韓曉東 周優(yōu)優(yōu) 鄭斯文 李貞 宋智琦

姜黃素對人黑素瘤細胞株A375和C8161細胞AKT/mTOR信號通路的影響

韓曉東 周優(yōu)優(yōu) 鄭斯文 李貞 宋智琦

目的 探討姜黃素對惡性黑素瘤體外抗癌作用的分子機制。方法 體外培養(yǎng)的人黑素瘤細胞株A375和C8161分為實驗組和對照組。實驗組經(jīng)不同濃度姜黃素處理一定時間，對照組采用二甲基亞砜處理。采用噻唑藍法檢測姜黃素對A375和C8161細胞增殖的影響，體外侵襲實驗檢測姜黃素對A375和C8161細胞侵襲的影響，流式細胞儀檢測姜黃素對A375和C8161細胞周期的影響，Western印跡檢測姜黃素對A375和C8161細胞AKT/mTOR信號通路相關(guān)蛋白表達的影響。結(jié)果 噻唑藍法顯示，姜黃素分別在5～15 mg/L和5～10 mg/L濃度時，對A375和C8161細胞抑制作用呈量效關(guān)系；在0～48 h呈時效關(guān)系，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。其24 h的IC50分別為10 mg/L和5 mg/L。體外侵襲試驗顯示，10 mg/L和5 mg/L姜黃素分別作用于A375和C8161細胞72 h，可明顯抑制細胞侵襲（P＜0.001）。流式細胞儀檢測顯示，10 mg/L和5 mg/L姜黃素分別作用于A375和C8161細胞24 h，細胞周期阻滯于G2/M期；A375細胞G2/M期比例為35.00%±3.54%，與對照組120.80%±7.46%相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）；C8161細胞G2/M期比例為19.33%±4.04%，與對照組85.00%±9.53%相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。Western印跡檢測顯示，分別經(jīng)10 mg/L和5 mg/L姜黃素作用于后，A375和C8161細胞AKT/mTOR信號通路相關(guān)蛋白表達水平下降。結(jié)論 姜黃素抑制人黑素瘤細胞株A375和C8161增殖及侵襲機制可能與其誘導細胞周期阻滯及抑制AKT/mTOR信號通路活化有關(guān)。

黑色素瘤，實驗性；姜黃素；細胞增殖；細胞周期；信號傳導

惡性黑素瘤（簡稱惡黑）是一種皮膚惡性腫瘤，以黑素細胞異常增殖并突破基底膜為特征。大部分轉(zhuǎn)移性惡黑對多種化療藥物抵抗［1-2］，患者長期生存率較低［3-4］，因此，治療惡黑是亟待攻克的難題。姜黃素是從草本植物姜黃的根莖中提取出來的一種酚類色素，是姜黃的主要有效成分，具有抗炎、抗氧化及抗腫瘤等作用［5］。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能夠抑制惡黑A375 細胞增殖并誘導細胞凋亡［6］。我們前期［7］研究發(fā)現(xiàn)，谷氨酸受體拮抗劑MK-801及CPCCOEt可誘導人惡黑WM451細胞樹突發(fā)育，使細胞骨架蛋白重組，導致其樹突變細長，呈樹枝狀，接近正常黑素細胞，并可抑制WM451細胞的增殖、侵襲及遷移［7-8］。本研究旨在探討姜黃素對惡黑細胞增殖、侵襲、周期的作用及其相關(guān)機制。

材料與方法

一、材料

細胞系：人惡黑A375和C8161細胞株購自中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所北京協(xié)和醫(yī)學院細胞資源中心。姜黃素（編號A0086，CAS登錄號458-37-7，純度≥98%）購自成都曼斯特生物科技有限公司。二甲基亞砜（DMSO，美國Sigma公司）溶解至濃度為100 g/L于4℃儲存?zhèn)溆?。高糖DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司），胎牛血清（FBS，浙江天杭生物科技有限公司），不含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰蛋白酶（美國 Hyclone公司），噻唑藍（MTT）、TritonX-100（美國Sigma公司），基質(zhì)膠Matrigel（美國BD公司），熒光染料PI（碘化丙錠）、核糖核酸酶RNase（日本 TaKaRa公司）?？?AKT、p-AKT（Ser473）、p-mTOR （Ser2448）、p-P70S6K（Thr389）兔抗（美國Cell Signaling Technology公司）；抗β肌動蛋白鼠抗（美國Sigma公司）。

二、方法

1.細胞培養(yǎng)［9］：A375 與 C8161 細胞均用含 10%胎牛血清的DMEM，常規(guī)37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。姜黃素20mg標準品+200μl二甲基亞砜（DMSO），配置成100mg/L原液。

