影響不同，其激發(fā)波長為400 nm時的熒光光譜(圖1B)最大峰位于515 nm處，隨著pH值的增加，最大發(fā)射峰位沒有明顯的變化，僅有熒光強度的減弱，直至完全被猝滅(pH>9.0)。

圖1不同pH值溶液中L1的紫外-可見吸收光譜(A)和熒光光譜(B)Fig.1　UV-Vis absorption(A)and fluorescence spectra(B)of L1 in solutions with different pH values CL1was 10 μmol·L-1,λex=400 nm,20℃

圖2A為L1在不同pH值條件下515 nm處熒光隨時間衰減的變化曲線。由圖2A可見，隨著溶液pH值的增加，515 nm處熒光衰減變慢，即熒光壽命變長。按照(1)式非線性擬合不同pH值時的衰減曲線，均表現(xiàn)為雙指數(shù)衰減，即短壽命、長壽命發(fā)光體熒光衰減的疊加。

表1列出L1在不同pH值時短壽命、長壽命發(fā)光體的擬合參數(shù)。其中短壽命發(fā)光體熒光衰減的貢獻隨著pH值的增加而減少，而長壽命發(fā)光體熒光衰減的貢獻隨著pH值的增加而增加(見圖2A插圖)，在pH=9.3時短、長壽命發(fā)光體各有約50%。短壽命發(fā)光體的τ1平均值為(2.02±1.30)ns，長壽命發(fā)光體的τ2平均值為(7.83±0.97)ns。

圖2　不同pH值(A)、溶劑(B)時L1熒光(515 nm)衰減曲線Fig.2　Fluorescence decays of L1 in different pH values(A)and solvents(B)

酰腙由于有酸性的α-H，不同的pH值會影響質子轉移，形成酮式和烯醇式[8]。堿性增加，會奪去酮式的α-H，然后負電荷離域到酮的雙鍵，形成烯醇式。因此，溶液的酸堿性對酰腙化合物的構型有一定的影響，改變酰腙的兩種異構體在溶液中的分布平衡(圖示2)。堿性溶液可穩(wěn)定酰腙的烯醇式構型。由圖1A可見，當pH<9.0時，L1主要為酮式構型；當pH>9.0時，L1主要以烯醇式構型存在。由圖2A可見，酮式構型L1的熒光壽命為(2.02±1.30)ns，烯醇式構型L1的熒光壽命為(7.83±0.97)ns。

表1　L1在不同pH值和不同溶劑中的熒光壽命參數(shù)Table 1Time resolved fluorescence decay parameters of L1 at different pH values and in different solvents

圖示22，6-吡啶二甲酰肼2-羥基萘甲醛酰腙的兩種異構體形式Scheme 2Isomer forms of L1

2.1.2溶劑對L1光譜性質的影響

隨著溶劑極性的增大，L1紫外-可見吸收光譜、熒光發(fā)射光譜都有一定的紅移和強度增加，如DMF為溶劑時紫外最大吸收峰為370 nm，最大熒光峰為510 nm，而H2O為溶劑時紫外最大吸收峰紅移為375 nm，最大熒光峰紅移為515 nm。溶劑極性對L1的熒光壽命也有顯著的影響。圖2B為L1在3種不同溶劑時515 nm處熒光強度隨時間衰減的變化曲線。可見，隨著溶劑極性的減小(H2O，DMSO，C6H12)， L1在515 nm處熒光強度隨時間衰減明顯變慢。按照按照(1)式非線性擬合所得衰減參數(shù)列于表1。表明水溶液中L1主要為酮式構型。

圖3　L1和Cu(Ⅱ)-L1的紫外-可見吸收光譜和熒光譜及Cu(Ⅱ)滴定L1的紫外差光譜Fig.3　UV-Vis and fluorescence spectra of L1 and complex of Cu(Ⅱ)-L1 and UV-Vis difference spectra produced from the addition of Cu(Ⅱ)to L1 in pH value of 7.4,50 mmol·L-1Tris-HCl,20℃;CL1was 10 μmol·L-1

