何慶元，向仕華，吳 萍，王松華，李正鵬，祝嫦巍，張曉紅

(1.安徽科技學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽 233100;2.自貢市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，四川 自貢 643000）

世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展所面臨的重要難題之一是土壤鹽漬化，世界灌溉地鹽堿化的面積達(dá)1/3左右[1]，占可耕土壤的26%[2]。在我國大豆主產(chǎn)區(qū)(東北生態(tài)區(qū))土壤鹽堿化也十分嚴(yán)重[3]。栽培大豆雖然具有一定的耐鹽能力，但在鹽漬脅迫下，往往導(dǎo)致產(chǎn)量減少，品質(zhì)降低[4]。

大豆的耐鹽機(jī)理復(fù)雜，主要包括泌鹽、大分子物質(zhì)調(diào)節(jié)、離子攝入和區(qū)域化以及酶消除脅迫毒害等。已有的研究表明高鹽離子濃度能夠降低植物水分吸收的能力，Na+通過未知的受體作用，促使活性氧(ROS)分子，如過氧化氫(H2O2)、超氧陰離子(O2.ˉ－)和羥自由基(HO·)等在細(xì)胞質(zhì)中大量累積，最終作用到細(xì)胞核的組氨酸激酶受體蛋白(HKT)，對植物造成次級氧化脅迫，損傷膜脂、蛋白質(zhì)和核酸等，改變細(xì)胞代謝，引起對植物的傷害[5－6]。植物為減輕活性氧對胞內(nèi)生物大分子和細(xì)胞膜的傷害，最為重要的一類調(diào)節(jié)途徑是利用保護(hù)酶系統(tǒng)，包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)等清除活性氧，從而降低鹽脅迫引起的植物傷害作用[7－8]。適量的ROS能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生對生物和非生物脅迫的保護(hù)機(jī)制，但過高濃度的ROS導(dǎo)致過度的保護(hù)，最終造成對細(xì)胞的損傷[9]。本研究分析不同濃度NaCl脅迫對大豆同工酶的影響，為探討大豆對鹽脅迫的響應(yīng)機(jī)理奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試大豆為“南農(nóng)1138－2”，是奉賢穗稻黃單株選擇獲得的品系，具有高產(chǎn)、廣泛的生態(tài)和地區(qū)適應(yīng)性、綜合性狀優(yōu)良特點(diǎn)，利用該祖先親本育成或衍生了至少45個(gè)品種[10]。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

分別選取籽粒飽滿的大豆種子，播種于裝有蛭石的花盆中，置于溫室大棚中，自然光照，待長出真葉后，選取長勢一致的幼苗轉(zhuǎn)至1/2 Hoagland營養(yǎng)液(pH 5.8)中培養(yǎng)至V2期[11]后，用NaCl脅迫處理。實(shí)驗(yàn)設(shè)置5 處理，分別為在 1/2 Hoagland 中分別添加至含 0.000mol/L、0.050 mol/L、0.075 mol/L、0.100 mol/L、0.125 mol/L濃度的NaCl，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1盆，每盆8株。

1.3 測定項(xiàng)目與方法

處理前后以子葉節(jié)為分界點(diǎn)，分別測量根長和莖長，根相對生長速率=(處理后根長－處理前根長)/(處理前根長*處理天數(shù))，莖相對生長速率=(處理后莖長－處理前莖長)/(處理前莖長*處理天數(shù))。

培養(yǎng)至V3期，分別采集各株倒二葉(完全展開的復(fù)葉)的中間小葉，重復(fù)內(nèi)8株混合取樣，每重復(fù)取0.30 g，立即用預(yù)冷的0.20 mol/L的磷酸緩沖液(pH7.8)按料:液=1∶3，充分研磨至均漿，全部轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃ 10000 rpm離心20 min，取上清液，作為待測粗酶液。

酶活性測定:用考馬斯亮藍(lán)(G250)法測定可溶性蛋白含量[12]、用愈創(chuàng)木酚法測定POD活性[12]、用鄰苯三酚自氧化速率法測定SOD活性[13]和用紫外吸收法測定CAT活性[12]。酶的活力單位用比活力單位即單位可溶性蛋白在每分鐘吸光度的變化值，即:ΔA/(min·mg)。

同工酶電泳:3種同工酶都采用Tris－HCl緩沖體系，濃縮膠濃度為4%，分離膠為7%。POD和SOD以30V電泳7－8 h，至溴酚藍(lán)至膠底端為止;CAT一直用30V電泳9 h。POD同工酶用聯(lián)苯胺染色法[14]，SOD同工酶用氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)法[15]，CAT同工酶用改良的鐵染色法[16]。

以子葉節(jié)為界剪斷成為根和地上部分，經(jīng)105℃殺青10 min，80℃烘干至恒重后分別稱取根和地上部分干重。根冠比=根干重/地上干重。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)用Excel 2003和SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對大豆生長的影響

表1 不同濃度NaCl處理下大豆的根、莖相對生長速率，根和地上部分干重及根冠比Table 1 Soybean’s relative growth rate of root and stem，dry weight of root and aerial part，root/shoot ratio in different NaCl treatments