2.MTT法檢測姜黃素對細胞增殖的影響：方法參照文獻［9］，分實驗組和對照組，每組設(shè)3個復孔。實驗組加入姜黃素原液（100 g/L），終濃度分別為5、10、15、20、25、30、35 mg/L，對照組加等量 DMSO，分別于24、48、72、96 h加入 MTT并于培養(yǎng)箱孵育 4 h，然后加入200 μl DMSO，充分振蕩后用酶標儀檢測490 nm波長下的各孔吸光度值（A）。細胞增殖抑制率（%）=（1-實驗組A值/對照組A值）×100%。

3.體外Matrigel侵襲實驗：參照文獻［9］。用24孔Transwell小室按說明書方法，每組3個復孔。實驗組A375和C8161細胞分別加入含10 mg/L和5 mg/L姜黃素的培養(yǎng)液，姜黃素原液加入量分別為0.01 μl和 0.005 μl，對照組加等量 DMSO，下室按 500 μl/孔加入趨化液（DMEM+10%FBS）。置培養(yǎng)箱中孵育72 h。倒置顯微鏡下觀察穿膜細胞數(shù)，光鏡（×200）下隨機選取5個視野（上、下、左、右、中間）照相、計數(shù)。

4.流式細胞儀檢測細胞周期：將A375與C8161細胞以合適密度接種于6 cm培養(yǎng)皿，經(jīng)10、5 mg/L姜黃素（含姜黃素原液量分別為0.4 μl和0.2 μl）作用24 h，對照組加等量DMSO。用不含EDTA的胰酶消化收集處理后的A375細胞，PBS洗滌，用75%預冷乙醇固定細胞4 h，分別用500 μl配好的染色液含480 μl PBS、5μl PI（5 g/L）、5 μl RNase（10g/L）、10μlTritonX100（10%）重懸，置 37℃30min后流式細胞儀檢測分析周期變化。

5.Western印跡分析：分別用10、5 mg/L姜黃素（含姜黃素原液量分別為 0.4 μl和 0.2 μl） 處理A375與C8161細胞，對照組加等量DMSO，24 h后收集細胞。加入蛋白裂解液于冰上裂解30 min，離心后收集上清液提取細胞總蛋白，考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。方法參照文獻［9］。

結(jié) 果

一、MTT檢測不同濃度姜黃素對A375和C8161細胞增殖的抑制作用

姜黃素能夠抑制A375和C8161細胞增殖（表1，2）。姜黃素分別在5～15 mg/L和5～10 mg/L濃度范圍內(nèi)對A375和C8161細胞活性抑制作用成量效關(guān)系，在0～48 h內(nèi)呈時效關(guān)系，24 h的IC50分別為10 mg/L和5 mg/L，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。

二、體外侵襲實驗和流式細胞儀檢測姜黃素對A375和C8161細胞侵襲及細胞周期的影響

如表3所示，經(jīng)終濃度為10 mg/L（IC50）姜黃素培養(yǎng)液處理A375細胞72 h，實驗組細胞侵襲數(shù)量（35.00±3.54）低于對照組（120.80±7.46），差異有統(tǒng)計學意義（t=23.23，P＜ 0.001）；5 mg/L（IC50）姜黃素培養(yǎng)液處理C8161細胞72 h，實驗組細胞侵襲數(shù)量（19.33±4.04）低于對照組（85.00±9.53），差異有統(tǒng)計學意義（t=10.98，P＜0.001），說明一定濃度的姜黃素能抑制A375細胞（圖1）和C8161細胞（圖2）侵襲。用姜黃素濃度≥15 mg/L處理A375細胞，濃度≥10 mg/L處理C8161細胞，72 h后觀察兩組細胞侵襲情況，均未發(fā)現(xiàn)侵襲細胞。

表1 不同濃度姜黃素在不同時間對A375細胞增殖抑制率（%，±s）

表1 不同濃度姜黃素在不同時間對A375細胞增殖抑制率（%，±s）

注：n=3。二甲基亞砜對照組的抑制率設(shè)為“0”；各濃度組與對照組比較，均P＜0.001

姜黃素（mg/L） 24 h 48 h 72 h 96 h 5 41.39±5.23 61.98±0.75 73.15±0.22 80.79±1.33 10 48.67±2.06 73.87±2.48 83.38±0.31 86.81±0.87 15 53.08±3.44 80.00±1.43 89.67±0.41 91.34±0.61 20 57.83±2.57 83.03±1.28 91.57±0.30 92.85±0.27 25 60.00±2.01 84.00±1.06 91.67±0.25 93.27±0.24 30 61.31±1.16 85.14±0.49 92.60±0.15 93.76±0.19 35 69.32±5.20 88.18±0.65 94.22±0.40 94.97±0.35