2.1.3L1與Cu(Ⅱ)的結合

無論L1為酮式或烯醇式構型，均可與Cu(Ⅱ)結合形成配合物。在pH=7.4、50 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液中，L1及加入等量Cu(Ⅱ)后的紫外-可見光譜、熒光光譜分別如圖3A和圖3B所示。由圖3A可見，Cu(Ⅱ)與L1的結合使其紫外-可見最大吸收峰由375 nm紅移為430 nm，400 nm處出現(xiàn)等吸收點，同時在710 nm處(圖3A插圖)出現(xiàn)Cu(Ⅱ)的d-d躍遷吸收峰。與圖1A對比可見，在pH=7.4、50 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液中，加入等量Cu(Ⅱ)后的紫外-可見吸收光譜類似于L1在pH值為11.0時的吸收光譜，即Cu(Ⅱ)使L1由酮式轉化為烯醇式構型。水合Cu(Ⅱ)的最大吸收峰出現(xiàn)在900 nm處[9]，在L1存在下Cu(Ⅱ)的d-d躍遷吸收峰紅移為710 nm。表明L1與Cu(Ⅱ)的結合改變了Cu(Ⅱ)的配位場。與紫外-可見吸收光譜一致，加入等量Cu(Ⅱ)后使L1在515 nm處的熒光完全淬滅(圖3B)也證明Cu(Ⅱ)可與L1結合形成穩(wěn)定的配合物。

圖3C是在pH=7.4、50 mmol·L-1Tris-HCl緩沖條件下，以L1為空白逐漸滴加Cu(Ⅱ)所測得的紫外-可見吸收差光譜。可見，隨著Cu(Ⅱ)的滴加在375 nm附近出現(xiàn)負峰、430 nm附近出現(xiàn)正峰并逐漸增強、400 nm處出現(xiàn)等吸收點。當?shù)渭拥腃u(Ⅱ)達到一定量后，差光譜不再隨著Cu(Ⅱ)的滴加而變化。將420 nm處的表觀摩爾吸光度對CCu(Ⅱ)/CL1作圖如圖3C插圖?？梢?，隨著CCu(Ⅱ)/CL1的增加，420 nm處的表觀摩爾吸光度線性地增加并在CCu(Ⅱ)/CL1=1.0附近出現(xiàn)明顯的拐點。表明Cu(Ⅱ)與L1結合形成1∶1配合物，配合物Cu(Ⅱ)-L1的條件穩(wěn)定常數(shù)為K(Cu(Ⅱ)-L1)= (3.32±0.11)×106mol-1·L。

2.2配體L1及配合物Cu(Ⅱ)-L1與apoCopC的結合

2.2.1L1與apoCopC的結合

圖4A是在pH=7.4、50 mmol·L-1Tris-HCl緩沖條件下，用L1滴定apoCopC所測得的熒光光譜。可見，apoCopC在320 nm處出現(xiàn)最大熒光峰，隨著L1的滴加320 nm處的熒光強度逐漸減小、510 nm處L1的熒光強度逐漸增大。將320 nm處的熒光淬滅ΔF(F0-F)對CL1/CCopC作圖如圖4A插圖。即在CL1/ CCopC<1.0范圍，ΔF隨著CL1/CCopC的增加而線性增加；當CL1/CCopC>1.0時，ΔF不再隨著CL1/CCopC的增加而變化。表明在pH=7.4、50 mmol·L-1Tris-HCl緩沖條件下L1可與apoCopC結合形成1∶1的復合物。復合物的形成使apoCopC在320 nm處的熒光淬滅近30%，L1的最大熒光峰紫移5 nm，強度比在pH= 7.4、50 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液中的強度有所降低，即與apoCopC結合后的L1環(huán)境的極性有所降低。

apoCopC存在下L1的熒光壽命列于表1?？梢?，apoCopC使L1長壽命發(fā)光體對衰減的貢獻增大，L1環(huán)境的疏水性增加。

根據(jù)文獻方法[10]，按照(2)式將lg[(F0-F)/(F-F∞)]對lgCL1作圖，由直線的斜率可得結合位點數(shù)約為1.0，由直線的截距可得L1與apoCopC結合的條件穩(wěn)定常數(shù)。不同溫度下L1與apoCopC結合的條件穩(wěn)定常數(shù)列于表2中。

