祝偉霞，楊冀州，郭慧領(lǐng)，張 莉，王彩娟，張 麗

(河南出入境檢驗(yàn)檢疫局，河南 鄭州 450003)

β受體激動(dòng)劑是天然兒茶酚胺類化學(xué)合成的衍生物，具有苯乙醇胺結(jié)構(gòu)母核，因結(jié)構(gòu)中含有堿性β-羥胺側(cè)鏈，可與細(xì)胞膜的β-受體結(jié)合而得名，臨床主要用于治療哮喘、肺炎、休克等疾病［1］。在畜牧養(yǎng)殖生產(chǎn)中，β受體激動(dòng)劑類藥物常被非法添加到飼料中以提高動(dòng)物生長(zhǎng)率和瘦肉率［2］，人類長(zhǎng)期亞劑量食用β受體激動(dòng)劑污染的食品易導(dǎo)致人體器官中毒［3］。農(nóng)業(yè)部196號(hào)和235號(hào)公告均禁止β受體激動(dòng)劑作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑用于畜牧業(yè)，為了逃避政府部門監(jiān)管，不法商家合成新的苯乙醇胺類替代物用于養(yǎng)殖過(guò)程，因此建立一種β受體激動(dòng)劑多殘留的分析方法對(duì)于獸藥殘留監(jiān)管具有重要意義。

目前，β受體激動(dòng)劑的多殘留檢測(cè)常采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)［4］、氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法(GCMS)［5］、液相色譜 － 串聯(lián)質(zhì)譜法(LC － MS/MS)［6－8］和液相色譜 － 高分辨質(zhì)譜法(LC －TOF)［9］等。LC －MS/MS 和 LC － TOF 技術(shù)是目前測(cè)定飼料［10］、尿液［11－12］、動(dòng)物組織［13－14］和污水［15］等樣品的主要分析方法，樣品前處理采用傳統(tǒng)的離線固相萃取(SPE)法，而離線SPE需要多步驟的溶劑轉(zhuǎn)移和濃縮，實(shí)驗(yàn)操作繁瑣。近年來(lái)研究者開始采用在線SPE技術(shù)凈化樣品中β受體激動(dòng)劑類藥物［16］，但未見(jiàn)有關(guān)全自動(dòng)在線固相萃取聯(lián)用質(zhì)譜技術(shù)分析尿液中16種β受體激動(dòng)劑的報(bào)道。本方法采用在線陽(yáng)離子渦流固相萃取柱凈化，通過(guò)對(duì)凈化、色譜分離和基質(zhì)效應(yīng)等條件的優(yōu)化，建立了豬尿液中16種β受體激動(dòng)劑的陽(yáng)離子渦流在線固相萃取/液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜全自動(dòng)分析的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

TranscendTM在線凈化液相色譜TSQ Ultra串聯(lián)四極桿分析系統(tǒng)(美國(guó)Thermo Fisher公司);16種β受體激動(dòng)劑標(biāo)準(zhǔn)品(純度均≥95%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司);β葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶(德國(guó)Merck公司);甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、甲酸(色譜純，美國(guó)Fisher公司);甲酸銨(美國(guó)Sigma－Aldrich公司);其它試劑均為市售分析純;實(shí)驗(yàn)用水為Millipore純水系統(tǒng)制備的高純水(≥18 MΩ·cm)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取純度折算為100%的β受體激動(dòng)劑標(biāo)準(zhǔn)品各20.0 mg，以甲醇溶解并定容于100 mL容量瓶中，配成質(zhì)量濃度為200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于－18℃下保存;分別吸取500 μL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，于0～4℃下保存。取適量的標(biāo)準(zhǔn)混合液添加陰性豬尿液按本方法進(jìn)行分析，制得基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 TurboFlow在線凈化與LC－MS/MS條件

TurboFlow凈化色譜柱為MCXTM(50 mm×0.5 mm);進(jìn)樣量為100 μL;TurboFlow上樣泵流動(dòng)相:水(A1)、氨水甲醇(B1)、乙腈－異丙醇－丙酮(4∶4∶2，C1)。液相分離色譜柱為SHISEIDO CAPCELL MGⅡ(150 mm ×2.0 mm，3.0 μm);進(jìn)樣量為50 μL，流動(dòng)相為0.1%甲酸甲醇(A2)、0.1%甲酸溶液中含5 mmol/L甲酸銨(B2)，在線凈化和液相梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 16種β受體激動(dòng)劑的在線凈化與液相色譜洗脫程序Table 1 Online MCX SPE and HPLC elution program of 16 β-agonists