表2 不同濃度姜黃素在不同時間對C8161細胞增殖抑制率（%，±s）

表2 不同濃度姜黃素在不同時間對C8161細胞增殖抑制率（%，±s）

注：n=3。二甲基亞砜對照組的抑制率設(shè)為“0”；各濃度組與對照組比較，均P＜0.001

姜黃素（mg/L） 24 h 48 h 72 h 96 h 5 51.35±2.80 79.20±1.42 83.75±2.05 92.43±1.34 10 59.08±2.18 80.76±1.23 89.18±1.57 94.41±0.22 15 62.79±2.13 82.07±1.27 90.82±0.67 94.81±0.35 20 65.53±1.45 88.02±0.78 93.24±0.47 96.03±0.27 25 69.04±0.95 89.00±0.16 93.52±0.40 96.46±0.14 30 71.75±0.93 89.70±0.54 94.18±0.18 96.51±0.56 35 73.71±0.52 90.10±3.19 94.34±0.17 96.99±0.13

表3所示，10 mg/L（IC50）姜黃素處理24 h后誘導A375細胞G2/M期阻滯比例為（48.07±7.09）%，與對照組（21.30±0.75）%相比差異有統(tǒng)計學意義（t=6.50，P＜ 0.01）；5 mg/L（IC50）姜黃素處理 24 h后誘導C8161細胞G2/M期阻滯比例為（33.80±1.25）%，與對照組（25.23±2.31）%相比差異有統(tǒng)計學意義（t=5.65，P＜0.01）；姜黃素組兩個細胞株各自對應的G0/G1細胞比例小于DMSO對照組，說明一定濃度姜黃素處理24 h后，可引起A375細胞（圖3）和C8161細胞（圖4）G2/M期的阻滯。

圖1 10 mg/L（IC50）姜黃素抑制A375細胞侵襲（結(jié)晶紫染色×200）

圖2 5 mg/L（IC50）姜黃素抑制C8161細胞侵襲（結(jié)晶紫染色×200）

圖3 10 mg/L（IC50）姜黃素誘導A375細胞G2/M期阻滯

圖4 5 mg/L（IC50）姜黃素誘導C8161細胞G2/M期阻滯

三、Western印跡檢測姜黃素對A375和C8161細胞AKT/mTOR信號通路活化的抑制作用

采用A375和C8161細胞的IC50（分別為10mg/L和5 mg/L）的姜黃素處理24 h，Western印跡檢測結(jié)果示 A375和 C8161細胞 p-AKT、p-mTOR、pp70S6K蛋白表達水平均下降，總AKT表達不變（圖5），β肌動蛋白為內(nèi)參照。

表3 姜黃素對A375和C8161細胞侵襲的抑制及對周期的阻滯作用

圖5 Western印跡檢測姜黃素對A375和C8161細胞AKT/mTOR信號通路相關(guān)蛋白表達的影響 1：二甲基亞砜；2：10 mg/L（IC50）姜黃素；3：5 mg/L（IC50）姜黃素。β 肌動蛋白為內(nèi)參照

討 論

惡黑對常規(guī)化療不敏感，易產(chǎn)生耐藥且藥物毒副作用大，導致其療效不佳。越來越多天然或植物來源且毒副作用小的藥物，如，姜黃素，被用作化療輔助藥物［10］。細胞運動能力與PI3K/AKT信號通路活化有關(guān)。異?；罨腜I3K/AKT信號通路能激活其下游分子mTOR［11］，mTOR隨后活化其下游分子p70S6K，p70S6K的活化能促進肌動蛋白細絲重構(gòu)，進而促進細胞運動［12］。我們通過Transwell侵襲實驗研究顯示，姜黃素可顯著抑制惡黑細胞侵襲。此外，我們用Western印跡檢測發(fā)現(xiàn)姜黃素能顯著下調(diào)AKT、mTOR、p70S6K蛋白的磷酸化水平，而對AKT總蛋白水平無影響。由此，我們推測姜黃素可能是通過抑制PI3K/AKT信號通路活化從而抑制細胞肌動蛋白細絲重構(gòu)并進而抑制惡黑細胞侵襲。