其中K為L1與apoCopC結合的條件穩(wěn)定常數(shù)，n為apoCopC的L1結合位點數(shù)，F(xiàn)0為沒有L1時的熒光強度，F(xiàn)為滴加L1后的熒光強度，F(xiàn)∞為L1最大淬滅時apoCopC的熒光強度。

圖4　L1(A)及Cu(Ⅱ)-L1(B)分別滴定apoCopC的熒光光譜Fig.4　Fluorescence spectra produced from the addition of L1(A)and Cu(Ⅱ)-L1(B)to apoCopC(1.0 μmol·L-1) in pH=7.4,50 mmol·L-1Tris-HCl,20℃

表2　L1-apoCopC及L1-Cu(Ⅱ)-CopC表觀結合常數(shù)和熱力學參數(shù)Table 2 Thermodynamic parameter and apparent binding constants of L1-apoCopC or L1-Cu(Ⅱ)-CopC

按照Vant-Hoff方程：其中ΔG為L1與apoCopC反應的吉布斯自由能，ΔS為反應熵變，ΔH為焓變。將ΔG對T作圖，由直線的斜率和截距可得L1與apoCopC反應的ΔH和ΔS(見表2)。由于ΔH<0且ΔH值較小，ΔS>0，可以得出，L1與apoCopC之間的作用主要為疏水和氫鍵作用[11]。

2.2.2Cu(Ⅱ)-L1與apoCopC的結合

在相同實驗條件下用Cu(Ⅱ)-L1滴定apoCopC所測得的熒光光譜如圖4B所示?？梢?，隨著Cu(Ⅱ)-L1的滴加apoCopC在320 nm處的熒光強度逐漸減小。將320 nm處的熒光淬滅ΔF(F0-F)對CCu(Ⅱ)-opC作圖如圖4B插圖。即在CCu(Ⅱ)-CopC<1.0范圍，ΔF隨著CCCopC的增加而線性增加；當CCu(Ⅱ)CopC>1.0時，ΔF隨著CC-L1/CCopC的增加而增加變緩。表明在pH=7.4、50 mmol·L-1Tris-HCl緩沖條件下Cu(Ⅱ)-L1也可與apoCopC結合形成1:1的復合物，即三元配合物。配合物的形成使apoCopC在320 nm處的熒光淬滅約48%。按照L1滴定apoCopC類似的方法，根據(jù)(2)式處理3個不同溫度下Cu(Ⅱ)-L1的熒光淬滅數(shù)據(jù)，可得Cu(Ⅱ)-L1在apoCopC中的結合位點數(shù)n也為1.0，條件結合常數(shù)一并列于表2中。由表2數(shù)據(jù)可見，相同條件下Cu(Ⅱ)-L1與apoCopC結合形成的配合物條件結合常數(shù)約是L1-apoCopC復合物條件結合常數(shù)的2倍。盡管熱力學參數(shù)ΔH<0且ΔS>0，結合驅動力仍主要為疏水和氫鍵作用，但ΔH (L1-Cu(Ⅱ)-apoCopC)是L1-apoCopC的1/2，而ΔS(L1-Cu(Ⅱ)-apoCopC)是L1-apoCopC的2倍多。表明L1和Cu(Ⅱ)-L1分別與apoCopC結合時其作用力有一定的差異。