質(zhì)譜條件:電噴霧正離子模式下離子化(ESI+)，蒸發(fā)溫度為300℃，毛細(xì)管溫度為350℃，噴霧電壓為3 500 V，鞘氣壓力為40 psi，輔助氣壓力為15 psi，檢測(cè)模式為選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(SRM)，檢測(cè)離子對(duì)、碰撞能量(CE)、聚焦電壓(Tublens)等質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 16種β受體激動(dòng)劑的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass parameters of 16 β-agonists

1.4 樣品前處理

量取5 mL尿液，加入4 mL 20 mmol/L乙酸銨溶液，用乙酸調(diào)至pH 5.2，加入50 μL β葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶液，用乙酸銨定容至10 mL，于37℃下酶解過(guò)夜，取出后于4 000 r/min離心5 min，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后，進(jìn)行Online－MCX－SPE和LC－MS/MS全自動(dòng)測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶解提取條件的優(yōu)化

16種β受體激動(dòng)劑按苯環(huán)上取代基的差異可分為苯胺與苯酚兩種類型，其中克倫特羅、馬布特羅、西馬特羅等苯胺型激動(dòng)劑在動(dòng)物體內(nèi)主要發(fā)生氧化代謝作用，軛合反應(yīng)率低。但非諾特羅、萊克多巴胺、沙丁胺、特布他林等苯酚型化合物在生物酶的作用下易生成各種軛合物。研究表明，尿液中以軛合物代謝的苯酚型β受體激動(dòng)劑殘留物≥50%［12］，因此苯酚型化合物測(cè)定前常需要酶解。本方法對(duì)比了豬尿液(萊克多巴胺和克倫特羅陽(yáng)性)分別在不酶解與酶解的測(cè)定結(jié)果，結(jié)果表明，在不酶解時(shí)萊克多巴胺的測(cè)定值為3.4 μg/L，克倫特羅為3.8 μg/L，而酶解后萊克多巴胺測(cè)定值為18.2 μg/L，克倫特羅為4.1 μg/L。為同時(shí)測(cè)定豬尿液中16種β受體激動(dòng)劑殘留，本實(shí)驗(yàn)選擇將豬尿液在37℃酶解過(guò)夜后測(cè)定。

2.2 在線固相萃取條件的優(yōu)化

β受體激動(dòng)劑結(jié)構(gòu)中含有苯胺和苯酚的氮堿性中心，屬中等極性的疏水物質(zhì)，在酸性條件下呈陽(yáng)離子特征，離線SPE方法常采用反相C18和MCX柱凈化。為了建立在線SPE前處理方法，本文考察了5種TurboFlow在線凈化柱的效果，包括反相(Cyclone，Cyclone－p，C18，C18－P)以及陽(yáng)離子交換MCX柱，結(jié)果表明，異丙喘寧、沙丁胺醇、齊帕特羅、特布他林和西馬特羅5種分析物極性強(qiáng)，在Cyclone，Cyclone－p，C18，C18－P柱中富集性差，相對(duì)回收率在6.7% ～71.5%之間;而MCX柱是基于尺寸排阻、反相和離子交換等多種混合保留機(jī)理的凈化柱，16種分析物在此柱上的回收率均不低于76.2%，因此本方法選擇MCX柱為在線凈化柱。

方法優(yōu)化了不同淋洗強(qiáng)度對(duì)于待測(cè)物的影響，分別將5%氨化甲醇與水的體積比設(shè)為0∶10，2∶8，4∶6，5∶5，6∶4，7∶3，8∶2，9∶1，10∶0進(jìn)行洗脫，16種β受體激動(dòng)劑的回收率結(jié)果顯示，淋洗強(qiáng)度對(duì)妥布特羅、克倫特羅、溴代克倫特羅、馬賁特羅、苯乙醇胺A、溴布特羅7種化合物的影響顯著，當(dāng)氨化甲醇比例增至90%時(shí)，16種分析物的回收率不低于85.7%，因此本方法選用5%氨水甲醇水(體積比，9∶1)作為洗脫溶劑。