細胞的增殖、凋亡均是細胞周期依賴性的，細胞周期的失控是腫瘤發(fā)病中極其重要的環(huán)節(jié)。細胞周期素（cyclin）及周期素依賴性激酶（cyclindependent kinases，CDK）是細胞周期的重要調(diào)節(jié)因子。有研究顯示，姜黃素可通過上調(diào)p53、p21、p27和 CHK2），誘導惡黑細胞凋亡和 G2/M 期阻滯［13］。另有研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素類似物D6能夠下調(diào)細胞周期蛋白 cyclin B1、cyclin F、cdc25B 和 CDK4 的表達，導致惡黑細胞G2/M期阻滯，進而抑制惡黑細胞增殖［14］。本研究通過流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，姜黃素能夠誘導惡黑A375及C8161細胞周期明顯阻滯于G2/M期，遺憾的是未對其機制進行深入探討。

PI3K/AKT/mTOR信號通路在包括惡黑在內(nèi)的多種腫瘤中呈活化狀態(tài)，且與腫瘤發(fā)生有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素類似物D6可抑制黑素瘤細胞增殖和誘導細胞凋亡，其機制是抑制PI3K/AKT信號通路的活化［14］。為了闡明姜黃素是否可通過影響PI3K/AKT/mTOR信號通路來影響惡黑，我們采用Western印跡檢測發(fā)現(xiàn)，姜黃素能顯著下調(diào)AKT、mTOR、P70S6K蛋白的磷酸化水平，而對AKT總蛋白無影響。我們推測，對PI3K/AKT/mTOR信號通路活化的抑制可能是姜黃素抑制惡黑進展的機制之一。

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2014-07-02）

（本文編輯：吳曉初）

Effects of curcumin on the AKT/mTOR signaling pathway in human melanoma cell lines A375 and C8161

Han Xiaodong,Zhou Youyou,Zheng Siwen,Li Zhen,Song Zhiqi.Department of Dermatology,First Affiliated Hospital of Dalian Medical University,Dalian 116011,China

Song Zhiqi,Email：szqdalian@163.com

ObjectiveTo explore molecular mechanisms underlying thein vitrocounteracting effect of curcumin on malignant melanoma.MethodsCultured A375 and C8161 human melanoma cells were cultivatedin vitro,and randomly divided into several test groups and a control group to be treated with different concentrations of curcumin and dimethylsulfoxiderespectivelyfordifferentdurations.Then,methylthiazolyltetrazolium（MTT）assay,Transwellassay,flow cytometryandWesternblotwere performedto evaluate the effectofcurcuminonthe proliferation,invasionandcellcycle of,as well as expressions of AKT/mTOR signaling pathway-related proteins in A375 and C8161 cells respectively.Statistical analysiswascarriedoutbyusingttest.ResultsMTTassayshowedthatthetreatmentwithcurcuminof5－35mg/Lfor24－96 hours significantly inhibited the proliferation of both A375 and C8161 cells compared with that with dimethyl sulfoxide（allP＜0.001）,andthe inhibitoryeffectwasina dose-dependentmannerwithinthe range of5－15mg/LforA375cellsand within the range of 5－10 mg/L for C8161 cells,and in a time-dependent manner from 0 to 48 hours for both cells.After treatmentfor24hours,the50%inhibitoryconcentration（IC50）ofcurcuminagainstA375cellsandC8161cellswas10mg/L and 5 mg/L respectively.Transwell assay demonstrated that the invasion of A375 and C8161 cells was significantly suppressed by 72-hour treatment with curcumin at 10 mg/L and 5 mg/L respectively （bothP＜0.001）.Flow cytometry showed that the cell cycle of A375 and C8161 cells was arrested at G2/M phase after 24-hour treatment with curcumin at 10 mg/Land5mg/Lrespectively,withsignificantdifferences in the proportion of A375 cells and C8161 cells in G2/M phase between the test group and control group （A375 cells：35.00% ±3.54%vs.120.80% ±7.46%,P＜0.001;C8161 cells：19.33% ±4.04%vs.85.00% ±9.53%,P＜0.001）.Western blot revealed that the expressions of AKT/mTOR signaling pathway-related proteins were decreased in A375 and C8161 cells after 24-hour treatment with 10 mg/L and 5 mg/L curcumin respectively.ConclusionCurcumin can inhibit the proliferation and invasion of A375 and C8161 cells,likely byblockingcellcycleandinhibitingactivationoftheAKT/mTORsignalingpathway.

Melanoma,experimental;Curcumin;Cell proliferation;Cell cycle;Signal transduction

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.06.004

國家自然科學基金（81472865、81171491）；遼寧省自然科學基金（201102056、2014023005）

116011大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院皮膚科

宋智琦，Email：szqdalian@163.com