在生理條件下apoCopC與Cu(Ⅱ)結合的條件常數(shù)約為(1.80±0.58)×1013mol-1·L，Cu(Ⅱ)的結合使蛋白質的熒光淬滅約67%[12]，而L1與Cu(Ⅱ)結合的條件結合常數(shù)僅為(3.32±0.11)×106mol-1·L，Cu(Ⅱ)-L1幾乎不發(fā)熒光。作為Cu(Ⅱ)的配體，apoCopC可與L1有效競爭Cu(Ⅱ)，即apoCopC與Cu(Ⅱ)-L1中的Cu(Ⅱ)結合并出現(xiàn)游離L1、使L1在510 nm處的熒光恢復。由圖4B可見，滴加Cu(Ⅱ)-L1時L1的熒光幾乎沒有變化。表明溶液中Cu(Ⅱ)既與apoCopC結合，又與L1結合。

2.3L1-Cu(Ⅱ)-CopC三元配合物

圖5A是pH=7.4、50 mmol·L-1Tris-HCl緩沖條件下Cu(Ⅱ)滴定L1-apoCopC的熒光光譜?？梢?，在320 nm和510 nm處分別出現(xiàn)apoCopC和L1的熒光峰。隨著Cu(Ⅱ)的滴加，320 nm和510 nm處的熒光均逐漸被淬滅，即Cu(Ⅱ)同時與apoCopC和L1結合。將apoCopC在320 nm處的摩爾熒光淬滅對CCu(Ⅱ) /CapoCopC-L1作圖如圖5A插圖，可見在CCu(Ⅱ)/CC<1.0范圍內，熒光淬滅隨著CCu(Ⅱ)C-L1的增加而線性增加，當CCu(C-L1>1.0時，熒光淬滅隨著CCu(Ⅱ)/pC-L1增加的變化趨緩，即Cu(Ⅱ)與apoCopC-L1中的apoCopC結合形成1∶1配合物，并使蛋白質的熒光淬滅近43%，小于二元體系中Cu(Ⅱ)對apoCopC的熒光淬滅(67%)[12]；L1在510 nm處的摩爾熒光淬滅對CoCopC-L1作圖也示于圖5A插圖中，可見Cu (Ⅱ)與L1的結合使L1的熒光部分淬滅(約40%)，小于二元體系中Cu(Ⅱ)對L1的熒光淬滅(圖3B)。表明三元配合物是以Cu(Ⅱ)為中心離子形成的。

圖5B是pH=7.4、50 mmol·L-1Tris-HCl緩沖條件下Cu(Ⅱ)滴定高濃度L1-apoCopC的紫外-可見吸收差光譜?？梢奀u(Ⅱ)的滴加導致380 nm附近出現(xiàn)負峰、425 nm附近出現(xiàn)正峰并逐漸增強、412 nm處出現(xiàn)等吸收點。與圖3C對比可見，apoCopC的存在使Cu(Ⅱ)與L1結合的紫外-可見吸收差光譜明顯不同：等吸收點紅移約10 nm，380 nm附近負峰強度遠大于425 nm附近正峰強度。當?shù)渭拥腃u(Ⅱ)的達到一定量后，差光譜不再隨著Cu2+的滴加而變化。將380 nm處的吸光度對CCu(Ⅱ)/CL1-apoCopC作圖如圖5B插圖?？梢?，隨著CCu(Ⅱ)/CL1-apoCopC的增加，380 nm處的吸光度在CCu(Ⅱ)/CL1-apoCopC=1.0附近出現(xiàn)明顯的拐點。與熒光實驗一致，表明Cu(Ⅱ)為三元配合物的中心。

圖5　Cu(Ⅱ)滴定L1-CopC(1∶1)的熒光光譜(A)和紫外-可見吸收差光譜(B)Fig.5　Fluorescence(A)and UV-Vis difference spectra(B)of Cu(Ⅱ)titration to L1-CopC(1∶1)in pH=7.4, 50 mmol·L-1Tris-HCl,20℃

2.4L1在apoCopC的結合位點

2.4.1熒光共振能量轉移

apoCopC在320 nm處的熒光源于唯一的Trp83殘基，按照F?rster無輻射共振能量轉移(FRET)理論，給體(Trp83)與受體(apoCopC結合的L1)的距離r和臨界能量轉移距離R0間有(4)式所示關系。