為了增加分析物洗脫的選擇性，實(shí)驗(yàn)對(duì)洗脫流速(10，20，30，50，80，100，150 μL/min)進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，10 μL/min和20 μL/min流速不利于化物洗脫，流速在30～80 μL/min范圍時(shí)，待測(cè)物的響應(yīng)信號(hào)隨流速的增加呈線性增加，80 μL/min后增幅減少。由于在該洗脫模式時(shí)，凈化泵和液相色譜泵串聯(lián)，為了減少色譜柱的承受壓力，在保證16種分析物洗脫完全的條件下，本方法選用80 μL/min為洗脫流速。

2.3 色譜分離的優(yōu)化

β受體激動(dòng)劑類化合物具有疏水的飽和烴鏈，屬堿性或酸堿兩性物質(zhì)，因此在反相色譜柱上的保留性弱。為增加化合物的保留行為，實(shí)驗(yàn)對(duì)比了CAPCELL MGⅡ柱和Sunshell C18兩種色譜柱的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn):Sunshell C18柱分析異丙喘寧時(shí)呈雙色譜峰，西馬特羅、特布他林和齊帕特羅3種物質(zhì)峰形展寬;而采用CAPCELL MGⅡ柱分析時(shí)16種化合物均得到較好的保留。因此，方法選用CAPCELL MGⅡ柱進(jìn)行分離。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的影響

實(shí)驗(yàn)以50 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液作為對(duì)照，比較了豬尿液加標(biāo)(50 ng/mL)后直接測(cè)定、經(jīng)TurboFlow凈化分析的相對(duì)回收率。測(cè)定結(jié)果表明，豬尿液未經(jīng)凈化直接分析時(shí)的質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度降低了42.1%～91.3%，其中對(duì)異丙喘寧、沙丁胺醇和克倫特羅的質(zhì)譜響應(yīng)值分別降低91.3%，81.4%和88.7%。而經(jīng)TurboFlow在線凈化后，基質(zhì)效應(yīng)明顯降低，而質(zhì)譜響應(yīng)值僅降低6.4%～17.2%。因此方法采用TurboFlow在線凈化來(lái)有效降低基質(zhì)干擾，并且采用基質(zhì)匹配校正曲線進(jìn)行定量分析。

2.5 靈敏度、線性范圍及回收率

向陰性豬尿液中添加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按本方法進(jìn)行測(cè)定，以信噪比S/N≥3為方法檢出限(LOD)，S/N≥10為定量下限(LOQ)，16種 β受體激動(dòng)劑的 LOD為0.01～0.025 μg/L，LOQ為0.025～0.10 μg/L。在0.01～50 μg/L濃度范圍內(nèi)，分析物的質(zhì)量濃度(X，μg/L)與對(duì)應(yīng)峰面積(Y)呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r2)≥0.998 3(見(jiàn)表3)。

采用陰性豬尿液在LOQ，2LOQ和4LOQ水平進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，色譜圖如圖1所示，每個(gè)水平平行測(cè)定10次，結(jié)果如表3所示。16種分析物的回收率為62.4%～117.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.9%～16.3%。

表3 方法的驗(yàn)證數(shù)據(jù)Table 3 The validated data of method

圖1 豬尿液在定量下限水平的加標(biāo)回收色譜圖Fig.1 Chromatograms of 16 β-agonists spiking at LOQ level in pig urine

2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定

為驗(yàn)證該方法的有效性，實(shí)驗(yàn)共收集了213個(gè)供港活豬尿樣進(jìn)行分析。在優(yōu)化條件下，根據(jù)保留時(shí)間和特征離子碎片對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行確證分析，經(jīng)基質(zhì)匹配校正曲線定量，檢測(cè)結(jié)果均為陰性。本方法的測(cè)定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)方法［17－18］的測(cè)定結(jié)果一致。

3 結(jié)論

本方法采用Online－MCX－TurboFlow在線凈化，液相色譜分離，串聯(lián)四極桿質(zhì)譜在電噴霧模式下檢測(cè)，建立了豬尿液中16種β受體激動(dòng)劑的在線全自動(dòng)分析方法。與標(biāo)準(zhǔn)方法相比，本方法減少了離線的手工操作，降低了操作人員的勞動(dòng)強(qiáng)度，減弱了基質(zhì)效應(yīng)。方法學(xué)驗(yàn)證和實(shí)際樣品分析表明，該方法的靈敏度高、準(zhǔn)確度好、操作簡(jiǎn)便，可用于實(shí)驗(yàn)室批量豬尿液中16種β受體激動(dòng)劑殘留的快速測(cè)定和確證。

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