從表1可知，隨NaCl濃度的升高，根和莖的相對生長速率降低，根和地上部分的干重減少，在沒有NaCl脅迫下，生長最好。并且當(dāng)溶液中NaCl濃度為0.050 mol/L時(shí)，根和莖的相對生長速率以及根干重都沒用顯著的差異，但地上干重顯著減少。當(dāng)溶液中NaCl濃度達(dá)到0.075 mol/L時(shí)，相對生長速率受到顯著抑制，生物量顯著減少。當(dāng)溶液中NaCl濃度高于0.075 mol/L后，大豆根冠比顯著增加，但當(dāng)溶液中NaCl濃度達(dá)到0.125 mol/L后，根冠比和對照沒有差異，這可能是因?yàn)樵谝欢舛鹊腘aCl脅迫下，根的生長比地上部分要多，以期適應(yīng)脅迫環(huán)境，但過高的NaCl濃度嚴(yán)重抑制了根和莖的生長，導(dǎo)致根冠比降低。

2.2 鹽脅迫對大豆POD、SOD和CAT同工酶活性影響

表2 不同NaCl處理下大豆的POD、SOD和CAT活性Table 2 Activities of POD，SOD and CAT enzyme of soybean in different NaCl treatments

從表2可知，POD、SOD和CAT活性在不同濃度NaCl脅迫下表現(xiàn)為先升高，后降低，當(dāng)NaCl濃度為0.050 mol/L時(shí)，雖然有一定的增加，但沒有顯著性差異。但當(dāng)NaCl濃度達(dá)到0.075 mol/L及以上時(shí)，3種酶的活性都顯著降低，并且隨NaCl濃度的增加，酶活性進(jìn)一步降低。這可能是在低濃度NaCl下，大豆通過激活了抗氧化酶系統(tǒng)活性，分解鹽脅迫所產(chǎn)生的活性氧(ROS)分子，但過高濃度的NaCl導(dǎo)致抗氧化酶系統(tǒng)過度應(yīng)急，細(xì)胞膜等的損傷，最終酶活性降低。

2.3 鹽脅迫對大豆POD、SOD和CAT同工酶譜的影響

從圖1可以看出在NaCl脅迫下大豆葉片中POD、SOD和CAT同工酶譜分別有8、6和1條酶帶。其中POD酶譜的POD－1到POD－6在5個(gè)處理中都有酶帶，只有在NaCl濃度在0.075 mol/L時(shí)具有所有的酶帶，在0.100 mol/L時(shí)具有POD－8酶帶。這表明當(dāng)NaCl濃度增加到一定濃度時(shí)，會(huì)產(chǎn)生新的POD同工酶，但過高的NaCl濃度導(dǎo)致新產(chǎn)生的POD同工酶不表達(dá)。SOD酶譜在NaCl濃度從0.000到0.100 mol/L的4個(gè)處理都沒有變化，當(dāng)NaCl濃度達(dá)到0.125 mol/L時(shí)，檢測不到SOD－3和SOD－5兩條酶帶，過高濃度的NaCl導(dǎo)致部分SOD同工酶不表達(dá)。CAT酶譜在5個(gè)處理都只有一個(gè)相同的酶帶，酶譜沒有差異。

3 討論

Na+和Cl－是競爭性選擇吸收離子，植物會(huì)優(yōu)先吸收Na+和Cl－導(dǎo)致其他營養(yǎng)物質(zhì)吸收減少[17]，在NaCl脅迫下植物細(xì)胞液泡中的H+和環(huán)境中的Na+發(fā)生交換進(jìn)入植物細(xì)胞質(zhì)中，過多的Na+和Cl－對植物產(chǎn)生毒害，導(dǎo)致作物產(chǎn)量和品質(zhì)的降低。植物在一定濃度的Na+刺激下，能夠激活一些抗氧化酶基因的表達(dá)[5]，緩解ROS等的危害，但過量的ROS攻擊蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等生物大分子，使它們氧化降解，最終導(dǎo)致酶失活，增大生物膜透性[18]。植物的抗氧化酶系統(tǒng)具有一定的清除過量ROS能力[19]。本研究表明低濃度(0.050 mmol/L)的NaCl脅迫能夠增強(qiáng)抗氧化酶活性，但NaCl增加到一定濃度后，可能是抗氧化酶的過度應(yīng)急，最終導(dǎo)致活性降低，和前人研究的結(jié)果較為一致。

同工酶是指一組能催化相同的化學(xué)反應(yīng)，但其蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)等存在明顯差異的酶。植物在鹽脅迫下同工酶的種類也會(huì)產(chǎn)生一定的改變[20]。南農(nóng)1138－2是基因型高度單一純合的地方品種，同工酶表達(dá)的差異是相關(guān)基因受到鹽脅迫誘導(dǎo)所致。本研究中POD和SOD同工酶在NaCl脅迫后譜帶產(chǎn)生了一定的變化，可能是在一定濃度NaCl誘導(dǎo)下，植物為緩解鹽脅迫，產(chǎn)生了新的同工酶，但過高的濃度，致使這些種類的同工酶表達(dá)受到損傷，最終不表達(dá)。然而，酶譜差異的表達(dá)還需要進(jìn)行進(jìn)一步的深入研究。

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