其中E為能量轉移效率，F(xiàn)0為apoCopC在320 nm處的熒光強度，F(xiàn)為L1-apoCopC的熒光強度，R0為臨界能量轉移距離，如(5)式所示。

其中κ2為取向因子，φTrp為給體(Trp83)的量子產率，n為介質的折射指數(shù)，J為(6)式所示的光譜重疊積分。

其中F(ν)為波數(shù)ν處給體的熒光強度，ε(ν)為受體的摩爾吸光系數(shù)。

圖6是apoCopC的熒光光譜(a)和受體L1的紫外可見吸收光譜(b)間的重疊，將其按照(6)式在300～500 nm范圍計算的光譜重疊積分為1.61×10-15cm3· L·mol-1。根據(jù)(5)式及κ2、φTrp、n的取值[6,13]，可得R0為1.65 nm。由(4)式及能量轉移效率E=0.32，得出L1的偶極中心與apoCopC中色氨酸殘基偶極中心之間的距離r為1.86 nm，即0.5R0≤r≤1.5R0。說明apoCopC中色氨酸殘基向結合L1間的無輻射能量轉移使蛋白質320 nm處的熒光被淬滅。

圖6　apoCopC的熒光光譜(a)和L1的紫外可見吸收光譜(b)Fig.6　Overlap between the fluorescence spectrum(a)of apoCopC and UV-Vis absorption spectrum(b)of L1 at pH=7.4,50 mmol·L-1Tris-HCl

類似地由Cu(Ⅱ)-L1的吸收光譜與apoCopC在300～500 nm范圍內的熒光光譜的重疊及(6)式可得配合物與apoCopC的光譜重疊積分J為2.11×10-15cm3·L·mol-1，而R0為1.72 nm，能量轉移效率E為0.39，配合物偶極中心與apoCopC中色氨酸殘基偶極中心之間的距離r為1.85 nm，即0.5R0≤r≤1.5R0。配合物對apoCopC熒光的淬滅仍源于無輻射能量轉移，r值也沒有明顯的變化。

apoCopC的Trp83位于蛋白質疏水桶中部，與N端Cu(Ⅱ)結合位點相距約1 nm，與C端Cu(Ⅱ)結合位點相距約2 nm[2-3]。由Cu(Ⅱ)滴定L1-apoCopC時同時與L1、apoCopC結合及所測得的r值可推斷L1的結合位點位于蛋白質的N端。

2.4.2分子模擬分析

采用分子自動對接軟件ArgusLab 4.0.1對apoCopC的L1結合位點及作用模式進行模擬。模擬中選用apoCopC的已知結構(PDB碼：1M42)[1]，通過全局搜索得出最低能量-8.18 kJ·mol-1的構象為對接模擬結果，采用PyMOL軟件可視化如圖7所示。由圖7A可見，L1結合在apoCopC的N端，由于與蛋白質的結合使其分子的平面性遭到破壞。若仍將吡啶環(huán)看做分子的偶極中心，則83位色氨酸殘基偶極中心與L1偶極中心之間的距離r約為1.72 nm，與用FRET方法所測結果(1.85 nm)相近。

圖7B是apoCopC的L1結合位點處的一些氨基酸殘基?？梢?，apoCopC直接參與Cu(Ⅱ)配位的His91，Asp89和Glu27殘基處于L1結合位點附近，有利于Cu(Ⅱ)為中心離子的三元配合物的形成。L1的-NH與Ser34的-OH間形成中強氫鍵(N-H…O，0.23 nm)，同時吡啶環(huán)上的N與Ser34的肽鍵氮形成弱氫鍵(N-H…N，0.33 nm)；而Phe33的肽鍵氧與L1的另一-NH間形成中強氫鍵(O…H-N，0.22 nm)，Gln32的-NH與L1的羰基形成中強氫鍵(O…H-N，0.20 nm)。此外，結合位點處有許多疏水性氨基酸殘基Val30，Phe33，Val57，Val67，Ala36及Pro92等。

圖7　L1與apoCopC作用的分子模擬圖Fig.7　Molecular docking for the interaction between L1 and apoCopC

綜上所述，在pH=7.4、50 mmol·L-1Tris-HCl緩沖條件下，L1、Cu(Ⅱ)和apoCopC可形成L1-Cu(Ⅱ)-apoCopC三元配合物，L1與apoCopC的結合導致Cu(Ⅱ)-CopC配合物的一些性質(如Cu(Ⅱ)配位數(shù)、Cu (Ⅱ)與蛋白質的結合能力、結合Cu(Ⅱ)的還原性等)改變。與L1不同，盡管水楊醛半卡巴腙(HSSC，Salicylaldehyde semicarbazone)也可與Cu(Ⅱ)結合形成穩(wěn)定配合物,但由于其結合位點位于蛋白質的C端,HSSC與apoCopC結合后并不影響apoCopC的Cu(Ⅱ)結合性質，只有apoCopC的Cu(Ⅱ)結合位點完全飽和后才與HSSC結合[6]。因此，使用L1為apoCopC的N端Cu(Ⅱ)結合位點擾動分子、HSSC為C端Cu(Ⅱ)結合位點擾動分子有利于CopC銅調控機理的深入研究。

3　結論

在合成、表征2，6-吡啶二甲酰肼-2-羥基萘甲酰腙(L1)的基礎上，利用紫外-可見吸收光譜、熒光光譜、熒光壽命測定、分子對接等方法研究了溶液中L1的互變異構、與Cu(Ⅱ)及apoCopC的結合形成二元配合物的性質。通過Cu(Ⅱ)-L1對apoCopC的熒光滴定及Cu(Ⅱ)對L1-apoCopC的紫外-可見吸收光譜、熒光光譜滴定證實：在pH=7.4、50 mmol·L-1Tris-HCl緩沖條件下，L1、Cu(Ⅱ)、apoCopC可形成以Cu(Ⅱ)為中心的三元配合物。

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Spectral Studies on Complex of 2,6-Pyridine Diformylhydrazine 2-Hydroxylnaphthene Carboxylic Hydrazone-Cu(Ⅱ)-CopC

REN Xiao-LinSONG ZhenYANG Bin-Sheng＊
(Institute of Molecular Science,Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering
of Education Ministry,Shanxi University,Taiyuan 030006,China)

2,6-Pyridine diformylhydrazine 2-hydroxylnaphthene carboxylic hydrazone(L1)was synthesized by acylation,esterification and aminolysis reaction.The effect of pH value on isomerization of L1 and the binding among L1,Cu(Ⅱ)and copper trafficking protein,apoCopC,were studied by using UV-Vis absorption,fluorescence spectra and fluorescence lifetime measurement.The results show that the binding constant is 3.32×106mol-1·L for Cu(Ⅱ)-L1,4.01×105mol-1·L for L1-apoCopC,separately,in pH value of 7.4,50 mmol·L-1Tris-HCl. Meanwhile,the binding constant between Cu(Ⅱ)-L1 and apoCopC is 8.09×105mol-1·L.The average distance between the bound L1 and Trp83 of apoCopC from fluorescence resonance energy transfer was determined and the binding site of L1 in apoCopC,which locats at N-terminal,was shown by an automated public domain software package ArgusLab 4.0.1.The formation of a ternary complex,L1-Cu(Ⅱ)-CopC,is confirmed by the titration of Cu(Ⅱ)to L1-apoCopC in pH value of 7.4 and 50 mmol·L-1Tris-HCl.

2,6-pyridine diformylhydrazine 2-hydroxylnaphthene carboxylic hydrazone;copper(Ⅱ);copper trafficking protein;complex;spectra

O614.121；O614.4

A

1001-4861(2015)09-1811-09

10.11862/CJIC.2015.244

2015-05-25。收修改稿日期：2015-07-17。

國家自然科學基金(No.20771068，20901048)和高等學校博士學科點專項科研基金(No.20131401110011)資助項目。

＊通訊聯(lián)系人。E-mail：yangbs@sxu.edu.cn，Tel：0351-7016358